一種用于胰腺癌干細胞有效藥物篩選的動物模型的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及實驗研究動物模型制備技術，涉及一種用于胰腺癌干細胞有效藥物篩選的動物模型的制備方法，具體涉及一種SW1990胰腺癌干細胞動物模型的制備及鑒定，用于對腫瘤干細胞（CSC）有效藥物篩選及機理研究。本發(fā)明動物模型富集了胰腺癌干細胞，達到了可用于胰腺癌干細胞研究的動物模型。與SW1990胰腺癌荷瘤裸鼠模型相比，本發(fā)明通過應用吉西他濱干預來富集腫瘤干細胞，干細胞相關標志物及核轉(zhuǎn)錄因子表達顯著性上升，為深入研究胰腺癌干細胞機及篩選干細胞有效藥物提供了適宜的實驗平臺。
【專利說明】一種用于胰腺癌干細胞有效藥物篩選的動物模型的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及實驗研究動物模型制備技術，涉及一種用于胰腺癌干細胞有效藥物篩選的動物模型的制備方法，具體涉及一種SW1990胰腺癌干細胞動物模型的制備及鑒定，用于對腫瘤干細胞(CSC)有效藥物篩選及機理研究。
【背景技術】
[0002]據(jù)報道，我國胰腺癌發(fā)病率近年來呈上升趨勢，大多數(shù)病例確診時已屬晚期。據(jù)報道，80%的患者在確診時已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移或局部浸潤，生存期4~6個月，5年生存率不足5%。腫瘤的耐藥、復發(fā)與轉(zhuǎn)移是胰腺癌治療失敗的主要原因，目前尚無有效的治療手段，尋求新的治療方案顯得尤為重要。
[0003]腫瘤干細胞(CSC)是腫瘤組織中小部分具有自我更新和多向分化的細胞亞群，它決定著腫瘤的形成和發(fā)展。眾多研究證實了 CSC與腫瘤的耐藥、復發(fā)及轉(zhuǎn)移密切相關，針對CSC的靶向治療可使腫瘤治療更加徹底。然而，對于CSC有效藥物的篩選及機理研究，目前尚缺乏特有的、科學可行的胰腺癌干細胞動物模型，建立胰腺癌干細胞動物模型是對CSC有效藥物篩選及機理研究最為關鍵的一步。
[0004]縱觀國內(nèi)外胰腺癌干細胞動物模型，2009年Antonio等利用吉西他濱干預富集并建立了人胰腺癌組織干細胞皮下荷瘤裸鼠模型。近兩年的研究采用最多的是用流式分選的方法獲取CSC，直接將CSC皮下移植建立相應的動物模型。但是，由于CSC極易發(fā)生分化，化療體內(nèi)富集CSC更符合臨床表現(xiàn)。國內(nèi)目前尚沒有胰腺癌干細胞動物模型，導致CSC有效藥物篩選缺少良好的實驗平臺。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種可用于胰腺癌干細胞有效藥物篩選的動物模型，能為抗胰腺癌干細胞有效藥物篩選的研究建立良好的實驗平臺，有利于對胰腺癌干細胞與腫瘤耐藥、復發(fā)及轉(zhuǎn)移的機理進行深入研究。
[0006]本發(fā)明利用吉西他濱干預SW1990胰腺癌皮下荷瘤裸鼠模型，富集腫瘤干細胞，從而建立SW1990胰腺癌干細胞荷瘤裸鼠模型。本發(fā)明采用人胰腺癌細胞SW1990細胞系作為種植細胞，所述的人胰腺癌SW1990細胞株來源于分化II級的胰腺腺癌的脾臟轉(zhuǎn)移瘤，建株于1978年，ATCC號:CRL-2712。本發(fā)明有以下特點:在吉西他濱75mg/Kgdl，d5，d9干預3次后瘤塊體積明顯小于SW1990胰腺癌荷瘤裸鼠模型(P〈0.05);胰腺癌干細胞模型組的裸鼠顯瘦弱，體重明顯下降；瘤塊細胞腫瘤干細胞相關標志物，如:⑶24，⑶44，ALDH1A1,⑶133極核轉(zhuǎn)錄因子，如:S0X2，0CT4，Nanog在蛋白水平顯著性增加，核轉(zhuǎn)錄因子，如:S0X2，0CT4，Nanog在mRNA水平均顯著性上升?！緦＠綀D】

【附圖說明】[0007]圖1為本發(fā)明即SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠瘤體生長曲線不意圖
[0008]圖2為本發(fā)明即SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠體重的變化示意圖
[0009]圖3為本發(fā)明即SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠的皮下瘤塊照片
[0010]圖4為本發(fā)明即SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠皮下瘤塊干細胞相關指標示意圖
[0011]圖5為本發(fā)明即SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠皮下瘤塊干細胞相關標志物mRNA水平的變化示意圖。
【具體實施方式】
[0012]實例I建立胰腺癌干細胞動物模型
[0013]模型建立:將濃度為IOVml的SW1990單細胞懸液在無菌條件下用Iml注射器接種于裸鼠左腋下皮下，接種量為0.2ml/只，共20只。待皮下瘤塊長至0.1mm3時，將裸鼠隨機分為吉西他濱富集組和生理鹽水組。吉西他濱富集組dl，d5，d9先后用濃度為75mg/Kg的吉西他濱進行腹腔注射，0.2ml/只；生理鹽水組dl，d5，d9腹腔注射生理鹽水0.2ml/只。第10天處死兩組裸鼠，取瘤。
[0014]本發(fā)明裸鼠顯消瘦，但活動及飲食未受影響，體重有所減輕；皮下瘤塊體積在干預后較起始點0.1mm3略有增大，但是明顯小于生理鹽水組(P〈0.05)。瘤塊體積的縮小表明吉西他濱將普通腫瘤細胞殺死，CSC因?qū)魉麨I耐藥而幸存下來，獲得了富集。見圖1，圖2，圖3。 [0015]實例2胰腺癌干細胞動物模型CSC明顯升高
[0016]l.ffestern blot法檢測本發(fā)明胰腺癌干細胞相關標志物蛋白水平的變化
[0017]Western blot組織總蛋白的制備及濃度測定:取IOOmg腫瘤組織,充分研磨，PBS洗滌離心沉淀，5倍體積4% SDS重懸、攪勻，沸水浴中加熱10分鐘，反復吹打剪切，室溫1000Orpm離心10分鐘,上清液移至另一管，即為提取好的蛋白質(zhì)，Lowry法檢測蛋白質(zhì)濃度，從標準曲線上讀出抽提蛋白質(zhì)對應的吸光值和濃度。Western blotting:固定:蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)并從凝膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；封閉:取下PVDF膜，在盛有封閉液的玻璃平皿中室溫平緩搖動I~2小時后，4°C過夜；與第一抗體結(jié)合；與第二抗體結(jié)合；顯色:將PVDF膜放入檢測緩沖液中平衡5分鐘，在2ml檢測緩沖液中加入40 μ I底物，按膜面積0.lml/cm2的量加人玻璃平皿中，放入PVDF膜，放入塑料袋中，并塑封，暗中顯色lh，棄去顯色液，將膜用TE洗滌2次，在TE中浸泡。觀察并分析實驗結(jié)果。
[0018]結(jié)果表明本發(fā)明胰腺癌腫瘤干細胞相關標志物⑶24，⑶44，ALDH1A1,⑶133，0CT4,Nanog, S0X2等在蛋白水平有不同程度的上升。見圖4。
[0019]2.Real-time PCR法檢測本發(fā)明胰腺癌干細胞相關標志物mRNA水平的變化總RNA的提取:參照GENERAY公司總RNA抽提試劑盒(Trizol-離心柱型)使用說明進行RNA抽提后，取1μ I RNA溶液，用雙蒸水稀釋至100μ 1，經(jīng)紫外分光光度儀檢測其0D260及0D280并計算其RNA濃度(C = 0D260X40X稀釋倍數(shù)X 10 — 3，單位:μ g/μ I);用DEPC水調(diào)整RNA濃度至I μ g/ μ 1，置一 70°C冰箱保存。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA (RT):具體操作參照Fermentas^RevertAidTM^irst strand cDNA synthesis Kit，，，_20oC保存。SYBR GREEN法實時半定量 RT-PCR:realtime PCR 反應體系:SYBR premix (2x) 12.5ul，上游引物(IOumol/L) 0.5ul，下游引物(10umol/L) 0.5ul，模板 cDNA 2.0ul，DEPC 水 9.5ul，總體積 25ul。PCR反應條件:95°C熱啟動15分鐘之后，94°C變性30秒，53°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，共40個循環(huán)，至4°C結(jié)束。
[0020] P0U5F1 (0CT4)引物 F:5，-GAGCAACTCCGATGGGGCCT-3，
[0021 ]R:5’-TGTCCTGGGACTCCTCCGGGT-3’
[0022]Nanog 引物 F: 5，-GCAATGGTGTGACGCAGAAGGC-3，
[0023]R:5’-TGGGTCTGGTTGCTCCAGGTTG-3’
[0024]S0X2 引物 F: 5，-GGGGGAAAGTAGTTTGCTGCCTCT-3’
[0025]R:5’-TGCCGCCGCCGATGATTGTT-3’
[0026]GLII 引物 F: 5’ -AGGGAGTGCAGCCAATACAG-3’
[0027]R:5’-ATTGGCCGGAGTTGATGTAG-3’
[0028]結(jié)果表明本發(fā)明胰腺 癌腫瘤干細胞相關標志物0CT4，Nanog, S0X2, GLIl在mRNA水平明顯上升。見圖5。
【權利要求】
1.一種用于胰腺癌干細胞有效藥物篩選的動物模型的制備方法，其特征在于:首先應用胰腺癌細胞株SW1990皮下移植建立SW1990胰腺癌荷瘤裸鼠模型，再應用吉西他濱干預富集腫瘤干細胞，動物模型瘤塊體積明顯小于SW1990胰腺癌荷瘤裸鼠模型；裸鼠瘦弱，體重明顯下降；瘤塊細胞腫瘤干細胞相關標志物:⑶24，⑶44，ALDH1A1，⑶133及核轉(zhuǎn)錄因子如S0X2，0CT4, Nanog在蛋白及mRNA水平均顯著性上升。
2.根據(jù)權利要求1所述的動物模型的制備，其特征在于:采用人胰腺癌細胞SW1990細胞系作為種植細胞，ATCC號:CRL-2712。
3.根據(jù)權利要求1所述的動物模型的制備，其特征在于:吉西他濱干預富集腫瘤干細胞是指用濃度為75mg/Kg 的吉西他濱腹腔注射dl，d5，d9干預3次。
【文檔編號】A61D1/00GK103800089SQ201210437188
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月5日 優(yōu)先權日:2012年11月5日
【發(fā)明者】劉魯明, 潘巖, 花永強 申請人:復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院