專利名稱：一種植物雙元表達載體pMHZ112及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，具體地說是一種植物雙元表達載體PMHZ112及其在改變人參皂苷含量的應用。
背景技術：
人參(Panax ginseng C. A. Mey.)為我國古老而名貴的藥用植物，系五加科(Araliaceaae)人參屬植物，是一種具有潛力的藥用植物，在人類保健和醫(yī)療上應用廣泛。醫(yī)學和藥理研究證明，人參皂苷為人參的主要有效成分之一，
人參阜苷(Ginsenoside, GS )是人參主要的藥理活性成分,至今人們已經從人參植物中分離出至少40多種人參皂苷單體，按人參皂苷在薄層色譜中Rf值的大小，由小到大命名為 R0> Ra, Rb1, Rb2, Rb3> Re, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rg3等。人參皂苷均屬于三萜類皂苷，可分為三大類第一類二醇型，如人參皂苷Rbp Rb2, Re、Rd、Rh2等；第二類三醇型，如人參皂苷Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1等；第三類齊墩果酸型，如人參皂苷&、Rh3等。其中二醇型和三醇型皂苷占絕大多數，被認為是人參的最主要活性成分。人參皂苷除單體皂苷外還含有蛋白質、酶類、多肽、氨基酸、人參多糖、人參揮發(fā)油、人參二醇、人參三醇等。人參皂苷屬于三萜類皂苷。四環(huán)三萜類物質是以異戊二烯為基本結構單元，其合成符合異戊二烯合成途徑。近年來研究表明，植物類異戊二烯的生物合成至少存在2條途徑，即甲羥戊酸途徑和丙酮酸/磷酸甘油醛途徑。大量文獻報道，甲羥戊酸途徑是皂苷三萜苷元合成必要途徑。目前對三萜皂苷的生物合成途徑已有一些了解，研究證明三萜皂苷的合成首先通過甲輕戍酸途徑合成2, 3-氧化S烯，隨后在氧化S烯環(huán)化酶(squalene oxidecyclase, 0SC)的作用下形成各種三職類。最后經細胞色素P450、糖基轉移酶(GT)和β-糖苷酶的作用，形成各種類型的三萜皂苷(Dong et al.，2005)。三萜皂苷的生物合成途徑至少存在兩條，一條一般以甲羥戊酸為前體，即甲羥戊酸途徑，它在細胞質中進行，并以糖酵解產物乙酰輔酶A作為初供體。留體類和倍半萜化合物通過這一途徑合成。主要分為三個階段①活性異戊二烯單位一異戊烯焦磷酸酯(isopentenyl一pyrophosphate, IPP)和 Y, Y —二甲基丙烯基焦憐酸酯(dimethylallypyrophosphate, DMAPP)的生物合成?、谒{烯(squalene)的生物合成及環(huán)化；③環(huán)上復雜的官能團的反應過程，最后形成完整的三萜皂苷分子。整個三萜皂苷的生物合成過程包括S烯合酶(squalene synthase, 5 )、藍烯環(huán)氧酶(squalene epoxidase, 5Z )、法呢基焦憐酸合酶(famesyl pyrophosphate synthase,/7/ )、單加氧化酶(monooxygenase,#(9)、氧化S烯環(huán)化酶(oxidosqualene cyelase, flSiC)、羊毛脂留醇合酶(lanosterol synthase,LSS) > β 一香樹素合酶(β —Amyrin Synthase, bAS)、環(huán)阿屯醇合酶(CyeloartenolSynthase,以50、達瑪燒型合酶(dammarenediol synthase,iM )和羽扇豆型合酶(Iupeolsynthase, LS)等一系列酶的催化。其環(huán)上官能團的合成主要有細胞色素P45tl(CytoehromeP450)、糖基轉移酶(glyeosyltransferase, β 一 glyeosylase)、β — 糖苷酶(β —glyeoside hydrolase, β 一 glyeosidase)等多種酶的催化,使三職的種類更多樣化,并形成復雜的糖苷化合物。鯊烯是三萜、留醇、膽固醇等物質生物合成重要的共同前體，是鯊烯合酶5 催化合成的產物。5 在鯊烯后續(xù)生物合成支路中處于關鍵地位。5 所催化的反應在三萜生物合成途徑中，位于碳源從類異戊二烯途徑流向萜類、留醇合成途徑的分支上，是生物合成三萜、留醇、膽固醇等萜烯類重要物質過程中的一個關鍵酶，其含量和活性決定了后續(xù)產物的合成[66]。目前己有酵母(AF092497，AB012604)、小鼠(NM_010191)、大鼠(M95591)、人(L06105，X69141)及 12 科 17 屬 41 條植物 5 的 cDNA 序列已在 GenBank登錄(至 2008 — 03 一 01), Panax ginseng ABI22078、AB010148, Cen tel la asia ticaAY787628, Artemisia annua AF302464, Arabjdopsis thalisna D29017, Oryza sa ti vaAB007501 等。藍烯環(huán)氧酶(squalene epoxidase, SQE)是一種單加氧酶,它是三職阜苷生物合成途徑中的關鍵酶之一，其基因所編碼的酶可催化鯊烯(squalene)生成2，3_氧化鯊烯。SQE主要作用于單氧態(tài)氧化鯊烯生成2，3-氧化鯊烯，2，3-氧化鯊烯是植物體內留體、皂苷、倍 半萜等許多萜類衍生物質的合成前體，這些物質在植物的生長發(fā)育或抗病過程中具有重要作用。據目前研究表明，基因在不同物種中均有表達。RNA干擾(RNAi)主要是通過雙鏈RNA的介導，特異性地降解相應序列的靶mRNA，從而阻斷相應基因表達，是一種轉錄后水平的基因沉默方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種植物雙兀表達載體和一種植物雙兀干擾表達載體。一種植物雙元表達載體PMHZ112，它是將基因插入了基礎載體pSLJ1711中； 所述的/ 況基因，其堿基序列如序列表SEQ ID NO. I所示。一種植物雙元表達載體pMHZ112制備方法，它包括
O以克隆載體pHANNIBAL為模板，用引物
Pl :5’ -AGCGAA77TTAGTATAAAATAGTTAAGTG-3，
P2 :5’ -ATGg^rr^CAATCCAAATGTAAGATC-3，
進行PCR擴增；獲得其堿基序列如序列表SEQ ID NO. I所示的基因；插入pMD218T載體中克??；
2)采用限制性內切酶I分別酶切基礎載體pMHZ112和pMD18T-/ f，試劑盒回收純化目的基因，采用T4 DNA連接酶進行連接。一種植物雙元干擾表達載體PMHZ112 -SQSSA,它是在pSLJ1711中插入了其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 4所示的-SQS-SA。一種植物雙元干擾表達載體PMHZ112 -，它是在PSLJ1711中插入了其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 7所示的-SQE-SA。一種植物雙元干擾表達載體pMHZl 12 -SQSSA制備方法，它包括
I)利用Trizol法提取人參總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，分別用引物 正義基因上游引物(5 -Sl) :5’- TCTAGACTTGACACTGTTGAGGATG- 3’
正義基因下游引物(5 -S2) :5’- GGAr^TTGTAGCCAAATCTTCTGCC- 3’
反義基因上游引物(5 -Α1) :5’- CTtK^TTGACACTGTTGAGGATGA- 3’
反義基因下游引物(5 -A2) :5’_ AAGCTT TCTGTAGCCAAATCTTCTG- 3’克隆5 基因的正義SQS-S及反義片段SQS-A，分別連接到pMD18T上，獲得pMD18T-5 -S 和 pMD18T- SQS-A ；
2)采用限制性內切酶I和I分別酶切一種植物雙元表達載體pMHZ112和pMD18T-5 -^，試劑盒回收純化目的基因，采用T4 DNA連接酶進行連接；
3)采用限制性內切酶沿οI和歷fli/III分別酶切pMHZ112-5 -S和pMD18T-5^U，試劑盒回收純化目的基因，采用T4 DNA連接酶進行連接。一種植物雙元干擾表達載體pMHZl 12 SQESA制備方法，它包括
1)利用Trizol法提取人參總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，分別用引物 正義基因上游弓 I 物 iSQE-SI) : 5 ’ -TGCTTT^gJCACTTTTATTAGGGGATGC-3 ’
正義基因下游引物 iSQE-Sl) : 5 ’ -CGCGGAr<XAAGAAGTGGAGAAATAGGC~3，
反義基因上游引物(Χβδ'-ΑΙ) :5’ -CCGCTCGAGCACTITTATTAGGGGATGC-3’
反義基因下游引物 iSQE-k2 ) : 5 ’ -CCCAAGCTTAAGAAGTGGAGAAATAGGC-3，
克隆貨萬基因的正義SQE-S及反義片段SQE-A，分別連接到pMD18T上，獲得ΡΜ 18 -SQB-S 和 pMD18T_ SQE-A ；
2)采用限制性內切酶I和I分別酶切一種植物雙元表達載體pMHZ112和pMDlST-^O^-^，試劑盒回收純化目的基因，采用T4 DNA連接酶進行連接；
3)采用限制性內切酶沿οI和歷fli/III分別酶切和pMDlST-^O^-兒試劑盒回收純化目的基因，采用T4 DNA連接酶進行連接。本發(fā)明的又一目的是提供一種轉基因人參的制備方法。一種轉基因人參的制備方法，它包括以人參葉片，制備人參愈傷組織；將一種植物雙元干擾表達載體PMHZ112 -SQS-SA，轉化到農桿菌GV3101中，再將農桿菌GV3101轉染人參愈傷組織，培育人參種苗。一種轉基因人參的制備方法，它包括以人參葉片，制備人參愈傷組織；將一種植物雙元干擾表達載體pMHZ 112-5^^-5 ，轉化到農桿菌GV3101中，再將農桿菌GV3101轉染人參愈傷組織，培育人參種苗。本發(fā)明提供了一種植物雙元表達載體PMHZ112、植物雙元干擾表達載體pMHZ112-SQS-SA和pMHZl 12 -SQESA,轉化到農桿菌GV3101中，再將農桿菌GV3101轉染人參愈傷組織，獲得了人參主要的藥理活性成分，人參皂苷的含量及構成發(fā)生了改變的轉基因人參植株，為中醫(yī)藥行業(yè)提供特殊類型的中藥資源。同時也深入地了解了人參皂苷的生物合成途徑及其所調控的分子遺傳學基礎，從而在分子水平上實現皂苷生物合成的人工調控，是發(fā)展生物技術大量生產人參皂苷的打下了基礎。


圖I. 基因PCR擴增結果；
圖2 .基礎載體pCLD04541圖譜；
圖3.載體pMHZlll圖譜；
圖4.基礎載體PSLJ1711圖譜；
圖5.載體pMHZ112圖譜；
圖6.植物雙元表達載體pMHZlll和pMHZ112酶切驗證；其中，1-5. pMHZlll,6. PDKPCR prodrct, 7-1. pMHZ112, 12. Uncut pMHZlll, 13. Uncut pMHZ112, 14. λ /Hind III ；
圖7. SQS基因正義及反義片段的PCR擴增結果；M: D2000maker; I.水為模板陰性對昭.
2: 5 正義基因片段{SQS-S、;3:5 反義基因片段(鄉(xiāng)-A)；
圖 8. pMD18T-5 -S 和 pMD18T-5^U 酶切鑒定結果；M: D2000maker; I.pMD18T-5 -S酶切鑒定結果；2: pMD18T_5O j酶切鑒定結果；
圖9. pMHZl 1載體構建策略；
圖 10. ρΜΗΖ111-5 -5^ 交叉雙酶切結果；M: D2000maker; I. pMHZlll-^-^Xba I /Hind III酶切鑒定結果；2: pMHZlll-^-^ Xho I /BawR I 酶切鑒定結果；
圖11. pMHZlll-^-^人參愈傷組織轉化后PCR鑒定結果；
圖12.實時定量PCR的電泳檢測；1-3:非轉化愈傷組織的SQS基因表達量；4_6:陽性愈傷組織的SQS基因表達量；
圖13. 5 1基因正義及反義片段的PCR擴增結果；M: D2000maker; I: 5 1正義基因片段iSQE-S) ;2:5 反義基因片段、SQE-A、；
圖 14. A φΜ ΙδΤ-Χβδ'-Χ 和 B pMm8T-SQB-A 酶切鑒定結果；
圖15. pMRZlU-SQE-SA載體構建策略；
圖 16. pMHZ 112-5^-5 交叉雙酶切結果；M: D2000maker; I. pMEZ112SQB-SAXba I /Hind III酶切鑒定結果；2: pMEZ112SQB-SA Xho I /BawR I 酶切鑒定結果；
圖17. pMHZ 112-^-5 人參愈傷組織轉化后PCR鑒定結果。
具體實施例方式實施例I 基因片段的克隆
(1)根據GenBank登錄的基因序列(AJ311872.1)，采用Primer 5. O軟件設計上下游引物，并引入&oR I酶切位點。上游引物(PDK-PI): 5 ’ -AGCGMZZCTAGTATAAAATAGTTAAGTG-3 ’
下游引物(PDK-P2 ) : 5 ’ -ATG^MIZ^CAATCCAAATGTAAGATC-3 ’
(2)以克隆載體pHANNIBAL(購自GATEWAY公司)為模板，采用Ex Taq DNA聚合酶對 基因進行PCR擴增。PCR反應體系
PDK-PltIii μιηοΙ/Llj (i(ilL
PDK-Ρ2|μ ιοΙ- .)j (, _
dKJVQ 5 UmmVl)} Ει ||L
10 BulTcr23 μ
Ex-fkq DNA^
載體 pHANNIBAL C 麵..) ,；,>lL
細:0l.ljipL
總 H. ^25JP μ
PCR運行條件94°C預變性5min ;94°C變性lmin，43°C退火30s，72。。延伸lmin，共30個循環(huán)；72°C總延伸lOmin。反應結束后取I μ I進行O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示成功擴增出基因，如圖I所示。(3)/ f基因與pMD18T的連接、轉化
采用Axygen公司DNA凝膠回收試劑盒，按照說明書操作，對擴增目的基因進行回收，回收片段與克隆載體PMD18T進行連接。連接體系
權利要求
1.一種植物雙元表達載體PMHZ112，它是將基因插入了基礎載體PSLJ1711中；所述的/ ?；?，其喊基序列如序列表SEQ ID NO. I所不。
2.一種植物雙元表達載體PMHZ112制備方法，它包括 O以克隆載體pHANNIBAL為模板，用引物Pl :5’ -AGCG^77CTAGTATAAAATAGTTAAGTG-3，P2 :5’ -ATGG^77TCAATCCAAATGTAAGATC-3， 進行PCR擴增；獲得其堿基序列如序列表SEQ ID NO. I所示的基因；插入pMD218T載體中克??； 2)采用限制性內切酶I分別酶切基礎載體pSLJ1711和pMD18T_/ f，試劑盒回收純化目的基因，采用T4 DNA連接酶進行連接。
3.一種物雙元干擾表達載體PMHZ112，它是在pSLJ1711中插入了其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 4所示的-SQS-SA。
4.一種植物雙元干擾表達載體PMHZ112 -，它是在pSLJ1711中插入了其堿基序 列如序列表SEQ ID NO. 7所示的-SQE-SA。
5.一種植物雙元干擾表達載體pMHZ112制備方法，它包括 1)利用Trizol法提取人參總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，分別用引物 正義基因上游引物(SQS-Sl) :5’- TCTAGACTTGACACTGTTGAGGATG- 3’ 正義基因下游引物(SQS-S2) :5’- GGATCCTGTAGCCAAATCTTCTGCC- 3’ 反義基因上游引物(SQS-Al) :5’- CTCGAGTTGACACTGTTGAGGATGA- 3’ 反義基因下游引物(SQS-A2) :5’- AAGCTT TCTGTAGCCAAATCTTCTG- 3’ 克隆5 基因的正義SQS-S及反義片段SQS-A，分別連接到pMD18T上，獲得pMD18T-5 -S 和 pMD18T- SQS-A ； 2)采用限制性內切酶I和及I分別酶切權利要求I所述的一種植物雙元表達載體pMHZ112和pMD18T-5 -S，試劑盒回收純化目的基因，采用T4 DNA連接酶進行連接； 3)采用限制性內切酶沿ο I和Hind III分別酶切pMHZl 12-5 -^和pMD18T_5O j，試劑盒回收純化目的基因，采用T4 DNA連接酶進行連接。
6.一種植物雙元干擾表達載體pMHZ11制備方法，它包括 1)利用Trizol法提取人參總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，分別用引物 正義基因上游弓 I 物 iSQE-SI) : 5 ’ -TGC7t7HGiCACTTTTATTAGGGGATGC-3 ’正義基因下游引物 iSQE-Sl) : 5 ’ -CGCGGAr<XAAGAAGTGGAGAAATAGGC~3， 反義基因上游引物(Χβδ'-ΑΙ) :5’ -CCGCTCGAGCACTITTATTAGGGGATGC-3’反義基因下游引物 iSQE-k2 ) : 5 ’ -CCCAAGCTTAAGAAGTGGAGAAATAGGC-3， 克隆貨萬基因的正義SQE-S及反義片段SQE-A，分別連接到pMD18T上，獲得ΡΜ 18 -SQB-S 和 pMD18T_ SQE-A ； 2)采用限制性內切酶I和及I分別酶切權利要求I所述的一種植物雙元表達載體pMHZ112和pMDI試劑盒回收純化目的基因，采用T4 DNA連接酶進行連接； 3)采用限制性內切酶沿οI和歷fli/III分別酶切和pMDlST-^O^-兒試劑盒回收純化目的基因，采用T4 DNA連接酶進行連接。
7.—種轉基因人參的制備方法，它包括以人參葉片，制備人參愈傷組織；將權利要求3所述的一種植物雙元干擾表達載體pMHZl 12- SQS-SA，轉化到農桿菌GV3101中，再將農桿菌GV3101轉染人參愈傷組織，培育人參種苗。
8.—種轉基因人參的制備方法，它包括以人參葉片，制備人參愈傷組織；將權利要求4所述的一種植物雙元干擾表達載體pMHZ112-5^^-5 ，轉化到農桿菌GV3101中，再將農桿菌GV3101轉染人參愈傷組織，培育人參種苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物雙元表達載體pMHZ112、植物雙元干擾表達載體pMHZ112-SQS-SA和pMHZ112-SQE-SA，轉化到農桿菌GV3101中，再將農桿菌GV3101轉染人參愈傷組織，獲得了人參主要的藥理活性成分，人參皂苷的含量及構成發(fā)生了改變的轉基因人參植株，為中醫(yī)藥行業(yè)提供特殊類型的中藥資源。同時也深入地了解了人參皂苷的生物合成途徑及其所調控的分子遺傳學基礎，從而在分子水平上實現皂苷生物合成的人工調控，是發(fā)展生物技術大量生產人參皂苷的打下了基礎。
文檔編號A01H5/00GK102888424SQ201210340339
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月14日 優(yōu)先權日2012年9月14日
發(fā)明者王 義, 張美萍, 蔣世翠, 孫春玉, 王康宇, 張明哲, 于彥婷, 翟俊峰, 張洪斌 申請人:吉林農業(yè)大學