專利名稱：含嗜酸乳桿菌的反芻動物微生態(tài)功能飼料及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物有益菌在飼料中應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株優(yōu)選的嗜酸乳桿菌，特別涉及含有該嗜酸乳桿菌的復(fù)合發(fā)酵菌劑，以及該復(fù)合發(fā)酵菌劑用于將食品工業(yè)廢棄物作為飼料原料與輔料混合后發(fā)酵，制備成反芻動物微生態(tài)功能飼料的方法。
背景技術(shù)：
微生態(tài)功能飼料是由多種有益微生物對有關(guān)飼料原料進行發(fā)酵處理后的飼料，其中的微生物和代謝產(chǎn)物與相關(guān)動物體內(nèi)的自然微生態(tài)體系相吻合和營養(yǎng)互補。利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的微生態(tài)功能飼料，對于開發(fā)利用飼料資源，提高飼料利用率，調(diào)節(jié)動物體內(nèi)微生態(tài)平均，替代抗生素，防治某些疾病，具有積極意義。 用于生產(chǎn)發(fā)酵飼料的原料十分廣泛，從早期的石油、甲醇、乙醇等碳氫化合物到目前的食品加工副產(chǎn)物、廢棄物、農(nóng)作物秸桿等。其中對利用餅柏作為原料生產(chǎn)發(fā)酵蛋白飼料的研究報道較多，該類發(fā)酵的目的是去除其中的抗營養(yǎng)因子和毒素，以提高加工副產(chǎn)物在配合飼料中的用量比例。而對食品加工廢棄物，如玉米黃漿水、玉米噴漿纖維、醬糟、木薯渣等，因其酸堿性和含鹽量不適合現(xiàn)有發(fā)酵菌的發(fā)酵工作，而未用發(fā)酵菌將玉米黃漿水、玉米噴漿纖維、醬糟、木薯渣等進行發(fā)酵制造飼料。下面是現(xiàn)在玉米黃漿水、玉米噴漿纖維、醬糟、木薯渣在飼料應(yīng)用方面存在的問題
玉米黃漿水是指在玉米淀粉生產(chǎn)過程中分離出來的懸濁液，其中BOD值高達I. 5mg/g,富含有機物質(zhì)，一般工廠均排放入江、河、湖泊，造成了嚴重的污染。據(jù)測定，玉米黃漿水的水分含量達90. 01% (許劍秋，2002)，將玉米黃漿水濃縮成含水60%左右的濃縮液稱為玉米黃漿液，其粗蛋白可達含量10 15%。噴漿玉米纖維是玉米黃漿水與玉米皮的混合干燥物，水分含量10%左右，粗蛋白22 24%，粗纖維11 13%左右。對于利用噴漿玉米纖維生產(chǎn)發(fā)酵飼料的尚未見文獻報道。醬糟是指用大豆、大米、麩皮等釀造醬油以后剩下的糟渣，含干物質(zhì)41. 47%，粗蛋白質(zhì)12. 72%，粗脂肪5. 31%，粗纖維21. 43%，無氮浸出物O. 62%，灰分4. 12%，鈣
O.08%，磷O. 04% (蘇玉賢，2001)。目前多數(shù)企業(yè)將醬糟烘干以后制成醬糟粉作飼料利用，但干燥過程能耗高。木薯渣是用木薯生產(chǎn)淀粉或酒精后的廢料，新鮮木薯渣的水分含量85.0%以上，烘干后的木薯渣的水分含量10. O 12. 0%，蛋白含量4. O %左右，粗纖維含量12% . 0，適口性較差，直接用作飼料的價值較低。國內(nèi)外對利用食品工業(yè)廢棄物生產(chǎn)發(fā)酵飼料已有一些報道。許劍秋2002年報道了利用白地霉發(fā)酵玉米黃漿水生產(chǎn)飼料蛋白粉，但需要壓濾后再烘干，設(shè)備投資大，該技術(shù)尚處于實驗室研究階段(許劍秋，玉米淀粉廢水生產(chǎn)飼料蛋白，糧食與飼料工業(yè)2002年第4期)。聞琦濤等(2000年)利用光合菌(PSB)發(fā)酵玉米黃漿水生產(chǎn)PSB菌泥(閏琦濤等，玉米淀粉黃漿水PSB法資源化開發(fā)的應(yīng)用前景，吉林糧食高等?？茖W(xué)校學(xué)報，2000年第4期)，該技術(shù)需要將發(fā)酵液進行菌液分離，使液體達標排放，但同樣也是設(shè)備投資較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有優(yōu)良性能的嗜酸乳桿菌，以及適合以玉米黃漿液、玉米噴漿纖維、醬糟和木薯渣為主要原料的復(fù)合發(fā)酵菌劑和可以替代反芻動物精料的微生態(tài)功能飼料及其制備方法。該飼料可以降低反芻動物飼料成本，增加反芻動物對粗飼料的采食量和日糧粗纖維的消化率，提高反芻動物生產(chǎn)性能和非特異性免疫功能，降低反芻動物發(fā)病率，增加反芻動物養(yǎng)殖經(jīng)濟效益。本發(fā)明的第一個目的是提供一種耐酸耐膽鹽的嗜酸乳桿菌即LAgl2-7嗜酸乳桿菌；
本發(fā)明的第二個目的是提供含LAgl2-7嗜酸乳桿菌的復(fù)合發(fā)酵菌劑；
本發(fā)明的第三個目的是提供將復(fù)合發(fā)酵菌劑制備成復(fù)合發(fā)酵菌液的方法；·
本發(fā)明的第四個目的是提供含復(fù)合發(fā)酵菌液的反芻動物微生態(tài)功能飼料，根據(jù)反芻動物的營養(yǎng)需要和日糧配制特點，以食品工業(yè)廢棄物為主要原料，添加適當發(fā)酵輔料，經(jīng)LAgl2-7嗜酸乳桿菌和其它多種微生物發(fā)酵后，成為可以直接替代反芻動物精料的反芻動物微生態(tài)功能飼料；
本發(fā)明的第五個目的是提供含復(fù)合發(fā)酵菌液的反芻動物微生態(tài)功能飼料制備方法。本發(fā)明所提供的LAgl2-7菌株分離自牦牛胃腸道粘膜，經(jīng)鑒定為嗜酸乳桿菌{Lactobacillus acit/ophilus)。LAgl2_7嗜酸乳桿菌己于2012年8月由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)保藏，保藏日期2012年8日3日，保藏單位地址中國、武漢、武漢大學(xué)(電話027-68754052)，存活檢測日期2012年8月7日保藏號為CCTCC M2012305 ;該嗜酸乳桿菌具有以下特性
(1)該菌接種于MRS液體培養(yǎng)基，在37°C條件下培養(yǎng)22小時達到最高生長濃度，0D600值為2.86 (見圖I)；
(2)該菌接種于MRS液體培養(yǎng)基，在37°C條件下培養(yǎng)36小時以后，培養(yǎng)液的pH值低于3. 50 (見圖2)；
(3)該菌在pH2.O條件下處理2小時之后的存活率為69. 32% (見表I)；
(4)該菌在重量比為O.4%濃度的膽鹽條件處理2小時之后，菌的存活率為53. 60% (見表2)；
(5)該菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的抑菌圈分別是12. 14 17. 30mm (見表 3)。本發(fā)明所提供含LAgl2_7嗜酸乳桿菌的反芻動物微生態(tài)功能飼料至少具有以下一種功能
(1)增強反芻動物對粗飼料的采食量和對日糧纖維的消化率對酒糟的采食量提高
4.46% 13. 24% (見表6)，粗纖維消化率提高9. 73% 19.02% (見表8)；
(2)提高反芻動物生產(chǎn)性能和經(jīng)濟效益日增重提高7.89% 8. 77% (見表7)，毛利潤增加42. 94% 76. 69% (見表11)；
(3)具有調(diào)節(jié)反芻動物瘤胃微生物平衡的功能，增加瘤胃纖維分解菌的數(shù)量對黃色瘤胃球菌等、白色瘤胃球菌、嗜酸乳酸桿菌和牛鏈球菌的數(shù)量極顯著提高(見表9);
(4)保護反芻動物機體抗氧化系統(tǒng)、提高非特異性免疫功能，增強抗病力對血清中總蛋白、白蛋白和三種免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM)各指標的濃度明顯提高，對總抗氧化能力和超氧化物歧化酶的活性明顯提高(見表10)。本發(fā)明涉及菌、菌劑、活化方法、飼料配方和飼料制作方法的技術(shù)內(nèi)容如下
K LAg12-7嗜酸乳桿菌的獲得
采用常規(guī)乳酸菌的分離、篩選和鑒定方法，從牦牛胃腸道粘膜中分離得到108株乳酸菌，通過生理生化性能測定，產(chǎn)酸、耐酸耐鹽實驗等，從中篩選出一株性能優(yōu)良的嗜酸乳桿菌，命名為LAgl2-7嗜酸乳桿菌，經(jīng)冷凍干燥制作成LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉。該菌由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)保藏，其編號為CCTCC M 2012305，該菌凍干粉的活菌數(shù)可達200億/克。2、復(fù)合發(fā)酵菌劑的配方和復(fù)合發(fā)酵菌液的制作
復(fù)合發(fā)酵菌劑組份按重量比組成為LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉30. O 60. 0%、枯草芽孢桿菌凍干粉20. O 50. 0%、啤酒酵母菌凍干粉10. O 30. 0%。上述LAgl2_7嗜酸乳桿菌同于由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)保藏，其編號為CCTCC M 2012305的LAgl2-7嗜酸乳桿菌，其冰干粉活菌數(shù)為200億/克；枯草芽孢桿菌凍干粉購自華辰興業(yè)(成都)科技有限公司，其活菌數(shù)為200億/克；啤酒酵母菌凍干粉購自安琪酵母股份有限公司，其活菌數(shù)為200億/克。使用復(fù)合發(fā)酵菌劑對底物進行發(fā)酵前，需將復(fù)合發(fā)酵菌劑先活化制成合發(fā)酵菌液。制備合發(fā)酵菌液的方法是按重量比稱取5. O 15. O %的紅糖加入80. O 90. O %的清潔水，待紅糖溶化后，加入復(fù)合發(fā)酵菌劑O. 3 I. O %、維生素C O. I O. 4%、尿素2. O ·5.0%和磷酸二氫鉀O. I 0.5%，攪拌均勻；保持溫度和時間為32°C條件下保溫2 3天，保溫期間每天攪拌一次，溶液PH值即能降到4. O以下，獲得活化好的復(fù)合發(fā)酵菌液。3、反芻動物微生態(tài)功能飼料的組成配方和制作方法
根據(jù)反芻動物營養(yǎng)需要和飼喂特點，先用重量比為75. O 85.0%的發(fā)酵主料與10. O 20. O %的發(fā)酵輔料進行混合，再加入2. O 6. O %的復(fù)合發(fā)酵菌液進行充分混合制成發(fā)酵原料，然后將發(fā)酵原料裝入發(fā)酵塑料袋中，密封發(fā)酵塑料袋使發(fā)酵原料在發(fā)酵塑料袋中進行發(fā)酵。發(fā)酵條件為在環(huán)境溫度15 30°C條件下發(fā)酵2 3天，獲得成品反芻動物微生態(tài)功能飼料；或在環(huán)境溫度6 15°C條件下發(fā)酵5 7天，獲得成品反芻動物微生態(tài)功能飼料。以上發(fā)酵主料的組成及重量比為按重量比稱取玉米黃漿液20. O 35. 0%、噴漿玉米纖維25. O 45. O %、醬糟20. O 40. O %和木薯渣5. O 15. O %直接混合。發(fā)酵輔料的組成及重量比為按重量比稱取麥麩50. O 65. 0%，啤酒酵母粉20. O 35. O %，碳酸鈣4. O 8. O %、碳酸氫鈉4. O 8. O %、氯化鎂I. O 4. O %直接混
八
口 ο復(fù)合發(fā)酵菌液的組成及重量比為紅糖5. O 15. 0%、清潔水80. O 90. 0%、復(fù)合發(fā)酵菌劑O. 3 I. 0%、維生素C O. I O. 4%、尿素2. O 5. 0%和磷酸二氫鉀O. I
O.5%。復(fù)合發(fā)酵菌液的制備方法按重量比稱取5.0 15.0%的紅糖加入80. O 90. 0%的清潔水，待紅糖溶化后，加入復(fù)合發(fā)酵菌劑O. 3 I. 0%、維生素C O. I O. 4%、尿素2. O 5.0%和磷酸二氫鉀O. I 0.5%，攪拌均勻；保持溫度和時間為32°C條件下保溫2 3天，保溫期間每天攪拌一次，溶液pH值即能降到4. O以下，獲得活化好的復(fù)合發(fā)酵菌液。本發(fā)明中
玉米黃漿液的含水量為58 60% ;
噴漿玉米纖維的含水量為10 12% ;
醬糟的含水量為10 12% ;
木薯渣的含水量為10 12%。上述發(fā)酵原料玉米黃漿液為玉米黃漿水濃縮為含水58 60%的濃縮液，購自魯 州生物科技(四川)有限公司；噴漿玉米纖維是玉米黃漿水與玉米皮的混合干燥物，水分含量10 12%，購自魯州生物科技(四川)有限公司；醬糟是生產(chǎn)醬油的余渣經(jīng)干燥而成，水份含量10 12%，購自成都國釀食品股份有限公司；木薯渣的水份含量為10 12%，購自四川金盛源生物化工有限公司；啤酒酵母粉是在生產(chǎn)啤酒過程中，啤酒發(fā)酵液過濾后的余渣經(jīng)干燥而成，水份含量為10%，購自金威啤酒(成都)有限公司。本發(fā)明的優(yōu)點針對目前國內(nèi)對食品加工廢棄物玉米黃漿液、噴漿玉米纖維、醬糟以及木薯渣開發(fā)飼料產(chǎn)品的方法單一、設(shè)備復(fù)雜、能耗較高的現(xiàn)狀，本發(fā)明綜合運用微生物發(fā)酵技術(shù)和動物營養(yǎng)原理，以食品工業(yè)廢棄物一玉米黃漿液、玉米噴漿纖維、醬糟和木薯渣為發(fā)酵主料，再根據(jù)反芻動物的營養(yǎng)需要特點添加發(fā)酵輔料，再加入活化后的復(fù)合發(fā)酵菌液(含LAgl2-7嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌和啤酒酵母菌)后，直接裝入發(fā)酵塑料袋中進行固態(tài)發(fā)酵。本發(fā)明具有以下優(yōu)點
I、優(yōu)良的LAgl2-7嗜酸乳桿菌株
本發(fā)明從牦牛胃腸道粘膜中分離的108株乳酸菌中，經(jīng)反復(fù)篩選得到一株性能優(yōu)良的嗜酸乳桿菌，命名為LAgl2-7嗜酸乳桿菌(微生物保藏編號CCTCC M 2012305)。該菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)22小時即達到最高生長濃度，0D600值為2. 86，在MRS液體培養(yǎng)基中37°C條件下培養(yǎng)36小時，培養(yǎng)液的pH值即低于3. 50 ;在pH2. O處理2小時之后的存活率為69. 32% ;在O. 7%%膽鹽濃度處理2小時之后的存活率為53. 60% ;對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌均有較為明顯的抑制作用，經(jīng)冷凍干燥制作成LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉，凍干粉的活菌數(shù)為200億/克。由于LAgl2_7嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸、耐酸和抑菌性能好，并能與枯草芽孢桿菌和啤酒酵母菌有很好的配伍，使發(fā)酵飼料中PH值在24小時以內(nèi)迅速降至4. O以下，快速抑制有害微生物的生長，并使有益菌始終處于優(yōu)勢狀態(tài)，可使發(fā)酵飼料能長期保質(zhì)。2、制備反芻動物微生態(tài)功能飼料的工藝簡單易行
本發(fā)酵飼料改變一般固態(tài)發(fā)酵模式，通過菌種組合，將配制好的發(fā)酵原料放入發(fā)酵塑料袋中，進行好氧與厭氧相結(jié)合的立體式節(jié)能發(fā)酵前期主要由好氧菌(酵母菌)發(fā)酵，消耗掉發(fā)酵原料中的氧氣，后期主要由厭氧菌(嗜酸乳桿菌)發(fā)酵，使發(fā)酵飼料中PH值24小時以內(nèi)迅速降低至4. O以下，快速抑制有害微生物的生長，同時枯草芽孢桿菌繁殖產(chǎn)生大量纖維素酶、蛋白酶等消化酶。經(jīng)7 20天發(fā)酵即得成品反芻動物微生態(tài)功能飼料?？裳b載質(zhì)量40kg發(fā)酵原料的塑料袋即是發(fā)酵容器，也是成品包裝、貯藏袋和運輸袋，無須再包裝、無須再干燥，直接運送到用戶。3、反芻動物微生態(tài)功能飼料生產(chǎn)成本低
本發(fā)明以低價的食品工業(yè)廢棄物為主要原料，同時對棄物原料采用無須烘干的節(jié)能發(fā)酵工藝，使飼料的生產(chǎn)成本低。由于通過添加適當發(fā)酵輔料和和含LAgl2-7嗜酸乳桿菌的復(fù)合發(fā)酵菌劑進行發(fā)酵后，成為具有較高營養(yǎng)價值的反芻動物微生態(tài)功能飼料。在反芻動物精料中添加20 60%的本發(fā)明微生態(tài)功能飼料，在提高反芻動物生產(chǎn)性能的同時，可降低反芻動物飼料成本4%左右。4、反芻動物微生態(tài)功能飼料使用方便
本發(fā)明根據(jù)反芻動物的營養(yǎng)需要和使用特點設(shè)計，使發(fā)酵后的微生態(tài)功能飼料的營養(yǎng) 指標基本達到反芻動物精料的營養(yǎng)指標，用戶在使用時可直接以20 60%的重量比替代反芻動物精料，無須改變或調(diào)整原有反芻動物精料配方，使用方便。5、反芻動物微生態(tài)功能飼料具有多種功能
本發(fā)明的功能飼料含有多種具有活性的有益菌及其具有生物活性的代謝產(chǎn)物，具有增強反芻動物對粗飼料的采食量和對日糧纖維的消化率、提高生產(chǎn)性能和經(jīng)濟效益、增加瘤胃纖維分解菌的數(shù)量、保護機體抗氧化系統(tǒng)、提高非特異性免疫功能、增強抗病力等多種功倉泛。6、反芻動物微生態(tài)功能飼料保質(zhì)期長
本發(fā)明的反芻動物微生態(tài)功能飼料在環(huán)境溫度30°C 40°C條件下保質(zhì)70 90天；或在環(huán)境溫度O 30°C條件下保質(zhì)150 180天。而現(xiàn)有含嗜酸乳桿菌發(fā)酵的飼料在環(huán)境溫度30°C 40°C條件下保質(zhì)15 20天；或在環(huán)境溫度O 30°C條件下保質(zhì)30 40天。圖I是LAgl2_7嗜酸乳桿菌的生長曲線；
圖2是LAgl2-7嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸能力圖。
具體實施例實施例I、乳酸菌的篩選及性能測定
I.I、篩選牦牛胃腸乳酸菌獲得LAgl2_7嗜酸乳桿菌
MRS培養(yǎng)基蛋白胨10. 00g、酵母膏5. 00g、牛肉膏10. 00g、葡萄糖20. 00g、磷酸氫二鉀
2.00g、檸檬酸三氨I. 00g、乙酸鈉5. 00g、硫酸鎂0. 80g、硫酸錳0. 25g、吐溫801ml，用蒸餾水定容至 1000ml，pH 6. 2 6. 4，115°C滅菌 30min。采用常規(guī)微生物學(xué)方法，從牦牛胃腸道粘膜中分離得到108株乳酸菌，通過產(chǎn)酸、耐酸耐鹽實驗等，從中篩選出一株性能優(yōu)良的菌株。該菌株經(jīng)過生理生化鑒定及16SrDNA分子鑒定確定該菌株為嗜酸乳桿菌，命名為嗜酸乳桿菌LAgl2-7，菌株經(jīng)冷凍干燥制作成凍干粉，凍干粉的活菌數(shù)為200億/克。該菌由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)保藏，其編號為CCTCC M 2012305。I. 2、LAg12-7嗜酸乳桿菌生長試驗
將嗜酸乳桿菌LAgl2-7轉(zhuǎn)入MRS液體培養(yǎng)基中37°C活化15 18小。將活化好的菌株以2% (V/V)的接種量轉(zhuǎn)入MRS液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)，，每隔一定時間取樣測定0D600值，以未接種的培養(yǎng)基作為空白對照。結(jié)果可見前20小時LAgl2-7嗜酸乳桿菌繁殖迅速，0D600值持續(xù)上升；從20 48小時，菌體密度基本趨于平衡，0D600值穩(wěn)定在2. 86左右，處于生長穩(wěn)定期，見圖I。I. 3、LAg12-7嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸試驗
將LAgl2-7嗜酸乳桿菌活化后，接種到MRS液體培養(yǎng)基，在37°C條件下培養(yǎng)，每隔一定時間取樣測定pH值，以未接種的MRS液體培養(yǎng)基的pH為初始pH。結(jié)果見圖2，可見培養(yǎng)36小時以后，LAg12-7嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液的pH值低于3. 50。LAg12-7嗜酸乳桿菌活化后，接種MRS液體培養(yǎng)基，在37°C條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間后測定發(fā)酵液PH，以未接種的MRS液體培養(yǎng)基的pH為初始pH。結(jié)果表明，該菌種培養(yǎng)后PH快速下降，培養(yǎng)到36h以后pH下降趨勢趨緩，培養(yǎng)到60h時pH達到3. 45.可見培養(yǎng)36小時以后，LAg12-7嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液的pH值低于3. 50，見圖2。I. 4、LAg12-7嗜酸乳桿菌耐酸試驗· 將菌種接種在MRS液體培養(yǎng)基上活化2次，以2% (V/V)的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在37°C條件下培養(yǎng)24h小時，8000rpm/min離心10分鐘，收集菌體，將菌體用pbs (pH6. O)緩沖液洗漆I次,重新懸浮于pbs (pH6. O)緩沖液中。將懸浮液平均分成5分，再次離心收集菌體。將得到的菌體分別懸浮于PH2. 0,3. 0,4. 0、5. O和6. O的pbs緩沖液中，所得到的5份不同pH的pbs菌液，在室溫下放置2小時，進行活菌計數(shù)，以pH6. O條件下的活菌數(shù)為100%，計算其存活率。LAg12-7嗜酸乳桿菌耐酸試驗結(jié)果見表1，表明LAgl2_7嗜酸乳桿菌在pH2. O條件下放置2小時后的存活率為69. 32%。表lLAgl2_7嗜酸乳桿菌在不同pH值下的存活率(單位％ )
I
,.ο :,η ,.ο m .ο
LAn 12-7II mS | SL35 | B ..25 | 1_
I.5、LAgl2-7嗜酸乳桿菌耐膽鹽試驗
膽鹽加入量設(shè)4個梯度0. 1%,0. 3%,O. 5%和O. 7%，以不加膽鹽的培養(yǎng)基為對照。將菌種接種在MRS液體培養(yǎng)基上活化2次，以2%接種量接種于處理樣與對照樣中，在37°C條件下靜置培養(yǎng)2小時后進行活菌計數(shù)。LAgl2-7嗜酸乳桿菌耐膽鹽試驗結(jié)果見表2，表明LAgl2_7嗜酸乳桿菌在O. 7%膽鹽條件下培養(yǎng)2小時后的存活率為53. 60%。表2乳酸菌在不同鹽濃度下的存活率(單位％ )
O. ! 0,3O, 5O. V
IJlgO-I _酸乳桿菌 I 82· SS , ijiiso 56. SO SX 60
_i_!_!___
I.6、LAg12-7嗜酸乳桿菌抑菌試驗
選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌作為指示菌。抑菌活性分析方法在600λ的入射光條件下，將指示菌菌懸液的光密度值調(diào)為O. 10，傾注于15mL LB固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，放置直徑為7mm的牛津杯，加入嗜酸乳桿菌LAgl2-7的發(fā)酵上清液，在室溫下擴散30min，在37°C條件下培養(yǎng)16-18小時，觀察抑菌圈。結(jié)果如表3所示。表3LAgl2_7嗜酸乳桿菌的抑菌圈直徑(單位mm)
實施例2、制備反芻動物微生態(tài)功能飼料用的復(fù)合發(fā)酵菌劑的方法該復(fù)合發(fā)酵菌劑的組成和重量比為LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉30. 0%、枯草芽孢桿菌凍干粉50. 0%、啤酒酵母菌凍干粉20. 0%。將LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉、枯草芽孢桿菌凍干粉和啤酒酵母菌凍干粉在常溫條件下混合均勻就制成反芻動物微生態(tài)功能飼料用的復(fù)合發(fā)酵菌劑。實施例3、制備反芻動物微生態(tài)功能飼料用的復(fù)合發(fā)酵菌劑的方法
該復(fù)合發(fā)酵菌劑的組成和重量比為LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉60. 0%、枯草芽孢桿菌凍干粉20. 0%、啤酒酵母菌凍干粉20. 0%。將LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉、枯草芽孢桿菌凍干粉和啤酒酵母菌凍干粉在常溫條件下混合均勻就制成反芻動物微生態(tài)功能飼料用 的復(fù)合發(fā)酵菌劑。實施例4、制備反芻動物微生態(tài)功能飼料用的復(fù)合發(fā)酵菌劑的方法
該復(fù)合發(fā)酵菌劑的組成和重量比為LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉45. 0%、枯草芽孢桿菌凍干粉45. 0%、啤酒酵母菌凍干粉10. 0%。將LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉、枯草芽孢桿菌凍干粉和啤酒酵母菌凍干粉在常溫條件下混合均勻就制成反芻動物微生態(tài)功能飼料用的復(fù)合發(fā)酵菌劑。實施例5、制備反芻動物微生態(tài)功能飼料用的復(fù)合發(fā)酵菌劑的方法
該復(fù)合發(fā)酵菌劑的組成和重量比為LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉40. 0%、枯草芽孢桿菌凍干粉30. 0%、啤酒酵母菌凍干粉30. 0%。將LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉、枯草芽孢桿菌凍干粉和啤酒酵母菌凍干粉在常溫條件下混合均勻就制成反芻動物微生態(tài)功能飼料用的復(fù)合發(fā)酵菌劑。實施例6、將復(fù)合發(fā)酵菌劑活化成復(fù)合發(fā)酵菌液的方法
復(fù)合發(fā)酵菌液的組成及重量比為紅糖5. O %、復(fù)合發(fā)酵菌劑1.0%、維生素C 0.4%,尿素3. I %、磷酸二氫鉀O. 5%和清潔水90.0%。將復(fù)合發(fā)酵菌劑活化的步驟按上述配方稱取紅糖加入清潔水，待紅糖溶化后，力口入復(fù)合發(fā)酵菌劑、維生素C、尿素和磷酸二氫鉀，攪拌均勻；保持溫度和時間為32°C條件下保溫2 3天，保溫期間每天攪拌一次，溶液pH值即能降到4. O以下，獲得活化好的復(fù)合發(fā)酵菌液。實施例7、將復(fù)合發(fā)酵菌劑活化成復(fù)合發(fā)酵菌液的方法
復(fù)合發(fā)酵菌液的組成及重量比為紅糖15.0%、復(fù)合發(fā)酵菌劑0.3%、維生素C O. 1%,尿素2. 0%、磷酸二氫鉀O. 1%和清潔水82. 5%。將復(fù)合發(fā)酵菌劑活化的步驟同于實施例6。實施例8、將復(fù)合發(fā)酵菌劑活化成復(fù)合發(fā)酵菌液的方法
復(fù)合發(fā)酵菌液的組成及重量比為紅糖8. 70 %、復(fù)合發(fā)酵菌劑O. 52 %、維生素C
O.17%、尿素5. 00%、磷酸二氫鉀O. 17%和清潔水85. 43%。將復(fù)合發(fā)酵菌劑活化的步驟同于實施例6。實施例9、將復(fù)合發(fā)酵菌劑活化成復(fù)合發(fā)酵菌液的方法復(fù)合發(fā)酵菌液的組成及重量比為紅糖13. 1%、復(fù)合發(fā)酵菌劑1.0%、維生素CO.4%、尿素5. 0%、磷酸二氫鉀O. 5%和清潔水80. 0%。將復(fù)合發(fā)酵菌劑活化的步驟同于實施例6。實施例10、反芻動物微生態(tài)功能飼料的制作方法 反芻動物微生態(tài)功能飼料中各原料的配方如下
發(fā)酵主料的組成及重量比為玉米黃漿液20. 0%、噴漿玉米纖維45. 0%、醬糟20. 0%和木薯渣15. 0% ；
發(fā)酵輔料的組成及重量比為麥麩50. 0%，啤酒酵母粉35. 0%，碳酸鈣8. 0%、6. 0%、氯化鎂1.0% ;
復(fù)合發(fā)酵菌液的組成及重量比為紅糖5.0%、復(fù)合發(fā)酵菌劑1.0%、維生素C 0.4%,尿素3. I %、磷酸二氫鉀O. 5%和清潔水90. 0% ;
反芻動物微生態(tài)功能飼料的原料組成和重量比為發(fā)酵主料75. O %、發(fā)酵輔料20.0%、復(fù)合發(fā)酵菌液5.0% ；
其中部分原料的含水量為玉米黃漿液的含水量為58 60%;噴漿玉米纖維的含水量為10 12% ;醬糟的含水量為10 12% ;木薯渣的含水量為10 12%。用上述原料制作反芻動物微生態(tài)功能飼料的步驟如下
(1)制作發(fā)酵主料按重量比稱取玉米黃漿液、噴漿玉米纖維、醬糟和木薯渣直接混
合；
(2)制作發(fā)酵輔料按重量比稱取麥麩，啤酒酵母粉，碳酸鈣、碳酸氫鈉、氯化鎂直接混
合；
(3)制作復(fù)合發(fā)酵菌液按重量比稱取紅糖加入清潔水80.O 90. O %，待紅糖溶化后，加入復(fù)合發(fā)酵菌劑、維生素C、尿素和磷酸二氫鉀，攪拌均勻；保持溫度和時間為32°C條件下保溫2 3天，保溫期間每天攪拌一次，溶液pH值即能降到4. O以下，獲得活化好的復(fù)合發(fā)酵菌液；
(4)制作功能飼料先用重量比為發(fā)酵主料與發(fā)酵輔料進行混合，再加入復(fù)合發(fā)酵菌液進行充分混合制成發(fā)酵原料，然后將發(fā)酵原料裝入發(fā)酵塑料袋中，密封發(fā)酵塑料袋使發(fā)酵原料在發(fā)酵塑料袋中進行發(fā)酵；發(fā)酵條件為在環(huán)境溫度15 30°C條件下發(fā)酵2 3天，獲得成品反芻動物微生態(tài)功能飼料；或在環(huán)境溫度6 15°C條件下發(fā)酵5 7天，獲得成品反芻動物微生態(tài)功能飼料。實施例11、反芻動物微生態(tài)功能飼料的制作方法 反芻動物微生態(tài)功能飼料中各原料的配方如下
發(fā)酵主料的組成及重量比為玉米黃漿液35. 0%、噴漿玉米纖維25. 0%、醬糟35. 0%和木薯渣5.0% ；
發(fā)酵輔料的組成及重量比為麥麩65. O %，啤酒酵母粉20. 0%，碳酸鈣4. O %、碳酸氫鈉8.0%、氯化鎂3.0% ；
復(fù)合發(fā)酵菌液的組成及重量比為紅糖15.0%、復(fù)合發(fā)酵菌劑0.3%、維生素C O. 1%,尿素2. O %、磷酸二氫鉀O. I %和清潔水82. 5% ;
反芻動物微生態(tài)功能飼料的原料組成和重量比為發(fā)酵主料8 5. O %、發(fā)酵輔料10. O %、復(fù)合發(fā)酵菌液5.0% ；其中部分原料的含水量同于實施例10。用上述原料制作反芻動物微生態(tài)功能飼料的步驟同于實施例10。實施例12、反芻動物微生態(tài)功能飼料的制作方法 反芻動物微生態(tài)功能飼料中各原料的配方如下
發(fā)酵主料的組成及重量比為玉米黃漿液25. O %、噴漿玉米纖維30. O %、醬糟40. 0%和木薯渣5.0% ；
發(fā)酵輔料的組成及重量比為麥麩60. O %，啤酒酵母粉26. 0%，碳酸鈣6. O %、碳酸氫鈉4.0%、氯化鎂4.0% ；
復(fù)合發(fā)酵菌液的組成及重量比為紅糖8. 70 %、復(fù)合發(fā)酵菌劑O. 52 %、維生素C O.17%、尿素5. 00%、磷酸二氫鉀O. 17%和清潔水85. 43%。將復(fù)合發(fā)酵菌劑活化的步驟同于實施例6 ；
反芻動物微生態(tài)功能飼料的原料組成和重量比為發(fā)酵主料8 4. O %、發(fā)酵輔料14. O %、復(fù)合發(fā)酵菌液2.0% ；
其中部分原料的含水量同于實施例10。用上述原料制作反芻動物微生態(tài)功能飼料的步驟同于實施例10。實施例13、反芻動物微生態(tài)功能飼料的制作方法 反芻動物微生態(tài)功能飼料中各原料的配方如下
發(fā)酵主料的組成及重量比為玉米黃漿液25. O %、噴漿玉米纖維30. O %、醬糟40. 0%和木薯渣5.0% ；
發(fā)酵輔料的組成及重量比為麥麩60. O %，啤酒酵母粉26. 0%，碳酸鈣6. O %、碳酸氫鈉4.0%、氯化鎂4.0% ；
復(fù)合發(fā)酵菌液的組成及重量比為紅糖13. 1%、復(fù)合發(fā)酵菌劑1.0%、維生素C 0.4%,尿素5. 00%、磷酸二氫鉀O. 5%和清潔水8. 0%。將復(fù)合發(fā)酵菌劑活化的步驟同于實施例6 ；
反芻動物微生態(tài)功能飼料的原料組成和重量比為發(fā)酵主料79%、發(fā)酵輔料15. 0%、復(fù)合發(fā)酵菌液6.0% ；
其中部分原料的含水量同于實施例10。用上述原料制作反芻動物微生態(tài)功能飼料的步驟同于實施例10。實施例14、肉牛微生態(tài)功能飼料飼喂試驗
本實施例在育肥肉牛精料中添加25 %或40 %的本發(fā)明反芻動物微生態(tài)功能飼料，可以增加肉牛對粗料的采食量4. 46% 13. 24%，提高日增重7. 89% 8. 77%，提高粗纖維消化率9. 73% 19. 02%，增加瘤胃纖維分解菌和乳酸菌的數(shù)量I. 28% 74. 48%，提高肉牛非特異性免疫功能，從而提高經(jīng)濟效益(毛利潤)42. 94% 76. 69%。從本實例結(jié)果來看，以基礎(chǔ)精料中添加40%的微生態(tài)功能飼料的效果為佳。下面是具體的飼喂試驗和對試驗肉牛的生產(chǎn)性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化、瘤胃微生物、生理生化及免疫等指標的測定
I、試驗方案
1.1、肉牛微生態(tài)功能飼料用本發(fā)明的含嗜酸乳桿菌的反芻動物微生態(tài)功能飼料。I. 2、試驗設(shè)計
試驗在某大型肉牛養(yǎng)殖場進行。選擇體重373. 40±42. 53kg、體況毛色一致的西雜牛90頭，采用5X3隨機區(qū)組設(shè)計，根據(jù)體重相近原則，將90頭牛分為5個區(qū)組，每個區(qū)組18頭，將同一區(qū)組的18頭牛隨機地分為到個處理(對照組、試驗I組和II組)，每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)6頭牛；對照組飼喂基礎(chǔ)精料，試驗I組和II組分別用微生態(tài)功能飼料以25%和40%的比例替代基礎(chǔ)精料，各組每頭每天飼喂相同重量的精料(4kg)和玉米秸桿顆粒(2. 7kg)，酒糟自由采食，拴系飼喂，自由飲水；試驗時間預(yù)飼期10天，正試期48天；每天記錄采食量，試驗開始和結(jié)束的早晨每頭牛空腹稱重，試驗結(jié)束時每個重復(fù)選擇接近該重復(fù)平均體重的3頭牛屠宰，取背最長肌測定肉質(zhì)指標，取瘤胃液測定瘤胃微生物的數(shù)量，頸靜脈采血測定血清生化與免疫 指標。I. 3、飼料配方及營養(yǎng)成分
對照組(基礎(chǔ)精料)為場里原有精料，試驗I組用本發(fā)明的含嗜酸乳桿菌的反芻動物微生態(tài)功能飼料替代基礎(chǔ)精料重量的25%，試驗II組代基礎(chǔ)精料重量的40%。各處理組精料的重量比配方見表4。表4各處理組精料的組成及營養(yǎng)成分重量比(單位％ )
權(quán)利要求
1.一種嗜酸乳桿菌，其特征在于所述的嗜酸乳桿菌為LAgl2-7嗜酸乳桿菌，LAgl2-7嗜酸乳桿菌由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)保藏，其保藏編號為CCTCC M2012305。
2.含有權(quán)利要求I所述嗜酸乳桿菌的復(fù)合發(fā)酵菌劑，其特征在于該復(fù)合發(fā)酵菌劑的組成和重量比為LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉30. O 60. 0%、枯草芽孢桿菌凍干粉20. O 50.0%、啤酒酵母菌凍干粉10. O 30. 0%。
3.將權(quán)利要求2所述復(fù)合發(fā)酵菌劑制備復(fù)合發(fā)酵菌液的方法按重量比稱取5.O 15. 0%的紅糖加入80. O 90. 0%的清潔水，待紅糖溶化后，加入復(fù)合發(fā)酵菌劑O. 3 I. 0%、維生素C O. I O. 4%、尿素2. O 5. 0%和磷酸二氫鉀O. I O. 5%，攪拌均勻； 保持溫度和時間為32°C條件下保溫2 3天，保溫期間每天攪拌一次，溶液pH值即能降到4. O以下，獲得活化好的復(fù)合發(fā)酵菌液。
4.含權(quán)利要求3所述復(fù)合發(fā)酵菌液的反芻動物微生態(tài)功能飼料，其特征在于原料組成和重量比為發(fā)酵主料75. O 85. 0%、發(fā)酵輔料10. O 20. 0%、復(fù)合發(fā)酵菌液2. O 6. 0% ； 發(fā)酵主料的組成及重量比為玉米黃漿液20. O 35. 0%、噴漿玉米纖維25. O 45. 0%、醬糟20. O 40. 0%和木薯渣5. O 15. 0%，其中:玉米黃漿液的含水量為58. O 60. 0%,噴漿玉米纖維的含水量為10. O 12. 0%，醬糟的含水量為10. O 12. 0%，木薯渣的含水量為10. O 12. 0% ； 發(fā)酵輔料的組成及重量比為麥麩50. O 65. 0%，啤酒酵母粉20. O 35. 0%，碳酸鈣4. O 8. 0%、碳酸氫鈉4. O 8. 0%、氯化鎂I. O 4. 0% ； 復(fù)合發(fā)酵菌液的組成及重量比為紅糖5. O 15. 0%、清潔水80. O 90. 0%、復(fù)合發(fā)酵菌劑O. 3 L 0%、維生素C O. I O. 4%、尿素2. O 5. 0%和磷酸二氫鉀O. I O. 5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述反芻動物微生態(tài)功能飼料的制作方法，其特征在于該飼料制作方法如下 Cl)制作發(fā)酵主料按重量比稱取玉米黃漿液20. O 35. 0%、噴漿玉米纖維25. O 45. 0%、醬糟20. O 40. 0%和木薯渣5. O 15. 0%直接混合； (2)制作發(fā)酵輔料按重量比稱取麥麩50.O 65. 0%，啤酒酵母粉20. O 35. 0%，碳酸鈣4. O 8. 0%、碳酸氫鈉4. O 8. 0%、氯化鎂I. O 4. 0%直接混合； (3)制作復(fù)合發(fā)酵菌液按重量比稱取5.O 15. 0%的紅糖加入80. O 90. 0%的清潔水，待紅糖溶化后，加入復(fù)合發(fā)酵菌劑O. 3 I. 0%、維生素C O. I O. 4%、尿素2. O 5. 0%和磷酸二氫鉀O. I O. 5%，攪拌均勻；保持溫度和時間為32°C條件下保溫2 3天，保溫期間每天攪拌一次，溶液PH值即能降到4. O以下，獲得活化好的復(fù)合發(fā)酵菌液； (4)制作功能飼料先用重量比為75.O 85. 0%的發(fā)酵主料與10. O 20. 0%的發(fā)酵輔料進行混合，再加入2. O 6. 0%的復(fù)合發(fā)酵菌液進行充分混合制成發(fā)酵原料，然后將發(fā)酵原料裝入發(fā)酵塑料袋中，密封發(fā)酵塑料袋使發(fā)酵原料在發(fā)酵塑料袋中進行發(fā)酵；發(fā)酵條件為在環(huán)境溫度15 30°C條件下發(fā)酵2 3天，獲得成品反芻動物微生態(tài)功能飼料；或在環(huán)境溫度6 15°C條件下發(fā)酵5 7天，獲得成品反芻動物微生態(tài)功能飼料。
全文摘要
本發(fā)明涉及含嗜酸乳桿菌的反芻動物微生態(tài)功能飼料及其制備和應(yīng)用屬于生物菌在飼料中應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株優(yōu)選的LAg12-7嗜酸乳桿菌，特別涉及含有該菌的復(fù)合發(fā)酵菌劑，以及該復(fù)合發(fā)酵菌劑用于將食品工業(yè)廢棄物、飼料原料和輔料發(fā)酵后，制備成反芻動物微生態(tài)功能飼料的方法。LAg12-7嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸、耐酸和抑菌性能好，并能與枯草芽孢桿菌和啤酒酵母菌有很好的配伍，使發(fā)酵飼料中pH值迅速降至4.0以下，快速抑制有害微生物，并使有益菌始終處于優(yōu)勢狀態(tài)，可使發(fā)酵飼料能長期保質(zhì)。本發(fā)明制備的反芻動物微生態(tài)功能飼料的工藝簡單易行、生產(chǎn)成本低、飼喂方便、保質(zhì)期長，而且可提高日糧纖維素等的消化率、經(jīng)濟效益好。
文檔編號A23K1/00GK102943053SQ201210399518
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者郭春華, 彭忠利, 羅璠, 柏雪, 王永玲 申請人:西南民族大學(xué), 四川新通達生物飼料科技有限公司