一種飼用防腹瀉酵母活菌制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種飼用防腹瀉酵母的高密度發(fā)酵及其保護凍干的活菌制劑的制備方法，屬于農業(yè)生物【技術領域】。原始出發(fā)菌株布拉酵母(Saccharomyces?boulardii，ATCC?MYA-796)1株經過活化，接種到酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，30℃，200-250rpm，培養(yǎng)12-16h，作為種子液；在液體擴大酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，以10％的接種量接種種子液，30℃，800rpm，培養(yǎng)12h，然后流加25％葡萄糖6h，流加量為20ml/h/L發(fā)酵液；離心收集菌體加入保護劑(8％甘油，7.5％脫脂奶粉，7.5％海藻糖和0.9％氯化鈉)，保護劑與菌體混合比例為2∶1，混勻后靜置平衡1h；-80℃預冷12h，然后置于真空冷凍干燥機中凍干菌體，稱取凍干菌粉進行活菌計數，其活菌計數達1.4×1010CFU/g。
【專利說明】一種飼用防腹瀉酵母活菌制劑的制備方法
(—)【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種飼用防腹瀉酵母的高密度發(fā)酵及其保護凍干的活菌制劑的制備方法，屬于農業(yè)生物【技術領域】。
(二)【背景技術】
[0002]布拉酵母(Saccharomyces boulardii)是在印尼蒸枝中分離得到的的一種適溫的、非毒性酵母菌，為釀酒酵母亞種。與釀酒酵母在代謝、生理和遺傳特性方面又有所不同。常規(guī)微生態(tài)制劑易受抗生素、胃酸、膽汁的影響，應用受到限制，酵母生物學特性與細菌完全不同，布拉酵母是一種生理性真菌制劑，不會被胃酸、膽酸、抗生素等所破壞，因此其應用相對廣泛。同時酵母對PH值變化有較好的耐受性，在pH7?8時生長良好，即使在pH值低至1.5時仍能存活，且發(fā)揮活性的最適溫度為37°C，其細胞體積為細菌的10倍，使得酵母更適宜用作益生菌。使用細菌作為益生菌的最大危險是致病菌的耐藥性問題，而酵母不存在類似的問題。
[0003]布拉酵母菌的防腹瀉作用主要表現在:第一，預防和治療梭菌感染和抗生素引起的腸炎；第二，預防和治療霍亂弧菌感染；第三，布拉酵母菌能拮抗腸道病原菌、抑制毒素產生、降解毒素及毒素受體、增強腸道黏膜的免疫功能。
[0004]隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，抗生素的應用越來越廣泛，其對畜禽疾病的防治起了重要作用的同時又破壞了畜禽腸道菌群的微生態(tài)平衡，導致菌群失調，引起腸上皮細胞的代謝調節(jié)水平和生理功能發(fā)生紊亂,從而使畜禽體內病原菌或條件致病菌過度增殖而造成感染性腹瀉。腹瀉后，又會進一步加重腸道菌群的紊亂而形成惡性循環(huán)，因此，在抗感染治療過程中。選擇可有效防止腸道菌群失調又無毒副作用的生物制劑，成為畜牧業(yè)的研究熱點。
[0005]布拉酵母菌作為微生態(tài)制劑的一種，具有天然、無毒副作用、安全可靠、無殘留等優(yōu)點，同時它屬于真菌制劑，不被常用抗生素降解，可以與抗生素同時使用，口服后不會被胃酸和膽酸滅活，并在腸道內保持穩(wěn)定的有效活菌濃度，預防使用抗生素帶來的菌群失調。布拉酵母菌作為一種新型微生態(tài)制劑，在畜牧業(yè)中必將有廣闊的應用前景。
[0006]本發(fā)明技術主要針對上述的畜禽腹瀉的關鍵問題，通過研究布拉酵母的高密度發(fā)酵工藝、保護劑參數以及凍干工藝，最終獲得一種飼用防腹瀉酵母活菌制劑的制備方法。為解決畜禽腹瀉特別是幼齡動物的腹瀉問題提供了技術支撐。
(三)
【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的在于研究布拉酵母的高密度發(fā)酵工藝、保護劑參數以及凍干工藝，提供一種飼用防腹瀉酵母活菌制劑的制備方法，解決畜禽腹瀉特別是幼齡動物的腹瀉問題。
[0008]本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現。
[0009]本發(fā)明提供的一種飼用防腹瀉酵母活菌制劑的制備方法，其步驟如下:
[0010]a.原始出發(fā)菌株布拉酵母(Saccharomyces boulardii)劃線在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)上，30 0C，靜置培養(yǎng)48h進行活化；
[0011]b.從斜面上挑取一環(huán)菌體，接種到酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，30°C，200-250rpm，培養(yǎng)12_16h，作為種子液，在液體擴大酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，以10%的接種量接種種子液，30°C，800rpm，培養(yǎng)12h，然后流加25%葡萄糖6h，流加量為20ml/h/L發(fā)酵液；
[0012]c.5000rpm，30min，收集菌體，加入保護劑混，保護劑與菌體混合比例為2: 1，混勻后靜置平衡Ih ；
[0013]d.-80°C預冷12h，然后置于真空冷凍干燥機中凍干菌體，稱取凍干菌粉進行活菌計數。
[0014]本發(fā)明a中所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，是由200g去皮馬鈴薯洗凈切塊，加水800ml煮沸30min,四層紗布過濾,再加20g葡萄糖和20g瓊脂,攪拌混勻后,定容至1000ml，分裝試管，121°C蒸汽滅菌20分鐘后取出試管擺斜面制得。
[0015]本發(fā)明a中所述的菌種為布拉酵母(ATCC MYA-796) I株。
[0016]本發(fā)明b中所述的酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基和液體擴大酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基，是由IOg酵母浸出粉，20g蛋白胨于900ml水中，121°C蒸汽滅菌20min，加入115°C蒸汽滅菌15min的IOOml 20%葡萄糖溶液制得。
[0017]本發(fā)明c中所述的保護劑，是由8%甘油，7.5%脫脂奶粉，7.5%海藻糖和0.9%氯化鈉制得。
[0018]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0019]本發(fā)明所制備的防腹瀉酵母活菌制劑的有效活菌數達1.4X 101(lCFU/g。與其他制備方法比較，本發(fā)明所用的方法對酵母菌體的影響與破壞較小。
(四)【具體實施方式】
[0020]本發(fā)明提供的一種飼用防腹瀉酵母活菌制劑的制備方法的【具體實施方式】如下:
[0021]本實施例所用的菌株為布拉酵母(Saccharomyces boulardii),保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC MYA-796)。
[0022]a.200g去皮馬鈴薯洗凈切塊，加水800ml煮沸30min，四層紗布過濾，再加20g葡萄糖和20g瓊脂，攪拌混勻后，定容至1000ml，分裝試管，121°C蒸汽滅菌20分鐘后取出試管擺斜面制得馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基；
[0023]b.原始出發(fā)菌株布拉酵母劃線在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)上，30°C，靜置培養(yǎng)48h進行活化；
[0024]c.1Og酵母浸出粉，20g蛋白胨于900ml水中，121°C蒸汽滅菌20min，加入115°C蒸汽滅菌15min的IOOml 20%葡萄糖溶液制得酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基和液體擴大酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基；
[0025]d.從斜面上挑取一環(huán)菌體，接種到酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，30°C，200-250rpm，培養(yǎng)12_16h，作為種子液，在液體擴大酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，以10%的接種量接種種子液，30°C，800rpm，培養(yǎng)12h，然后流加25%葡萄糖6h，流加量為20ml/h/L發(fā)酵液；
[0026]e.5000rpm，30min，收集菌體，加入保護劑混，保護劑與菌體混合比例為2: 1，混勻后靜置平衡Ih ；
[0027]f.-80°C預冷12h，然后置于真空冷凍干燥機中凍干菌體，稱取凍干菌粉進行活菌
計數；
[0028]g.由上所述的飼用防腹瀉酵母活菌制劑的制備方法制作的酵母活菌制劑其活菌
計數達 1.4X101QCFU/g。
[0029]表1不同保護劑配方參數對凍干粉活菌數的影響
【權利要求】
1.一種飼用防腹瀉酵母活菌制劑的制備方法，其步驟為: a.原始出發(fā)菌株布拉酵母(Saccharomycesboulardii)劃線在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)上，30 0C，靜置培養(yǎng)48h進行活化； b.從斜面上挑取一環(huán)菌體，接種到酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，30°C，200-250rpm，培養(yǎng)12_16h，作為種子液，在液體擴大酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，以10%的接種量接種種子液，30°C，800rpm，培養(yǎng)12h，然后流加25%葡萄糖6h，流加量為20ml/h/L發(fā)酵液； c.5000rpm, 30min,收集菌體，加入保護劑混，保護劑與菌體混合比例為2: 1，混勻后靜置平衡Ih ； d._80°C預冷12h，然后置于真空冷凍干燥機中凍干菌體，稱取凍干菌粉進行活菌計數。
2.根據權利要求1所述的一種飼用防腹瀉酵母活菌制劑的制備方法，其步驟a所述的活化菌體的馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，是由200g去皮馬鈴薯洗凈切塊，加水800ml煮沸30min,四層紗布過濾,再加20g葡萄糖和20g瓊脂,攪拌混勻后,定容至1000ml,分裝試管，121°C蒸汽滅菌20分鐘后取出試管擺斜面制得。
3.根據權利要求1所述的一種飼用防腹瀉酵母活菌制劑的制備方法，其步驟a所述的菌種為布拉酵母(ATCC MYA-796) I株。
4.根據權利要求1所述的一種飼用防腹瀉酵母活菌制劑的制備方法，步驟b所述的酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基和液體擴大酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基，是由IOg酵母浸出粉，20g蛋白胨于900ml水中，121°C蒸汽滅菌20min，加入115°C蒸汽滅菌15min的IOOml 20%葡萄糖溶液制得。
5.根據權利要求1所述的一種飼用防腹瀉酵母活菌制劑的制備方法，其步驟c所述的保護劑，是由8%甘油，7.5%脫脂奶粉，7.5 %海藻糖和0.9%氯化鈉制得。
6.根據權利要求1-5任一項所述的飼用防腹瀉酵母活菌制劑的制備方法制作的酵母活菌制劑其活菌計數達1.4X 101(lCFU/g。
【文檔編號】A23K1/00GK103652320SQ201210342459
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月17日 優(yōu)先權日:2012年9月17日
【發(fā)明者】滕達, 王建華, 王秀敏, 管慶豐 申請人:中國農業(yè)科學院飼料研究所