專利名稱：一種貫眾的繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是植物的繁殖方法，特別是一種貫眾的繁殖方法。
背景技術(shù)：
貫眾(Cyrtomium fortunei)為鱗毛厳科(Dryopteridaceae)多年生常綠草本，以根狀莖及葉柄殘基入藥，具有清熱解毒、止血、殺蟲(chóng)的作用，常用于治療流行性感冒、乙型肝炎、病毒性肺炎、功能性子宮出血及蟲(chóng)積腹痛等癥；還用于治療高血壓、頭暈、頭痛、慢性鉛中毒等癥(劉漢珍，俞浩，許文，何勝利.貫眾的繁殖方法及栽培技術(shù).中國(guó)野生植物資源， 2005，24 (3) :60-63)。同時(shí)，貫眾又是一種優(yōu)美的觀賞植物和良好的水土保持植物(石雷.觀賞蕨類(lèi).北京中國(guó)林業(yè)出版社，2002，151-152 ;劉漢珍，俞浩，許文，何勝利.貫眾的繁殖方法及栽培技術(shù).中國(guó)野生植物資源，2005，24 (3):60-63)。中藥貫眾的來(lái)源極其復(fù)雜，各地均使用當(dāng)?shù)鼗蚺R近地區(qū)所生產(chǎn)的多種蕨類(lèi)植物的根莖。目前市售的貫眾藥材除c. fortunei外，還有粗莖鱗毛蕨(DryopterisCrassirhixoma)、蛾眉厳(Lunathyrium acrostichoides)、單芽狗脊(Wood wardiaunigemmata)、紫萁(Osmunda Japonica)等30余種之多，分屬于6個(gè)科。通過(guò)本草考證，中藥貫眾的藥用來(lái)源應(yīng)是C. fortunei (夏志俊.中藥貫眾本草原植物考證.中藥材，1988，5 :23-25 ;張麗軍，田少庫(kù)，吳建華.貫眾的研究進(jìn)展.陜西中醫(yī)，2002，23(8) :748-749)。通過(guò)10味中草藥(貫眾、黃連、板藍(lán)根、黃芪、苦參、連翹、白術(shù)、葛根等)對(duì)沙門(mén)氏菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，貫眾、黃連對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌作用最強(qiáng)(李國(guó)旺，苗志國(guó)，趙恒章.板藍(lán)根等10種中草藥對(duì)沙門(mén)氏菌的體外抑菌試驗(yàn).貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38 (2) :142-144)。貫眾中含有的間苯三酚類(lèi)化合物，很少隨植物的年齡、采集季節(jié)而變化，具有強(qiáng)力的驅(qū)蟲(chóng)作用，根狀莖的粉末和粗提取物自古以來(lái)作為驅(qū)蟲(chóng)藥物被沿用。其明顯的活性和分類(lèi)學(xué)價(jià)值是19世紀(jì)以來(lái)人們對(duì)其進(jìn)行大量化學(xué)研究的原因(周榮漢，段金廒.植物化學(xué)分類(lèi)學(xué).上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005，337-338)。由于貫眾的人工繁殖栽培技術(shù)相對(duì)滯后，導(dǎo)致目前市售的貫眾藥材主要來(lái)源于東北、華北和長(zhǎng)江中下游地區(qū)的野生貫眾資源。且由于市場(chǎng)需求量較大，使得這些地區(qū)的貫眾資源被過(guò)度開(kāi)采，野生貫眾資源遭到嚴(yán)重破壞。貫眾的人工繁殖方法有分株繁殖和孢子繁殖。其中，分株繁殖的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)且效率低，不利于藥用貫眾的規(guī)?；a(chǎn)。貫眾孢子繁殖技術(shù)一般是將貫眾孢子播種于混合土壤培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)(劉漢珍，俞浩，許文，何勝利.貫眾的繁殖方法及栽培技術(shù).中國(guó)野生植物資源，2005，24 (3) :60-63 ;吳芹.幾種觀賞蕨類(lèi)植物的繁殖技術(shù)研究[D].南京南京林業(yè)大學(xué)，2007)，該方法培養(yǎng)出的貫眾幼孢子體大約自播種后第110 - 190天出現(xiàn)，較本發(fā)明得到幼孢子體的時(shí)間晚45 — 125天，貫眾的繁殖速度相當(dāng)慢。徐艷使用貫眾孢子無(wú)菌培養(yǎng)的方法，先用5% NaOCl溶液(每100 ml該溶液中含0.1ml吐溫_80)將孢子滅菌4min，然后按4300個(gè)孢子/cm2的接種量，將貫眾孢子接種于1/2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在孢子接種后80 90天可以看到幼孢子體產(chǎn)生(徐艷.觀賞蕨類(lèi)植物種質(zhì)超低溫保存研究[D].北京北京林業(yè)大學(xué)，2006)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出的是一種貫眾的繁殖方法，其目的旨在彌補(bǔ)現(xiàn)有貫眾繁殖技術(shù)存有的培育周期長(zhǎng)、成本高和效率低等不足。將貫眾的孢子經(jīng)消毒后，接種于MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得孢子體苗，再經(jīng)移栽得到貫眾。本發(fā)明的技術(shù)解決方案一種貫眾的繁殖方法，包括如下工藝步驟
一、培養(yǎng)基配制；
二、貫眾孢子的滅菌； 三、接種及培養(yǎng)；
四、貫眾幼孢子體苗的移栽及管理。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明彌補(bǔ)了現(xiàn)有貫眾繁殖技術(shù)培育周期長(zhǎng)、成本高和效率低等的不足，開(kāi)辟了一條人工繁殖貫眾的新途徑。用少量的孢子材料，即可快速繁育出大量孢子體，65天即可成苗，成苗率可達(dá)97%左右，使貫眾的規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)成為可能，從而滿足市場(chǎng)對(duì)貫眾的需求，同時(shí)可減少對(duì)其野生資源和環(huán)境的破壞。此外，本發(fā)明還為開(kāi)展該物種遺傳育種和保護(hù)生物學(xué)等方面的研究提供了良好的試驗(yàn)體系，具有廣泛的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例I
貫眾的繁殖方法，包括如下工藝步驟
工藝步驟一、培養(yǎng)基配制，
1)MS固體培養(yǎng)基用0. 7% (W/V)瓊脂，pH 5. 8 ；
2)煮沸后分裝至IOOml三角瓶中，然后121°C，高壓(O. IMpa)蒸汽滅菌20 min。工藝步驟二、貫眾孢子的滅菌，
1)用濾紙包裹住貫眾的成熟孢子，用線捆住紙包，投入4%NaOCl水溶液，不時(shí)搖動(dòng)，滅菌 4 min ；
2)用無(wú)菌水沖洗4遍；
3)打開(kāi)紙包，用滴管吸取無(wú)菌水，并將貫眾孢子沖洗至10ml離心管內(nèi)，用旋渦混合器混合使成懸濁液，獲得無(wú)菌貫眾孢子懸濁液。工藝步驟三、接種及培養(yǎng)，
1)在無(wú)菌條件下，先用無(wú)菌水將上述配制的MS培養(yǎng)基的表面濕潤(rùn)，使MS培養(yǎng)基表面形成一層薄薄的水膜，視傾斜三角瓶時(shí)匯集在底部的水不能讓滴管吸上連續(xù)的水滴為宜；
2)用滴管將步驟二獲得的無(wú)菌貫眾孢子懸濁液均勻接種在培養(yǎng)基上，接種密度為2000個(gè)孢子/cm2 ；
3)接種后，在23°C下，先暗培養(yǎng)24h，
4)轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001χ，光源為熒光燈，光照時(shí)間為每天10h，培
養(yǎng)7天。工藝步驟四、貫眾孢子體苗分苗、移栽，1)培養(yǎng)7天后，孢子開(kāi)始萌發(fā)，經(jīng)30天形成配子體，65天形成孢子體苗，將高度2cm，葉片為2片以上無(wú)菌孢子體苗置于自然光照下煉苗6天；再置于空氣中在相同的光照條件下煉苗6天；
2)打開(kāi)瓶蓋煉苗7天，然后用鑷子輕輕夾出單株試管苗；
3)洗凈培養(yǎng)基后，將單株試管苗移栽至裝有混合土的穴盤(pán)中，放在陰涼避光處緩苗4天，然后移至溫室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23°C，光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為IOh/天；所述的混合土包括的各組份的體積百分比為，草炭土 蛭石珍珠巖=211；
4)幼苗長(zhǎng)至9cm，將其移栽到裝有培養(yǎng)基質(zhì)的塑料盆中，置溫室培養(yǎng)，夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度21°C，夜間溫度10°C，空氣濕度70 %，緩苗25天，每半月澆MS營(yíng)養(yǎng)液；所述 的營(yíng)養(yǎng)液除不含瓊脂外，其他成分與MS (Murashige and Skoog)固體培養(yǎng)基相同。所述的培養(yǎng)基質(zhì)包括的各組份的體積百分比為草炭土 蛭石珍珠巖有機(jī)肥=4 2 2 I ο實(shí)施例2
貫眾的繁殖方法，包括如下工藝步驟
工藝步驟一、培養(yǎng)基配制，
1)MS固體培養(yǎng)基用0. 7% (W/V)瓊脂，pH 5. 8 ；
2)煮沸后分裝至IOOml三角瓶中，然后121°C，高壓(O. IMpa)蒸汽滅菌20 min。工藝步驟二、貫眾孢子的滅菌，
1)用濾紙包裹住貫眾的成熟孢子，用線捆住紙包，投入6%NaOCl水溶液，不時(shí)搖動(dòng)，滅菌 4 min ；
2)用無(wú)菌水沖洗5遍；
3)打開(kāi)紙包，用滴管吸取無(wú)菌水，并將貫眾孢子沖洗至10ml離心管內(nèi)，用旋渦混合器混合使成懸濁液，獲得無(wú)菌貫眾孢子懸濁液。工藝步驟三、接種及培養(yǎng)，
1)在無(wú)菌條件下，先用無(wú)菌水將上述配制的MS培養(yǎng)基的表面濕潤(rùn)，使MS培養(yǎng)基表面形成一層薄薄的水膜，視傾斜三角瓶時(shí)匯集在底部的水不能讓滴管吸上連續(xù)的水滴為宜；
2)用滴管將步驟二獲得的無(wú)菌貫眾孢子懸濁液均勻接種在培養(yǎng)基上，接種密度為2500個(gè)孢子/cm2 ；
3)接種后，在27°C下，先暗培養(yǎng)36h，
4)轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2300lx，光源為熒光燈，光照時(shí)間為每天14h，培養(yǎng)7天。工藝步驟四、貫眾孢子體苗分苗、移栽，
1)培養(yǎng)7天后，孢子開(kāi)始萌發(fā)，經(jīng)32天形成配子體，65天形成孢子體苗，將高度4Cm,葉片為2片以上無(wú)菌孢子體苗置于自然光照下煉苗8天；再置于空氣中在相同的光照條件下煉苗8天；
2)打開(kāi)瓶蓋煉苗7天，然后用鑷子輕輕夾出單株試管苗；
3)洗凈培養(yǎng)基后，將單株試管苗移栽至裝有混合土的穴盤(pán)中，放在陰涼避光處緩苗5天，然后移至溫室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27°C，光照強(qiáng)度為23001x，光照時(shí)間為14h/天；所述的混合土包括的各組份的體積百分比為，草炭土 蛭石珍珠巖=211；4)幼苗長(zhǎng)至11 cm，將其移栽到裝有培養(yǎng)基質(zhì)的塑料盆中，置溫室培養(yǎng)，夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度26°C，夜間溫度116°C，空氣濕度90%，緩苗35天，每半月澆MS營(yíng)養(yǎng)液；所述的營(yíng)養(yǎng)液除不含瓊脂外，其他成分與MS (Murashige and Skoog)固體培養(yǎng)基相同。所述的培養(yǎng)基質(zhì)包括的各組份的體積百分比為草炭土 蛭石珍珠巖有機(jī)肥= 4 2 2 I o
權(quán)利要求
1.一種貫眾的繁殖方法，其特征是該方法包括如下工藝步驟 一、培養(yǎng)基配制； 二、貫眾孢子的滅菌； 三、接種及培養(yǎng)； 四、貫眾孢子體苗的分苗、移栽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種貫眾的繁殖方法，其特征是所述的工藝步驟一、培養(yǎng)基配制，分 1)MS (Murashige and Skoog)固體培養(yǎng)基0. 7% (W/V)瓊脂，pH 5. 8 ； 2)煮沸后分裝至IOOml三角瓶中，然后121°C，高壓(O. IMpa)蒸汽滅菌20 min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種貫眾的繁殖方法，其特征是所述的工藝步驟二、貫眾孢子的滅菌，分 1)用濾紙包裹住貫眾的成熟孢子，用線捆住紙包，投入4-6%NaOCl水溶液，不時(shí)搖動(dòng)，滅菌4 min ； 2)用無(wú)菌水沖洗4-5遍； 3)打開(kāi)紙包，用滴管吸取無(wú)菌水，并將貫眾孢子沖洗至10ml離心管內(nèi)，用旋渦混合器混合使成懸濁液，獲得無(wú)菌貫眾孢子懸濁液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種貫眾的繁殖方法，其特征是所述的工藝步驟三、接種及培養(yǎng)，分 1)在無(wú)菌條件下，先用無(wú)菌水將上述配制的MS培養(yǎng)基的表面濕潤(rùn)，使MS培養(yǎng)基表面形成一層薄薄的水膜，以傾斜三角瓶時(shí)，視匯集在底部的水不能讓滴管吸上連續(xù)的水滴為且； 2)用滴管將工藝步驟二獲得的無(wú)菌貫眾孢子懸濁液，均勻接種在培養(yǎng)基表面上，接種密度為2000- 2500個(gè)孢子/cm2 ； 3)接種后，在溫度23-27°C，無(wú)光照下培養(yǎng)24-36h ； 4)轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，其光照強(qiáng)度為2000-2300lx，光源為熒光燈，光照時(shí)間為每天10-14h，培養(yǎng)7天。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種貫眾的繁殖方法，其特征是所述的工藝步驟四、貫眾孢子體苗分苗、移栽，分 I)培養(yǎng)7天后，孢子開(kāi)始萌發(fā)，經(jīng)30-32天形成配子體，65天形成孢子體苗，當(dāng)葉片高度2-4 cm，將葉片為2片以上無(wú)菌孢子體苗置于自然光照下煉苗6-8天；再置于空氣中在自然光照下煉苗6-8天； 2)打開(kāi)瓶蓋煉苗7天，然后用鑷子輕輕夾出單株試管苗； 3)洗凈培養(yǎng)基后，將單株試管苗移栽至裝有混合土的穴盤(pán)中，并放在陰涼避光處緩苗4-5天，然后移至溫室培養(yǎng)，溫室培養(yǎng)的溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為2000-2300 lx，光照時(shí)間為10-14h/天；所述的混合土包括的各組份的體積百分比為，草炭土 蛭石珍珠巖=2 I 1 ; 4)幼苗長(zhǎng)至9-11cm,將其移栽到裝有培養(yǎng)基質(zhì)的塑料盆中，置溫室培養(yǎng)，夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度21-26 °C，夜間溫度10-16 °C，空氣濕度70-90%，緩苗25-35天，每半月澆MSCMurashige and Skoog)營(yíng)養(yǎng)液；所述的營(yíng)養(yǎng)液除不含瓊脂外,其他成分與MS(Murashigeand Skoog)固體培養(yǎng)基相同。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種貫眾的繁殖方法，其特征是所述的培養(yǎng)基質(zhì)，其包括的各組份的體積百分比為草炭土 蛭石珍珠巖有機(jī)肥=4 2 2 :1。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種貫眾的繁殖方法，該方法包括如下工藝步驟一、培養(yǎng)基配制；二、貫眾孢子的滅菌；三、接種及培養(yǎng)；四、貫眾孢子體苗的分苗、移栽。優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明彌補(bǔ)了現(xiàn)有貫眾繁殖技術(shù)培育周期長(zhǎng)、成本高和效率低等的不足，開(kāi)辟了一條人工繁殖貫眾的新途徑。用少量的孢子材料，即可快速繁育出大量孢子體，65天即可成苗，成苗率可達(dá)97％左右，使貫眾的規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)成為可能，從而滿足市場(chǎng)對(duì)貫眾的需求，同時(shí)可減少對(duì)其野生資源和環(huán)境的破壞。此外，本發(fā)明還為開(kāi)展該物種遺傳育種和保護(hù)生物學(xué)等方面的研究提供了良好的試驗(yàn)體系，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102860262SQ20121041013
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者張開(kāi)梅, 方炎明, 沈羽, 萬(wàn)勁 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)