專利名稱:一種創(chuàng)制結(jié)縷草高頻再生系的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域,尤其涉及一種創(chuàng)制結(jié)縷草高頻再生系的方法。
背景技術(shù):
草坪草具有景觀功能、生態(tài)功能和運(yùn)動(dòng)功能。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高,草坪對(duì)于城市的綠化和環(huán)境改善起著越來越重要的作用。人們利用有性雜交、輪回選育等常規(guī)育種手段培育出一些草坪草新品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有可以定向改良、打破生殖隔離等優(yōu)點(diǎn),是草坪草遺傳改良的一種非常有前途的手段。草坪草與其他植物一樣,組織培養(yǎng)是遺傳轉(zhuǎn)化操作的前提。目前,盡管有不少報(bào)道已建立了各草種的再生體系,但由于大多數(shù)草坪草屬異花授粉植物,遺傳背景復(fù)雜,組織培養(yǎng)比其他植物更具有難度。
力和抗逆性,尤其以超群的耐踐踏、耐瘠薄和抗病能力而著稱。結(jié)縷草被譽(yù)為“最有前途”的草種,其形成的草坪彈力是早熟禾的30-40倍,耗水量比草地早熟禾少30-40%,建植和管理費(fèi)用比早熟禾低80%左右(胡叔良,1997,發(fā)展草坪綠地關(guān)鍵問題的探討,中國草地,5 (2)67-70)。正是由于結(jié)縷草所具有的這些獨(dú)特的優(yōu)良性狀,使它們成為運(yùn)動(dòng)場、開放綠地、邊坡綠化以及水土保持的重要草種,也是適合我國水資源貧乏國情的草坪草種。同時(shí),結(jié)縷草也是我國唯一具有出口創(chuàng)匯能力的草種。因此,建立穩(wěn)定高效的結(jié)縷草組織培養(yǎng)體系不僅具有重要的理論意義,還有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在結(jié)縷草組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化方面,前人已做過一些探索和研究,并取得了一定的研究成果。早在1987年,Al-Khayri等以日本結(jié)縷草成熟胚作為實(shí)驗(yàn)材料,通過切離成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織,最終獲得再生植株(Al-Khayri J M, Huang F H, Thompson LF, etal.1987, In vitro plant regeneration of zoysia grass(Zoysia japonicaSteud. ). InVitro,23:3;Al-Khayri J M,Huang F H,Thompson L F,et al.1989,Plant regenerationof zoysia grass from embryo-derived callus. Crop Science, 29 (5):1324-1325)。但結(jié)縷草種子較小,成熟胚的分離操作相對(duì)困難,限制其廣泛應(yīng)用。Inokuma等在1996年首次報(bào)道通過培養(yǎng)日本結(jié)縷草懸浮細(xì)胞系,用純化得到的原生質(zhì)體再生出植株(IN0KUMAC,SUGIURA K,CHO C,et al. 1996, Plant regenerationfrom protoplasts of Japaneselawn grass. Plant Cell Reports, 15(10) :737_741)。但該操作不僅比較繁瑣,而且再生率較低。之后,人們又以結(jié)縷草幼穗、幼胚和根莖作為外植體,試圖通過體胚發(fā)生途徑獲得再生植株(Ν0Η H Y,CHOI J S,AHN B J. 1995,Plant regeneration through somaticembryogenesis in zoysia grasses(Zoysiaspp.). Journal of the Korean Society forHorticultural Science,36 (4) : 582-587 ;玄松南,陳慧哲,傅亞萍,等.1997,兩種草坪草愈傷組織的誘導(dǎo)及其分化研究.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),9:295-299 ;GE Yaxin, TINA Norton, WANGZeng-Yu. 2006, Transgeniczoysiagrass(Zoysia japonica)plants obtained by Agrobacterium-mediatedtransformation. Plant Cell Rep, 25:792 - 798),但該方法不僅取材受季節(jié)所限,無菌外植體的獲得也是一個(gè)難題。不管以哪種外植體再生植株,均有諸多因素影響再生率(齊春輝,韓烈保,黃麟,等.2005,幾種因素對(duì)日本結(jié)縷草愈傷組織誘導(dǎo)與生長影響的研究.四川草業(yè),4:1-3;張俊衛(wèi),唐蜻,包滿珠.2006,日本結(jié)縷草成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的影響因子分析.中國農(nóng)業(yè)科學(xué),39(2) :368-374)。目前,尚未見有關(guān)結(jié)縷草高頻再生系的創(chuàng)制方法相關(guān)報(bào)道或?qū)@?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種創(chuàng)制結(jié)縷草再生愈傷組織系的方法。本發(fā)明提供的方法,包括如下步驟將單粒結(jié)縷草種子依次經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)、第一次繼代培養(yǎng)、第二次繼代培養(yǎng)、第三次繼代培養(yǎng),得到結(jié)縷草再生愈傷組織系。上述方法中,上述誘導(dǎo)培養(yǎng)、所述第一次繼代培養(yǎng)、所述第二次繼代培養(yǎng)和所述第三次繼代培養(yǎng)采用的培養(yǎng)材料均源自同一個(gè)種子。上述方法中,所述誘導(dǎo)培養(yǎng)為將所述結(jié)縷草種子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng),得到誘導(dǎo)愈傷組織; 所述第一次繼代培養(yǎng)為將所述誘導(dǎo)愈傷組織在第一代繼代培養(yǎng)基中第一代繼代培養(yǎng),得到第一次愈傷組織;所述第二次繼代培養(yǎng)為將所述第一次愈傷組織在第二代繼代培養(yǎng)基中第二代繼代培養(yǎng),得到第二次愈傷組織;所述第三次繼代培養(yǎng)為將所述第三次愈傷組織在第三代繼代培養(yǎng)基中第三代繼代培養(yǎng),得到再生愈傷組織系;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在液體MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度2mg/L的2,4-D(2,4- 二氯苯氧乙酸)、終濃度的O. 15mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)、終濃度30g · Γ1的蔗糖、終濃度7. Og · Γ1的瓊脂、終濃度O. 5g · Γ1的水解酪蛋白、終濃度Img · Γ1的VBi (維生素BI)、終濃度Img · Γ1的VB2 (維生素B2),用水補(bǔ)足體積;所述第一代繼代培養(yǎng)基為在液體MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為lmg/L的2,4-D、終濃度為O. 2mg/L的6-BA、終濃度為O. 2mg/L的ABA (脫落酸)、終濃度為40g · L—1的蔗糖、終濃度為9. Og · L—1的瓊脂、終濃度為O. 5g · L—1的水解酪蛋白、終濃度為Img · Γ1的VB1和終濃度為Img · Γ1的VB2,用水補(bǔ)足體積;所述第二代繼代培養(yǎng)基為將所述第一次繼代培養(yǎng)基中的蔗糖終濃度調(diào)整為35g · L_\瓊脂終濃度調(diào)整為8. Og · L—1,其他成分和濃度不變,用水補(bǔ)足體積;所述第三代繼代培養(yǎng)基為將所述第二次繼代培養(yǎng)基中的蔗糖終濃度調(diào)整為30g · L_\瓊脂終濃度調(diào)整為7. Og · L—1,其他成分和濃度不變,用水補(bǔ)足體積。上述方法中,所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為溫度24_26°C、光照強(qiáng)度1000-3000umolm_2s_1下暗培養(yǎng)I個(gè)月;所述第一次、第二次、第三次繼代培養(yǎng)條件均為溫度24_26°C、黑暗培養(yǎng)20天。上述方法中,在所述第一次繼代培養(yǎng)后和所述第二次繼代培養(yǎng)前還包括如下步驟選取第一次繼代愈傷組織中的胚性愈傷組織;所述選取第一次繼代愈傷組織中的胚性愈傷組織具體為剝離松軟第一次繼代愈傷組織,而選取質(zhì)地變硬的第一次繼代愈傷組織。
上述方法中,所述結(jié)縷草種子為去穎后的結(jié)縷草種子。在上述方法中,也可以在第二次、第三次繼代培養(yǎng)時(shí)均選用胚性愈傷組織作為培養(yǎng)材料。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備結(jié)縷草再生植株的方法。本發(fā)明提供的方法,包括如下步驟在上述創(chuàng)制結(jié)縷草再生愈傷組織系的方法中的第三次繼代培養(yǎng)后,將所述結(jié)縷草再生愈傷組織系依次經(jīng)分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng),得到結(jié)縷草再生植株;所述分化培養(yǎng)為將所述結(jié)縷草再生愈傷組織系在分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng),得到生芽愈傷組織;所述分化培養(yǎng)基為在液體MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為
I.Omg/L 6-BA、終濃度為O. 2mg/L KT (6-糠氨基嘌呤)、終濃度為O. 5mg/L ZT (玉米素)、終濃度為30g · L—1蔗糖、終濃度為7. Og · L—1瓊脂、終濃度為O. 5g · L—1水解酪蛋白,終濃度為Img · L-1VB1、終濃度為Img · L1VB2,用水補(bǔ)足體積。上述獲得再生植株的方法中,在所述分化培養(yǎng)中,所述結(jié)縷草再生愈傷組織系的直徑大小均為O. 3-0. 5cm ;上述獲得再生植株的方法中,所述生根培養(yǎng)為將所述生芽愈傷組織在所述生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng),得到結(jié)縷草再生植株;所述生根培養(yǎng)基為在液體1/2MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為10mg/L VB1、終濃度為O. 25mg/L IBA (吲哚丁酸)、終濃度為25g · L—1蔗糖和終濃度為
7.Og · L—1瓊脂,用水補(bǔ)足體積。上述獲得再生植株的方法中,所述分化培養(yǎng)和所述生根培養(yǎng)的條件均如下溫度24-26°C、光照強(qiáng)度1000-3000umol n^s—1及光照14h/黑暗IOh的條件下培養(yǎng)I個(gè)月。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種創(chuàng)制結(jié)縷草再生愈傷組織系或制備結(jié)縷草再生植株的培養(yǎng)基組。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基組,包括誘導(dǎo)培養(yǎng)基、第一次繼代培養(yǎng)基、第二次繼代培養(yǎng)基和第三次繼代培養(yǎng)基;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在液體MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度2mg/L的2,4-D(2,4- 二氯苯氧乙酸)、終濃度的O. 15mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)、終濃度30g · Γ1的蔗糖、終濃度7. Og · Γ1的瓊脂、終濃度O. 5g · Γ1的水解酪蛋白、終濃度Img · Γ1的VBi (維生素BI)、終濃度Img · Γ1的VB2 (維生素B2),用水補(bǔ)足體積;所述第一代繼代培養(yǎng)基為在液體MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為lmg/L的2,4-D、終濃度為O. 2mg/L的6-BA、終濃度為O. 2mg/L的ABA (脫落酸)、終濃度為40g · L—1的蔗糖、終濃度為9. Og · L—1的瓊脂、終濃度為O. 5g · L—1的水解酪蛋白、終濃度為Img · Γ1的VB1和終濃度為Img · Γ1的VB2,用水補(bǔ)足體積;所述第二代繼代培養(yǎng)基為將所述第一次繼代培養(yǎng)基中的蔗糖終濃度調(diào)整為35g · L_\瓊脂終濃度調(diào)整為8. Og · L—1,其他成分和濃度不變,用水補(bǔ)足體積;所述第三代繼代培養(yǎng)基為將所述第二次繼代培養(yǎng)基中的蔗糖終濃度調(diào)整為30g · L_\瓊脂終濃度調(diào)整為7. Og · L—1,其他成分和濃度不變,用水補(bǔ)足體積。所述培養(yǎng)基組還具體包括分化培養(yǎng)基;所述分化培養(yǎng)基為在液體MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分 終濃度為I. Omg/L 6-BA、終濃度為O. 2mg/L KT (6-糠氨基嘌呤)、終濃度為O. 5mg/L ZT (玉米素)、終濃度為30g · Γ1蔗糖、終濃度為7. Og · Γ1瓊脂、終濃度為O. 5g · Γ1水解酪蛋白,終濃度為Img · L4VB1、終濃度為Img · L4VB2,用水補(bǔ)足體積。所述培養(yǎng)基組還進(jìn)一步具體包括生根培養(yǎng)基,所述生根培養(yǎng)基為在液1/2MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為10mg/L VB1、終濃度為O. 25mg/L IBA (吲哚丁酸)、終濃度為25g · L—1蔗糖和終濃度為7. Og · L—1瓊脂,用水補(bǔ)足體積。所述培養(yǎng)基組中的各種培養(yǎng)基的pH值均為5. 8。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種愈傷組織的繼代保存的方法。本發(fā)明提供的方法,包括如下步驟將愈傷組織按照上述的創(chuàng)制結(jié)縷草再生愈傷組織系中的第三次繼代培養(yǎng)2次,得到繼代產(chǎn)物;再將所述繼代產(chǎn)物按照上述創(chuàng)制結(jié)縷草再生愈傷組織系的方法中的第一次繼代培養(yǎng)、第二次繼代培養(yǎng)、第三次繼代培養(yǎng)依次進(jìn)行 培養(yǎng);所述愈傷組織具體為上述創(chuàng)制結(jié)縷草再生愈傷組織系中結(jié)縷草再生愈傷組織。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明,本發(fā)明提供了一種創(chuàng)制結(jié)縷草高頻再生系的方法,本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1)由于結(jié)縷草屬異花授粉植物,不同種子可能是不同的基因型,植物再生能力很大程度上依賴于其自身的基因型,本發(fā)明通過篩選日本結(jié)縷草品種,以單粒種子為外植體,分別誘導(dǎo)出不同的愈傷系,經(jīng)培養(yǎng)基配比組合和多次干化繼代培養(yǎng),篩選出分化能力強(qiáng)的愈傷系,每一系增殖的大量高頻再生愈傷組織均為同質(zhì),可以最大程度上將具有較強(qiáng)再生能力的基因型保留下來,淘汰再生能力弱的基因型;2)由于結(jié)縷草品種內(nèi)基因型復(fù)雜,不同基因型的表型可能有差異,建立單獨(dú)的高頻再生系而不是混系,有利于轉(zhuǎn)基因后代或變異株系與親本在遺傳背景一致的條件下進(jìn)行比較分析;3)本發(fā)明采用的專用培養(yǎng)基制備高頻再生愈傷系,該高頻再生愈傷系分化率高,且保存時(shí)間長。
圖I為結(jié)縷草高頻再生系的誘導(dǎo)培養(yǎng)圖2為結(jié)縷草高頻再生系的繼代培養(yǎng)圖3為結(jié)縷草高頻再生系的掃描電鏡鑒定圖4為結(jié)縷草高頻再生系的分化和生根培養(yǎng)圖5為結(jié)縷草高頻再生系的創(chuàng)制過程
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的結(jié)縷草以日本結(jié)縷草品種‘Qingdao’(克勞沃集團(tuán)http://www.bjclover. com/center/aboutcpl. asp,產(chǎn)品目錄號(hào)zj-011-02)為例,也可以換為其他所有結(jié)縷草屬(Zoysia Willd.)植物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了影響結(jié)縷草植株再生率的關(guān)鍵因素是如何高效地將非胚性愈傷組織調(diào)整為胚性愈傷組織。具有同一基因型、再生力強(qiáng)的胚性愈傷組織,在本專利稱之為“高頻再生愈傷組織系”。
下述實(shí)施例中液體MS培養(yǎng)基中的組分如表I所示,液體MS培養(yǎng)基為將表I的溶質(zhì)按所示的終濃度均溶于水配制表I為MS培養(yǎng)基中的組分
權(quán)利要求
1.一種創(chuàng)制結(jié)縷草再生愈傷組織系的方法,包括如下步驟將單粒結(jié)縷草種子依次經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)、第一次繼代培養(yǎng)、第二次繼代培養(yǎng)、第三次繼代培養(yǎng),得到結(jié)縷草再生愈傷組織系O
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)、所述第一次繼代培養(yǎng)、所述第二次繼代培養(yǎng)和所述第三次繼代培養(yǎng)采用的培養(yǎng)材料均源自同一個(gè)種子; 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)為將所述結(jié)縷草種子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng),得到誘導(dǎo)愈傷組織; 所述第一次繼代培養(yǎng)為將所述誘導(dǎo)愈傷組織在第一代繼代培養(yǎng)基中第一代繼代培養(yǎng),得到第一次愈傷組織; 所述第二次繼代培養(yǎng)為將所述第一次愈傷組織在第二代繼代培養(yǎng)基中第二代繼代培養(yǎng),得到第二次愈傷組織; 所述第三次繼代培養(yǎng)為將所述第三次愈傷組織在第三代繼代培養(yǎng)基中第三代繼代培養(yǎng),得到再生愈傷組織系; 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在液體MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度2mg/L的2,4-D、終濃度的O. 15mg/L 6-BA、終濃度30g · Γ1的蔗糖、終濃度7. Og · Γ1的瓊脂、終濃度O.5g · Γ1的水解酪蛋白、終濃度Img · Γ1的VB1、終濃度Img · Γ1的VB2,用水補(bǔ)足體積;所述第一代繼代培養(yǎng)基為在液體MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為lmg/L的2,4-D、終濃度為O. 2mg/L的6-BA、終濃度為O. 2mg/L的ΑΒΑ、終濃度為40g -Γ1的蔗糖、終濃度為9. Og · Γ1的瓊脂、終濃度為O. 5g · Γ1的水解酪蛋白、終濃度為Img · Γ1的VB1和終濃度為Img · L—1的VB2,用水補(bǔ)足體積; 所述第二代繼代培養(yǎng)基為將所述第一次繼代培養(yǎng)基中的蔗糖終濃度調(diào)整為35g · L—1、瓊脂終濃度調(diào)整為8. Og · L—1,其他成分和濃度不變,用水補(bǔ)足體積; 所述第三代繼代培養(yǎng)基為將所述第二次繼代培養(yǎng)基中的蔗糖終濃度調(diào)整為30g · L'瓊脂終濃度調(diào)整為7. Og · L—1,其他成分和濃度不變,用水補(bǔ)足體積。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法,其特征在于 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為溫度24-26°C、光照強(qiáng)度1000-3000Umol JiT2iT1下暗培養(yǎng)I個(gè)月; 所述第一次、第二次、第三次繼代培養(yǎng)條件均為溫度24-26°C、黑暗培養(yǎng)20天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于 在所述第一次繼代培養(yǎng)后和所述第二次繼代培養(yǎng)前還包括如下步驟選取第一次繼代愈傷組織中的胚性愈傷組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于所述結(jié)縷草種子為去穎后的結(jié)縷草種子。
6.一種制備結(jié)縷草再生植株的方法,包括如下步驟在權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中的方法中的第三次繼代培養(yǎng)后,將所述結(jié)縷草再生愈傷組織系依次經(jīng)分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng),得到結(jié)縷草再生植株; 所述分化培養(yǎng)為將所述結(jié)縷草再生愈傷組織系在分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng),得到生芽愈傷組織; 所述分化培養(yǎng)基為在液體MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為l.Omg/L 6-BA、終濃度為0. 2mg/L KT、終濃度為0. 5mg/L ZT、終濃度為30g · L—1蔗糖、終濃度為7. Og · Γ1瓊脂、終濃度為O. 5g · Γ1水解酪蛋白,終濃度為Img · L4VB1、終濃度為Img · L4VB2,用水補(bǔ)足體積; 在所述分化培養(yǎng)中,所述結(jié)縷草再生愈傷組織系的直徑大小均具體為O. 3-0. 5cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于 所述生根培養(yǎng)為將所述生芽愈傷組織在所述生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng),得到結(jié)縷草再生植株; 所述生根培養(yǎng)基為在液體1/2MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為10mg/L VB1、終濃度為O. 25mg/L IBA、終濃度為25g -T1蔗糖和終濃度為7. Og-Γ1瓊脂,用水補(bǔ)足體積。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法,其特征在于 所述分化培養(yǎng)和所述生根培養(yǎng)的條件均如下溫度24-26°C、光照強(qiáng)度1000-3000umolHT2s-1及光照14h/黑暗IOh的條件下培養(yǎng)I個(gè)月。
9.一種制備結(jié)縷草再生植株的培養(yǎng)基組,包括誘導(dǎo)培養(yǎng)基、第一次繼代培養(yǎng)基、第二次繼代培養(yǎng)基和第三次繼代培養(yǎng)基; 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在液體MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度2mg/L的2,4-D、終濃度的O. 15mg/L 6-BA、終濃度30g · Γ1的蔗糖、終濃度7. Og · Γ1的瓊脂、終濃度O.5g · Γ1的水解酪蛋白、終濃度Img · Γ1的VB1、終濃度Img · Γ1的VB2,用水補(bǔ)足體積;所述第一代繼代培養(yǎng)基為在液體MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為lmg/L的2,4-D、終濃度為O. 2mg/L的6-BA、終濃度為O. 2mg/L的ΑΒΑ、終濃度為40g -Γ1的蔗糖、終濃度為9. Og · Γ1的瓊脂、終濃度為O. 5g · Γ1的水解酪蛋白、終濃度為Img · Γ1的VB1和終濃度為Img · L—1的VB2,用水補(bǔ)足體積; 所述第二代繼代培養(yǎng)基為將所述第一次繼代培養(yǎng)基中的蔗糖終濃度調(diào)整為35g · L—1、瓊脂終濃度調(diào)整為8. Og · L—1,其他成分和濃度不變,用水補(bǔ)足體積; 所述第三代繼代培養(yǎng)基為將所述第二次繼代培養(yǎng)基中的蔗糖終濃度調(diào)整為30g · L'瓊脂終濃度調(diào)整為7. Og · L—1,其他成分和濃度不變,用水補(bǔ)足體積; 所述培養(yǎng)基組還具體包括分化培養(yǎng)基;所述分化培養(yǎng)基為在液體MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為I. Omg/L 6-BA、終濃度為O. 2mg/L KT、終濃度為O. 5mg/LZT、終濃度為30g · L—1蔗糖、終濃度為7. Og · L—1瓊脂、終濃度為O. 5g · L—1水解酪蛋白,終濃度為Img · T1VB1、終濃度為Img · T1VB2,用水補(bǔ)足體積; 所述培養(yǎng)基組還進(jìn)一步具體包括生根培養(yǎng)基,所述生根培養(yǎng)基為在液1/2MS培養(yǎng)基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為10mg/L VB1、終濃度為O. 25mg/L IBA、終濃度為25g · Γ1蔗糖和終濃度為7. Og · Γ1瓊脂,用水補(bǔ)足體積; 所述培養(yǎng)基組中的各種培養(yǎng)基的PH值均具體為5. 8。
10.一種愈傷組織的繼代保存的方法,包括如下步驟將愈傷組織按照權(quán)利要求1-5中任一所述的方法中的第三次繼代培養(yǎng)2次,得到繼代產(chǎn)物;再將所述繼代產(chǎn)物按照權(quán)利要求1-5中任一所述的方法中的第一次繼代培養(yǎng)、第二次繼代培養(yǎng)、第三次繼代培養(yǎng)依次進(jìn)行培養(yǎng); 所述愈傷組織具體為權(quán)利要求1-5中任一所述的方法中結(jié)縷草再生愈傷組織。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種創(chuàng)制結(jié)縷草高頻再生系的方法。本發(fā)明提供一種創(chuàng)制結(jié)縷草高頻再生系的方法,包括如下步驟將單粒結(jié)縷草種子依次經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)、第一次繼代培養(yǎng)、第二次繼代培養(yǎng)、第三次繼代培養(yǎng),得到結(jié)縷草高頻再生系。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明,本發(fā)明提供了一種創(chuàng)制結(jié)縷草高頻再生愈傷組織系或再生植株及專用培養(yǎng)基,本發(fā)明通過篩選日本結(jié)縷草品種,以單粒種子為外植體,分別誘導(dǎo)出不同的愈傷系,經(jīng)培養(yǎng)基配比組合和多次干化繼代培養(yǎng),篩選出分化能力強(qiáng)的愈傷系,每一系增殖的大量高頻再生愈傷組織均為同質(zhì)。最終,建立一種創(chuàng)制結(jié)縷草高頻再生系的方法,為提高結(jié)縷草組織培養(yǎng)再生率和遺傳轉(zhuǎn)化效率提供實(shí)用方法。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102907322SQ20121042899
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者李瑞芬, 張杰偉, 魏建華, 王宏芝, 孫振元 申請(qǐng)人:北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心