專利名稱：一種黃河鲇三倍體的誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚類多倍體的誘導(dǎo)方法，特別是一種黃河鲇三倍體的誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
黃河鲇(Silurusasotus)隸屬鲇形目(Siluriformes)、鲇科(Siluridae)、鲇屬(Silurus)，是我國黃河流域分布廣泛的一種優(yōu)良淡水經(jīng)濟(jì)魚類。其肉嫩味美，不具肌間刺，營養(yǎng)價(jià)值高，易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖。染色體組操作在魚類育種中占有重要地位。二十世紀(jì)后期，國內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，因而以提高養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量和質(zhì)量為主要目的的染色體操作已成 為魚類育種的熱點(diǎn)。所謂染色體操作是通過物理或化學(xué)方法改變生物體內(nèi)的染色體組成的一種生物技術(shù)。多倍體(polyploid)系指生物體體細(xì)胞中含有超過2個(gè)染色體組的個(gè)體。相對于二倍體，多倍體含有3個(gè)、4個(gè)或更多的染色體組，而依次被稱為三倍體(triploid)、四倍體(tetroploid)和五倍體(pentaploid)等。在水產(chǎn)動物中現(xiàn)在研究最多的是三倍體。多倍體是由于細(xì)胞內(nèi)染色體加倍而形成的，染色體加倍則通過卵子第二極體的保留或受精卵早期有絲分裂的抑制而實(shí)現(xiàn)。根據(jù)魚類受精細(xì)胞學(xué)的研究，精子入卵的時(shí)間是在第二次成熟分裂的中期，受精后排出第二極體。如果卵子受精后不排出第二極體，即它們不經(jīng)過正常的減數(shù)分裂，形成了二倍體卵核，與單倍體精核結(jié)合后，就形成了三倍體。三倍體魚主要有以下優(yōu)勢多倍體魚類具有比較強(qiáng)的生活力、適應(yīng)性和生長勢；三倍體魚類還具有抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)；另外，三倍體魚類是不育的，除了能提高生長速度外，對種質(zhì)資源的保護(hù)也有重要意義，不至于因逃逸對野生資源造成遺傳混雜。
目前三倍體的誘導(dǎo)方法有以下幾種化學(xué)誘導(dǎo)三倍體的方法目前主要的化學(xué)誘導(dǎo)劑有細(xì)胞松弛素B( CB)、6_ 二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、咖啡因、秋水仙素和聚乙二醇(PEG)等。其缺點(diǎn)是成功率低；試驗(yàn)材料(受精卵)能用于試驗(yàn)處理的數(shù)量也受到限制；有些誘導(dǎo)劑毒性較大，有致癌性，難溶于水，且價(jià)格昂貴。物理誘導(dǎo)三倍體方法主要有溫度休克法、靜水壓法、電融合法和高鹽高堿法等。溫度休克法和靜水壓法較常用而且效果較好。溫度休克處理誘導(dǎo)率低，且死亡率較高；靜水壓處理需要專門設(shè)備，成本較高，樣本容量有限。生物學(xué)誘導(dǎo)三倍體方法可以分為遠(yuǎn)緣雜交、核移植、細(xì)胞融合等3種。文獻(xiàn)報(bào)道較多的是雜交，尤其是種間雜交的方法。周期較長、誘導(dǎo)率較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種誘導(dǎo)黃河鲇三倍體簡單、易操作、不需要專用設(shè)備和誘導(dǎo)成功率高、周期短的一種黃河鲇三倍體的誘導(dǎo)方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是，一種黃河鲇三倍體的誘導(dǎo)方法，其特征在于有以下步驟
(I)人工催產(chǎn)用量為5000IU/kg鲇體的絨毛膜促性腺激素和25ug/kg鲇體的人工合成促黃體素釋放激素對黃河雌鲇親魚進(jìn)行催產(chǎn)，對黃河雄鲇親魚的催產(chǎn)用量為上述雌鲇用量的一半，上述催產(chǎn)均為一次性注射，催產(chǎn)后放入21 — 30 °C曝氣自來水中培育，效應(yīng)時(shí)間為 8—12h ；
(2)人工受精待黃河鲇親魚發(fā)情時(shí)，將親魚撈起，擦干體表，擠出雌鲇卵子于干凈碗中，同時(shí)用吸管吸出雄鲇精液，逐滴滴加于卵子之上，然后迅速加入水溫為25°C的曝氣自來水中，攪拌均勻，使精卵充分結(jié)合；
(3)三倍體誘導(dǎo)用濃度為25mg/kg的秋水仙素，對上述受精卵進(jìn)行處理
秋水仙素開始處理的時(shí)間為3 —15分鐘，持續(xù)時(shí)間為25—35分鐘，得到三倍體黃河鲇。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較具有方法簡單、容易操作、不需要專用設(shè)備和誘導(dǎo)成功率高、周期短的顯著優(yōu)點(diǎn)。



圖I是本發(fā)明黃河鲇三倍體誘導(dǎo)方法流程方框圖。具體實(shí)施方法
結(jié)合上述流程方框圖對本發(fā)明作詳細(xì)描述，本發(fā)明有以下步驟
(1)人工催產(chǎn)對黃河鲇親魚采用絨毛膜促性腺激素(HCG)和促黃體素釋放激素或其類似物(LRH-A)進(jìn)行催產(chǎn)。雌鲇劑量為HCG 5000 IU* kg ^+LRH-A 25 gg^kg-1，雄鲇劑量減半，均一次性注射，催產(chǎn)后放入30 °C曝氣自來水中培育，效應(yīng)時(shí)間10 h左右；
(2)人工受精待黃河鲇親魚發(fā)情時(shí)，將親魚撈起，擦干體表，擠出雌鲇卵子于干凈碗中，同時(shí)用吸管吸出雄鲇精液，逐滴滴加于卵子之上，然后迅速加入水溫25°C的曝氣自來水，攪拌均勻，使精卵充分結(jié)合；
(3)三倍體誘導(dǎo)
A.秋水仙素的使用劑量25mg/L
B.秋水仙素開始處理的時(shí)間
精卵結(jié)合后，設(shè)計(jì)5 min、15 min、25 min、35 min 4種秋水仙素浸泡起始時(shí)間，持續(xù)浸泡30 min,以確定最佳秋水仙素浸泡起始時(shí)間。
起始時(shí)間(min) I存活率(％) I畸形率(％) _
5~ 19. I32.2
15~ 11.357.0
25~ 12.341.8
35~9.861. 3
O (對照組)170. 413. I—根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，受精后5min開始進(jìn)行秋水仙素處理，誘導(dǎo)效果最佳，存活率最高，達(dá)到19. 1%。C.秋水仙素處理的持續(xù)時(shí)間
在受精后5 min，分別采用秋水仙素持續(xù)浸泡處理10 min、20 min、30 min、40 min 4種組合，做為秋水仙素浸泡持續(xù)處理時(shí)間，以確定秋水仙素浸泡處理最佳持續(xù)時(shí)間。
處理時(shí)間(min) I存活率(％)I畸形率(％)—
10~9.858. 3
20~8. 742.8
30— 17.430.4
40— 10.237.8
O(對照組)|69· 2\2. 3—根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用秋水仙素處理30min,誘導(dǎo)效果最佳,存活率最聞，達(dá)到17.4%。倍性檢測用染色體制片法檢測誘導(dǎo)黃河鲇魚的倍性，三倍體黃河鲇誘導(dǎo)率達(dá)到19. 1%。
本發(fā)明技術(shù)方案帶來的有益效果
提供了一種誘導(dǎo)黃河鲇三倍體簡單、易操作的方法，誘導(dǎo)率高、周期短，適宜批量進(jìn)行，易于大規(guī)模推廣。
權(quán)利要求
1.一種黃河鲇三倍體的誘導(dǎo)方法，其特征在于有以下步驟 (1)人工催產(chǎn)用量為5000IU/kg鲇體的絨毛膜促性腺激素和25ug/kg鲇體的人工合成促黃體素釋放激素對黃河雌鲇親魚進(jìn)行催產(chǎn)，對黃河雄鲇親魚的催產(chǎn)用量為上述雌鲇用量的一半，上述催產(chǎn)均為一次性注射，催產(chǎn)后放入21 — 30 °C曝氣自來水中培育，效應(yīng)時(shí)間為 8—12h ； (2)人工受精待黃河鲇親魚發(fā)情時(shí)，將親魚撈起，擦干體表，擠出雌鲇卵子于干凈碗中，同時(shí)用吸管吸出雄鲇精液，逐滴滴加于卵子之上，然后迅速加入水溫為25°C的曝氣自來水中，攪拌均勻，使精卵充分結(jié)合； (3)三倍體誘導(dǎo)用濃度為25mg/kg的秋水仙素，對上述受精卵進(jìn)行處理 秋水仙素開始處理的時(shí)間為3 —15分鐘，持續(xù)時(shí)間為25—35分鐘，得到三倍體黃河鲇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃河鲇三倍體的誘導(dǎo)方法，(1)人工催產(chǎn)用量為5000IU/kg鲇體的絨毛膜促性腺激素和25ug/kg鲇體的人工合成促黃體素釋放激素對黃河雌鲇親魚進(jìn)行催產(chǎn)，對黃河雄鲇親魚的催產(chǎn)用量為上述雌鲇用量的一半，上述催產(chǎn)均為一次性注射，催產(chǎn)后放入21—30℃曝氣自來水中培育，效應(yīng)時(shí)間為8—12h；(2)人工受精待黃河鲇親魚發(fā)情時(shí)，將親魚撈起，擦干體表，擠出雌鲇卵子于干凈碗中，同時(shí)用吸管吸出雄鲇精液，逐滴滴加于卵子之上，然后迅速加入水溫為25℃的曝氣自來水中，攪拌均勻，使精卵充分結(jié)合；(3)三倍體誘導(dǎo)用濃度為25mg/kg的秋水仙素，對上述受精卵進(jìn)行處理秋水仙素開始處理的時(shí)間為3—15分鐘，持續(xù)時(shí)間為25—35分鐘，得到三倍體黃河鲇。
文檔編號A01K61/00GK102812914SQ20121033805
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月13日
發(fā)明者李學(xué)軍, 李愛景, 程果, 彭新亮, 喬志剛, 聶國興, 孔祥會 申請人:河南師范大學(xué)