專利名稱：一種鼠李糖脂作為細(xì)胞低溫或超低溫保存的保護(hù)劑應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物表面活性劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鼠李糖脂作為細(xì)胞低溫和超低溫保存保護(hù)劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物表面活性劑是一種具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和多樣化基團(tuán)的表面活性物質(zhì)，其主要由微生物產(chǎn)生。生物表面活性劑在環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥化工、食品以及農(nóng)業(yè)等各領(lǐng)域相比于化學(xué)表面活性劑更受青睞，因?yàn)槠渚哂幸妆唤到馇冶旧頍o毒等特點(diǎn)，使其具有較大的環(huán)境友好性及生物相容性。生物表面活性劑還因?yàn)槠湎鄬μ厥獾慕Y(jié)構(gòu)而使其具有一般化學(xué)表面活性劑未能體現(xiàn)的作用。由親水的1-2個(gè)鼠李糖與親脂的1-2個(gè)脂肪酸鏈連接構(gòu)成的鼠李糖脂是目前研究最為廣泛的生物表面活性劑。其研究遍及采油、環(huán)境生物修復(fù)、化妝品、食品及醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域，最近還見報(bào)道因其獨(dú)特結(jié)構(gòu)而具有特異性殺死癌細(xì)胞的作用?；畹膭游锛?xì)胞在組織工程，細(xì)胞移植和基因工程領(lǐng)域都是極為重要的研究和治療工具，但是因?yàn)閬碓从邢尴拗屏似鋺?yīng)用?；罴?xì)胞保存技術(shù)可以有效促進(jìn)其實(shí)際臨床應(yīng)用?；罴?xì)胞主要是采用液氮進(jìn)行超低溫冷凍或者溫度處于0-4度的低溫保存，此技術(shù)也適合于組織、器官的保存。目前，新的保護(hù)劑諸如海藻糖等被用于細(xì)胞凍存或者低溫保存，但是還都存在保存效果不佳、保存條件要求苛刻和操作較為復(fù)雜等問題。雖然鼠李糖脂具有潛在的廣泛用途，但未出現(xiàn)作為細(xì)胞低溫或超低溫保存的保護(hù)劑的應(yīng)用報(bào)道。本發(fā)明采用環(huán)境、友好的生物表面活性劑鼠李糖脂，用于細(xì)胞的低溫或超低溫保存。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對海藻糖作用不顯著的缺陷，提供一種鼠李糖脂在細(xì)胞低溫或超低溫保存中的作用。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種鼠李糖脂作為細(xì)胞低溫或超低溫保存的保護(hù)劑應(yīng)用，將鼠李糖脂與海藻糖一起添加到細(xì)胞低溫或超低溫保護(hù)劑中，作用于活細(xì)胞，使細(xì)胞維持較高的活率和極好的功能；所述鼠李糖脂的質(zhì)量百分比濃度高于90%，鼠李糖脂的用量為5-100mg/L，海藻糖的用量為0. 1-1M。本發(fā)明具有的有益效果是本發(fā)明所提出的鼠李糖脂作為超低溫或低溫保護(hù)劑，可顯著提高細(xì)胞的存活率和功能。
具體實(shí)施例方式鼠李糖脂的使用方法見如下步驟1.所用的鼠李糖脂具有高于90%以上的純度(質(zhì)量百分比濃度)。

2.細(xì)胞的低溫保存細(xì)胞先在37°C預(yù)培養(yǎng)12-18小時(shí)后，被轉(zhuǎn)移至0-4°C進(jìn)行低溫培養(yǎng)24-36小時(shí)，其中低溫培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基添加了 0.1-1M海藻糖和5-100mg/L的鼠李糖脂。低溫保存結(jié)束后，將細(xì)胞復(fù)溫至37°C，并進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞活率及功能。3.細(xì)胞的凍存由凍存培養(yǎng)液再添加0.1-1M海藻糖和5-100mg/L鼠李糖脂組成細(xì)胞凍存液，將待凍存的細(xì)胞加入到上述的細(xì)胞凍存液中，然后迅速轉(zhuǎn)移到程序降溫盒中，最后將冷凍管轉(zhuǎn)移至液氮中保存。細(xì)胞復(fù)溫后進(jìn)行活率測定并通過培養(yǎng)測定細(xì)胞功能。下面結(jié)合具體實(shí)施例詳述本發(fā)明具體內(nèi)容及其所帶來的顯著效果。實(shí)施例1、大鼠肝細(xì)胞凍存中使用鼠李糖脂大鼠肝細(xì)胞作為哺乳動物細(xì)胞具有體積大、易敏感的特點(diǎn)，因而凍存難度較大。對自行分離得到的大鼠肝細(xì)胞采用凍存的方法。為了考察鼠李糖脂和海藻糖聯(lián)用的作用，細(xì)胞凍存采用了三種保護(hù)劑配方。配方1: 1640低碳培養(yǎng)基70%，DMSO 10%, FBS 20%,再添加580 u M甘草酸二銨，2mM
維生素E，0.1M海藻糖和不同濃度的鼠李糖脂。配方2 1640低碳培養(yǎng)基70%，DMSO 10%, FBS 20%,再添加580 u M甘草酸二銨，2mM
維生素E，IM海藻糖和不同濃度的鼠李糖脂。配方3 1640低碳培養(yǎng)基70%，DMSO 10%, FBS 20%,再添加0.1M海藻糖和不同濃度
的鼠李糖脂。細(xì) 胞凍存一段時(shí)間后水浴復(fù)溫，用臺盼藍(lán)染色的方法測定細(xì)胞活率，結(jié)果見表1.表1:鼠李糖脂對大鼠肝細(xì)胞凍存后活率的影響
權(quán)利要求
1.一種鼠李糖脂作為細(xì)胞低溫或超低溫保存的保護(hù)劑應(yīng)用，其特征在于，將鼠李糖脂與海藻糖一起添加到細(xì)胞低溫或超低溫保護(hù)液中，作用于活細(xì)胞，使細(xì)胞維持較高的活率和極好的功能；所述鼠李糖脂的質(zhì)量百分比濃度高于90%，鼠李糖脂的用量為5-100 mg/L，海藻糖的用量為0. 1-1M。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鼠李糖脂作為細(xì)胞低溫或超低溫保存的保護(hù)劑應(yīng)用，含5-100mg/L的鼠李糖脂用量可顯著提高凍存和低溫保存后的細(xì)胞活率和功能，作用效果顯著。
文檔編號A01N1/02GK103027032SQ20121037533
公開日2013年4月10日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者孟琴, 姜利芳 申請人:浙江大學(xué)