專利名稱：松材線蟲(chóng)的玻璃化冷凍保存及解凍復(fù)蘇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchus xylophilus)的冷凍保存方法,尤其涉及松材線蟲(chóng)的玻璃化冷凍保存及解凍復(fù)蘇方法，屬于松材線蟲(chóng)的冷凍保存領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchus xylophilus)是松材線蟲(chóng)病的病原物,屬于側(cè)尾腺口綱，墊刃目，滑刃超科，滑刃科，傘滑刃線蟲(chóng)屬。松樹(shù)是中國(guó)的主要造林樹(shù)種且其中許多種類(lèi)是感病的，全中國(guó)一半以上省份的氣候適合松材線蟲(chóng)病的發(fā)生，在中國(guó)大部分地區(qū)具備成災(zāi)和流行的基本條件，是中國(guó)林業(yè)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)的心腹大患。松材線蟲(chóng)病又名松材線蟲(chóng)萎蔫病、松樹(shù)萎蔫病、松樹(shù)枯萎病，是松屬樹(shù)種的一種毀滅性的病害，因其危害嚴(yán)重且防治非常困難而被世界上許多國(guó)家列為檢疫對(duì)象。松材線蟲(chóng)危害黑松(Pinus thunbergii)、赤 松(P. sylvestris)、馬尾松(P. massoniana)和濕地松(P. elliottii)等多種松樹(shù)，被稱為松樹(shù)的“癌癥”。自發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)病以來(lái)，國(guó)內(nèi)外就展開(kāi)了大量研究，一直在不斷地探索其防治措施。松材線蟲(chóng)的低溫冷凍保存能夠充分利用并收集各種來(lái)源的松材線蟲(chóng)，可為松材線蟲(chóng)的致病機(jī)理和生物防治技術(shù)的研究和應(yīng)用提供大量實(shí)驗(yàn)材料，并且不受時(shí)間和空間的限制。線蟲(chóng)種質(zhì)資源的提供與保存作為整個(gè)研究中最為基礎(chǔ)的一個(gè)環(huán)節(jié)，將受到人們?cè)絹?lái)越多的重視。松材線蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)保存方法是將松材線蟲(chóng)連同培養(yǎng)基置于(4_8°C )冰箱中保存，雖然比較有效，但因受到溫度和濕度的限制，不能滿足商業(yè)化制劑的要求和需要，很難進(jìn)入商品化生產(chǎn)階段，也由于人力和物力上的巨大消耗，難于在實(shí)驗(yàn)室作為種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的方法。受細(xì)胞凍存的啟發(fā)，低溫凍存也開(kāi)始應(yīng)用于線蟲(chóng)學(xué)方面。為了尋找線蟲(chóng)低溫保存技術(shù)，各國(guó)學(xué)者從十九世紀(jì)二十年代就開(kāi)始進(jìn)行低溫保存技術(shù)的研究，Rahm在1921年和1922年進(jìn)行了 Plecus rhizophilus和P. parietinus線蟲(chóng)種的低溫忙藏試驗(yàn)，在窒息條件下，Plecus spp.暴露在_272°C幾個(gè)小時(shí)、暴露在_192°C 5d,仍可存活。試驗(yàn)中Rahm發(fā)現(xiàn)Plecus spp.線蟲(chóng)慢慢在水中冷凍條件下,在_253°C,最多可存活24h。后來(lái)DeConinck又進(jìn)行了 Anguillula silusiae線蟲(chóng)_196°C的液氮冷藏試驗(yàn),他發(fā)現(xiàn)在不加保護(hù)劑條件下，A. silusiae線蟲(chóng)經(jīng)_30°C和_196°C兩步處理時(shí)，可獲得3齡和4齡幼蟲(chóng)5%的存活率。冷凍保護(hù)劑(cryoprotective agents, CPA)是指某一類(lèi)化合物,可以保護(hù)細(xì)胞抵抗低溫或超低溫對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損害，如細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰、脫水、溶質(zhì)濃度提高和蛋白質(zhì)變性及其骨架結(jié)構(gòu)的損傷等，這類(lèi)化合物稱作冷凍保護(hù)劑。冷藏試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，冷凍保護(hù)劑溶液是影響冷凍效果的重要因素。根據(jù)能否滲透進(jìn)入細(xì)胞，可將冷凍保護(hù)劑分為滲透性和非滲透性兩種。此外，還有一些新的冷凍保護(hù)劑，如抗凍蛋白、植物類(lèi)抗凍因子等。不同線蟲(chóng)屬之間或同一屬內(nèi)不同種之間對(duì)冷凍保護(hù)劑的反應(yīng)存在著很大差別。九十年代以后，科學(xué)家們更注重冷凍技術(shù)的研究，根據(jù)冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶，凍存方法可分為玻璃化和非玻璃化兩種。
玻璃化冷凍即應(yīng)用高濃度的冷凍保護(hù)劑溶液在超速冷凍過(guò)程中，形成一種極其粘稠的固化狀態(tài)，從而避免細(xì)胞內(nèi)冰晶形成的一種冷凍技術(shù)。重要的是，玻璃化過(guò)程完全避免了冷凍細(xì)胞的在解凍直至恢復(fù)細(xì)胞生物活性中冰晶的形成。玻璃化冷凍是指超快速降低細(xì)胞溫度的一種冷凍模式，一般是將經(jīng)過(guò)冷凍保護(hù)劑平衡后的線蟲(chóng)直接由零度以上溫度浸入液氮中保存，避免了細(xì)胞內(nèi)冰晶形成所致化學(xué)、物理?yè)p傷，同時(shí)縮短了冷凍處理所需的時(shí)間，簡(jiǎn)化了步驟，也不需昂貴的程序降溫儀；但是，高濃度的保護(hù)劑也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成巨大損傷。因此，玻璃化法研究的重點(diǎn)是尋找容易實(shí)現(xiàn)玻璃化并且對(duì)生物材料毒性較小的冷凍劑，還要更進(jìn)一步地提高冷凍和解凍速率。玻璃化凍存法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、快捷，不必使用貴重的程序控溫儀器，實(shí)用性強(qiáng)且應(yīng)用范圍廣泛；另外，玻璃狀的粘稠固體能夠使其在冷凍時(shí)不會(huì)形成冰晶，減少了生物材料受到的化學(xué)和物理?yè)p傷，從而提高存活率。玻璃化冷凍采用的保護(hù)劑濃度遠(yuǎn)高于常規(guī)冷凍的濃度，目的是為了使玻璃化液在冷凍過(guò)程(由零度以上溫度浸入液氮)中，由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N類(lèi)似“玻璃”的非結(jié)構(gòu)狀態(tài)，但沒(méi)有冰晶形成，所形成的“玻璃”結(jié)構(gòu)保持著液態(tài)時(shí)正常的離子分布，維持了正常的超微·結(jié)構(gòu)，減少了對(duì)蟲(chóng)體及細(xì)胞損害，提高了冷凍復(fù)蘇率和繁殖率。可見(jiàn)，提高保護(hù)劑的濃度能夠促進(jìn)玻璃化的形成，減少冰晶的損傷，但是過(guò)高的保護(hù)劑濃度又會(huì)對(duì)線蟲(chóng)造成滲透損傷，毒性致死。因此，必須在二者之間尋求到一種平衡，使得線蟲(chóng)在該濃度的處理下冷凍效果最佳。現(xiàn)有的松材線蟲(chóng)的冷凍保存及解凍方法均不同程度的存在著凍后存活率較低的缺陷，有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種凍后存活率高的松材線蟲(chóng)玻璃化冷凍保存及解凍復(fù)蘇方法；本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的松材線蟲(chóng)的玻璃化冷凍保存及解凍復(fù)蘇方法，包括以下步驟(I)將松材線蟲(chóng)懸液與冷凍保護(hù)劑混合均勻得到混合物；將混合物進(jìn)行平衡處理；(2)平衡處理后的混合物在液氮中冷凍保存；(3)解凍、復(fù)蘇；其中，所述的冷凍保護(hù)劑是二甲基亞砜和卵黃?，F(xiàn)有的冷凍保護(hù)劑的種類(lèi)較多，采用不同種類(lèi)、不同用量的冷凍保護(hù)劑，其對(duì)于松材線蟲(chóng)的冷凍保存效果存在著顯著性的差異；為了篩選出適宜于松材線蟲(chóng)冷凍保存的冷凍保護(hù)劑，本發(fā)明進(jìn)行了冷凍保護(hù)劑的優(yōu)化篩選試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于其它的冷凍保護(hù)齊U，采用二甲基亞砜(DMSO)和卵黃作為松材線蟲(chóng)的冷凍保護(hù)劑，冷凍后的保護(hù)效果最好，由此，本發(fā)明優(yōu)選二甲基亞砜(DMSO)和卵黃作為松材線蟲(chóng)的冷凍保護(hù)劑。卵黃是禽鳥(niǎo)或爬行動(dòng)物的卵的內(nèi)部貯藏養(yǎng)料、呈黃色的球形體，外部圍有蛋白。卵黃是專供卵生和卵胎生動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本發(fā)明中所述的“卵黃”可以是任何一種禽鳥(niǎo)或爬行動(dòng)物所產(chǎn)卵的卵黃，例如可以是雞鴨等家禽動(dòng)物的卵黃，其制備方法可以是將雞蛋或鴨蛋煮熟后，取出其中的卵黃即可。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過(guò)進(jìn)一步的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，冷凍保護(hù)劑的濃度或用量對(duì)于松材線蟲(chóng)冷凍后存活率的影響非常顯著；本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，控制冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜在混合物中的終濃度是2% -5% (v/v)，控制卵黃在混合物中的終濃度是15% -25% (g/ml)時(shí)，經(jīng)過(guò)液氮冷凍后的松材線蟲(chóng)的存活率較高，其中，當(dāng)二甲基亞砜在混合物中的終濃度是4% (v/v)，卵黃在混合物中的終濃度是20% (g/ml)時(shí)，松材線蟲(chóng)在液氮中冷凍保存I個(gè)月后的凍后存活率達(dá)到了 61.9±0. 7%。本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在確定“2-5 % 二甲基亞砜+15-25 %卵黃”作為松材線蟲(chóng)的冷凍保護(hù)劑的基礎(chǔ)上，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步添加不同濃度的清蛋白對(duì)于松材線蟲(chóng)的凍后效果也有著較為顯著的影響。清蛋白又稱白蛋白。是一類(lèi)不被50%飽和度的硫酸銨溶液沉淀的球狀蛋白質(zhì)，存在于動(dòng)物組織、體液和某些植物的種子中，其分子量較低，溶于水，易結(jié)晶。在中性溶液中加熱即沉淀或凝固；清蛋白的重要代表是血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白、麥清蛋白、豆清蛋白及有毒的蓖麻蛋白。
為了篩選出白蛋白的最適宜的保護(hù)濃度，本發(fā)明以“4%二甲基亞砜+20%卵黃”的組合作為主要冷凍保護(hù)劑，分別添加不同濃度的清蛋白以觀察不同用量的清蛋白對(duì)松材線蟲(chóng)凍后存活率的影響。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清蛋白的添加量為O. 1-0. 6%(g/ml)之間能夠有效提升松材線蟲(chóng)的凍后存活率，其中尤以O(shè). l%(g/ml)的加入量對(duì)于松材線蟲(chóng)的凍后存活率的提升最為顯著。本發(fā)明方法中所述的“平衡處理”是在冷凍之前，將松材線蟲(chóng)懸液與冷凍保護(hù)劑的混合物在0-4°C溫度條件下靜置一段時(shí)間；本發(fā)明通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同的平衡時(shí)間對(duì)于松材線蟲(chóng)凍后的存活率也有著較為顯著的影響。在冷凍前，經(jīng)過(guò)不同時(shí)間來(lái)平衡的線蟲(chóng)存活率差異顯著，試驗(yàn)結(jié)果表明，在冷凍之前，將松材線蟲(chóng)懸液與冷凍保護(hù)劑的混合物在0-4°C溫度條件下平衡(或靜置)2-3h后再進(jìn)行冷凍，凍后效果最好。解凍及復(fù)蘇方式不同，對(duì)線蟲(chóng)凍后存活率的影響也大有不同。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干解凍后的線蟲(chóng)存活率明顯極低，且不受解凍溫度變化的影響。而通過(guò)水浴解凍，線蟲(chóng)存活率受解凍溫度的影響較大，解凍溫度為40°C水浴時(shí)，線蟲(chóng)的存活率最高；50°C水浴解凍的線蟲(chóng)存活率低于40°C組；20°C和60°C之間差異不顯著，在水浴解凍中存活率最低。試驗(yàn)結(jié)果表明，干解凍法不適于松材線蟲(chóng)低溫保存的解凍方法。所以，本發(fā)明方法中所述的解凍復(fù)蘇的方式優(yōu)選為水浴解凍，更優(yōu)選為40-50°C的水浴解凍，最優(yōu)選為40°C的水浴解凍。將松材線蟲(chóng)線蟲(chóng)懸液與冷凍保護(hù)劑混合并進(jìn)行平衡處理之前，還可以先將松材線蟲(chóng)懸液進(jìn)行預(yù)處理；所述的“預(yù)處理方式”是將松材線蟲(chóng)懸液與冷凍保護(hù)劑混合在一起后在室溫溫度下靜置12-48小時(shí)；其中所述的室溫溫度優(yōu)選為20-25°C。不同的預(yù)處理對(duì)松材線蟲(chóng)凍后的存活率影響很大。本發(fā)明考察了不同的預(yù)處理方式對(duì)松材線蟲(chóng)線蟲(chóng)凍后存活率的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，采用適宜的預(yù)處理能夠有效提高松材線蟲(chóng)的冷凍存活率。本發(fā)明通過(guò)大量的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用終濃度1-5% (v/v)的DMSO和4-6% (v/v)的甘油聯(lián)合在一起作為預(yù)處理中的冷凍保護(hù)劑對(duì)松材線蟲(chóng)懸液進(jìn)行預(yù)處理，能夠顯著提升松材線蟲(chóng)的凍后存活率，其中，用終濃度3%(v/v)的DMSO和5%(v/v)的甘油聯(lián)合在一起作為預(yù)處理中的冷凍保護(hù)劑，松材線蟲(chóng)在液氮中冷凍保存I個(gè)月后解凍復(fù)蘇，松材線蟲(chóng)的存活率有顯著提高，與其它處理方式存在顯著性差異。本發(fā)明對(duì)玻璃化冷凍保存方法中的各工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，篩選到了最適宜于松材線蟲(chóng)玻璃化冷凍保存的保護(hù)劑的種類(lèi)、濃度以及包括預(yù)處理、平衡和解凍復(fù)蘇在內(nèi)的最優(yōu)處理方式。采用本發(fā)明方法冷凍保存松材線蟲(chóng)，冷凍后的松材線蟲(chóng)存活率高、凍后繁殖率高，能適用于不同株系松材線蟲(chóng)的冷凍保存。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。試驗(yàn)材料和方法1、主要溶液的配制 1.1冷凍保護(hù)液的配制DMS0、卵黃(從雞蛋或鴨蛋中取出的卵黃)和清蛋白(乳清蛋白、卵清蛋白或血清蛋白)分別用無(wú)菌水配制成溶液；各種溶液經(jīng)過(guò)滅菌后置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. 2稀釋液林格氏液(氯化鈉8g/L,氯化鉀O. 2g/L,氯化I丐O. 2g/L,碳酸氫鈉O. 2g/L),無(wú)菌水和O.1M蔗糖。高壓滅菌，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?通用的試驗(yàn)方法2.1松材線蟲(chóng)的分離及松材線蟲(chóng)懸液的制備采用貝爾曼漏斗法分離實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)保存的松材線蟲(chóng)，將松材線蟲(chóng)接種到長(zhǎng)滿盤(pán)多毛孢的PDA平板上，25°C培養(yǎng)5-6d，線蟲(chóng)大量繁殖，再用貝爾曼漏斗法分離線蟲(chóng)，將收集到的松材線蟲(chóng)懸液箱保存?zhèn)溆谩?. 2線蟲(chóng)懸液混均計(jì)數(shù)法將分離收集得到的松材線蟲(chóng)懸液進(jìn)行濃縮(約5000條/ml)，取裝有IOml線蟲(chóng)懸液的指形管，蓋緊瓶蓋，上下?lián)u晃均勻，從中吸取IOOul移置在凹玻片上，在解剖鏡下計(jì)數(shù)液滴中的線蟲(chóng)數(shù)量，重復(fù)5次，根據(jù)平均值計(jì)算出IOOul懸液中的線蟲(chóng)數(shù)量，再乘以10倍即為該線蟲(chóng)懸液的濃度。2. 3松材線蟲(chóng)的冷凍松材線蟲(chóng)懸液與冷凍保護(hù)劑混合均勻后在25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Id,再放入冷凍管中經(jīng)過(guò)冷凍保護(hù)液處理后，迅速投入液氮罐中，保存24h。2. 4松材線蟲(chóng)的解凍與稀釋將冷凍管從液氮罐中迅速取出，移至恒溫水浴鍋中劇烈振蕩50-60S，待管中結(jié)冰完全融化立即加入稀釋液。2. 5松材線蟲(chóng)的復(fù)蘇與鏡檢將稀釋后的松材線蟲(chóng)懸液放入25°C恒溫箱中培養(yǎng)ld，解凍復(fù)蘇后的線蟲(chóng)取50ul于凹玻片上靜置5min，通過(guò)解剖鏡的光熱以及挑針的物理刺激觀察線蟲(chóng)的扭動(dòng)彎曲情況(活力級(jí)別分為強(qiáng)、弱和死亡)，以解凍后線蟲(chóng)能否活動(dòng)作為存活與否的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算總體的存活率(存活率計(jì)算公式存活率=存活后具活力的線蟲(chóng)數(shù)/線蟲(chóng)總數(shù)X 100 % )。再通過(guò)觀察計(jì)算出幼蟲(chóng)存活率，挑出全部成蟲(chóng)于倒置顯微鏡下鑒別雌雄，并計(jì)算各自存活率。2. 6統(tǒng)計(jì)分析所得數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS13. O統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X 土 SD)來(lái)表示，每組試驗(yàn)5個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)例I玻璃化冷凍保護(hù)劑的篩選試驗(yàn)1、試驗(yàn)方法從同一松材線蟲(chóng)懸液中取出11200毫升，分成完全相同的112份樣品(每份樣品100毫升)，分成112個(gè)組進(jìn)行下述試驗(yàn)試驗(yàn)I組向松材線蟲(chóng)懸液中加入冷凍保護(hù)劑DMSO和卵黃，得到混合溶液；其中，控制DMSO在混合溶液中的終濃度為O. 5%(v/v),卵黃在混合溶液中的終濃度為5% (g/ml);將混合溶液在4°C放置2h (即平衡處理)后迅速投入液氮中保存；液氮中保存I個(gè)月后于40°C水浴鍋中解凍，加入適量無(wú)菌水稀釋I倍，25°C培養(yǎng)箱中恢復(fù)培養(yǎng)；4°C保存，12h后計(jì)算存活率。試驗(yàn)2組-112組分別按照表I所述的用量向松材線蟲(chóng)懸液中加入冷凍保護(hù)劑DMSO和卵黃，試驗(yàn)方法均與試驗(yàn)I組相同。每組試驗(yàn)均重復(fù)5次，每組的冷凍存活率取5次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。2、試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表I。表I冷凍保護(hù)劑DMSO和卵黃的用量?jī)?yōu)選試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchusxylophilus)的玻璃化冷凍保存及解凍復(fù)蘇方法,包括以下步驟(I)松材線蟲(chóng)懸液與冷凍保護(hù)劑混合均勻得到混合物；將混合物進(jìn)行平衡處理；(2)平衡處理后的混合物在液氮中冷凍保存；(3)解凍、復(fù)蘇；其中，所述的冷凍保護(hù)劑是二甲基亞砜和卵黃。
2.按照權(quán)利要求1所述的玻璃化冷凍保存及解凍方法，其特征在于按v/v計(jì)，二甲基亞砜在混合物中的終濃度是2% -5%;按g/ml計(jì)，卵黃在混合物中的終濃度是15% -25%。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的玻璃化冷凍保存及解凍方法，其特征在于按v/v計(jì)，二甲基亞砜在混合物中的終濃度是4% ;按g/ml計(jì)，卵黃在混合物中的終濃度是20%。
4.按照權(quán)利要求1所述的玻璃化冷凍保存及解凍方法，其特征在于所述的冷凍保護(hù)劑包含有白蛋白。
5.按照權(quán)利要求4所述的玻璃化冷凍保存及解凍方法，其特征在于按g/ml計(jì)，清蛋白在混合物中的終濃度是O. 1-0. 6%。
6.按照權(quán)利要求5所述的玻璃化冷凍保存及解凍方法，其特征在于按g/ml計(jì)，清蛋白在混合物中的終濃度是O. 1%。
7.按照權(quán)利要求1所述的玻璃化冷凍保存及解凍方法，其特征在于所述的平衡處理是將混合物在0-4°C溫度條件下靜置2-3小時(shí)。
8.按照權(quán)利要求1所述的玻璃化冷凍保存及解凍方法，其特征在于將松材線蟲(chóng)線蟲(chóng)懸液與冷凍保護(hù)劑混合并進(jìn)行平衡處理之前，將松材線蟲(chóng)懸液進(jìn)行預(yù)處理；所述的預(yù)處理是將松材線蟲(chóng)懸液與冷凍保護(hù)劑混合在一起得到混合物，將混合物在室溫下靜置；所述的冷凍保護(hù)劑是二甲基亞砜和甘油。
9.按照權(quán)利要求8所述的玻璃化冷凍保存及解凍方法，其特征在于按v/v計(jì)，二甲基亞砜在混合物中的終濃度是1_5%，優(yōu)選為3% ;甘油在混合物中的終濃度是4-6%，優(yōu)選為5%。
10.按照權(quán)利要求8所述的玻璃化冷凍保存及解凍方法，其特征在于所述的室溫溫度為20-25°C，所述的靜置時(shí)間為12-48小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchus xylophilus)的玻璃化冷凍保存及解凍復(fù)蘇方法，該方法包括以下步驟(1)將松材線蟲(chóng)懸液與冷凍保護(hù)劑混合均勻得到混合物；將混合物進(jìn)行平衡處理；(2)平衡處理后的混合物在液氮中冷凍保存；(3)解凍、復(fù)蘇；其中，所述的冷凍保護(hù)劑是二甲基亞砜和卵黃。本發(fā)明對(duì)玻璃化冷凍保存方法中的各工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，篩選到了最適宜于松材線蟲(chóng)玻璃化冷凍保存的保護(hù)劑的種類(lèi)、濃度以及包括預(yù)處理、平衡和解凍復(fù)蘇在內(nèi)的最適宜的處理方式。采用本發(fā)明方法冷凍保存松材線蟲(chóng)，冷凍后的松材線蟲(chóng)存活率高、凍后繁殖率高，能適用于松材線蟲(chóng)不同株系的冷凍保存。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102986648SQ20121042488
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月30日
發(fā)明者王曦茁, 張永安, 汪來(lái)發(fā), 樸春根, 田國(guó)忠, 林彩麗, 李永 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所