專利名稱：給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法。
背景技術(shù)：
番爺黃化曲葉病韋(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV),屬于雙生病韋科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)病毒，因該屬病毒在自然條件下只能由煙粉風(fēng)(Bemisia tabaci)以持久方式傳播,又被稱為粉風(fēng)傳雙生病毒。由于氣候變曖和農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的改變，番茄黃化曲葉病毒的傳毒介體煙粉虱近幾年在北方地區(qū)大爆發(fā)，使得番茄黃化曲葉病毒近年來在我國各地空前爆發(fā)，自南向北迅速擴(kuò)散和蔓延，給番茄生產(chǎn)
造成嚴(yán)重危害。所以，番茄黃化曲葉病毒病的防治已是刻不容緩?？共∑贩N的應(yīng)用是植物病毒病最有效防治措施之一，不同的番茄品種對(duì)病毒病的抗性程度不一，了解品種的抗、耐病程度，對(duì)現(xiàn)有品種的利用、抗性材料的篩選和抗病品種的選育都具有重要的意義。而給番茄接種番茄黃化曲葉病毒是鑒定選育番茄抗病品種的前提。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法。本發(fā)明所提供的給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法，包括如下步驟將生長至4片真葉的待鑒定番茄植株放入40目網(wǎng)袋內(nèi)，一個(gè)網(wǎng)袋內(nèi)放入一株所述待鑒定番茄植株，將帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱放入所述網(wǎng)袋內(nèi)，每個(gè)所述網(wǎng)袋內(nèi)放入6頭所述帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱進(jìn)行接種傳毒，完成番茄黃化曲葉病毒的接種。其中，所述方法在室內(nèi)進(jìn)行。上述方法中，所述室內(nèi)的溫度可為25_27°C，空氣的相対濕度可為50-60%，光照條件可為每天14小時(shí)光照10小時(shí)黑暗，所述光照的強(qiáng)度為9千勒克司。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明給生長至4片真葉的番茄植株以6頭/株的蟲ロ密度單株接種番茄黃化曲葉病毒，對(duì)番茄黃化曲葉病毒敏感的植株在接種5-7天就初現(xiàn)發(fā)病癥狀，2周后發(fā)病率達(dá)100%。6頭/株的蟲ロ密度單株接種病毒，可以避免由于粉虱頭數(shù)少接種后發(fā)病緩慢和發(fā)病率偏低以及粉虱頭數(shù)多造成蟲害的影響；4片真葉時(shí)進(jìn)行煙粉虱接種病毒，可以避免由于幼苗太小，煙粉虱在植株上繁殖造成植株生長遲緩，影響病毒病的發(fā)展和癥狀的觀察。番茄抗病材料的選育及其準(zhǔn)確有效的抗性鑒定方法是番茄抗病育種的關(guān)鍵，此方法在人工控制的溫濕度及設(shè)施條件下，采用煙粉虱接種侵染技術(shù)，使用大小均勻一致的番茄植株及單位植株上統(tǒng)ー的蟲ロ密度，應(yīng)用發(fā)病時(shí)間、發(fā)病率及病情指數(shù)三項(xiàng)參數(shù)，結(jié)合PCR及ELISA兩項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)不同番茄品種抗番茄黃化曲葉病毒的抗、耐病水平做了全面科學(xué)的評(píng)鑒，對(duì)抗性材料的篩選和抗病品種的選育具有科學(xué)的指導(dǎo)意義。


圖I為各番茄品種中病毒含量的ELISA檢測(cè)結(jié)果。圖示為每個(gè)品種的三次檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的基本材料和方法如下I. TYLCV毒原及其保存番茄毒原植株來源于北京房山區(qū)韓村河，經(jīng)PCR檢測(cè)鑒定為感染TYLCV。鑒定后的毒原植株移栽于直徑為15cm的塑料盆內(nèi)，在養(yǎng)苗籠中活體培養(yǎng)保存。(養(yǎng)苗籠長40cmX寬40cmX高70cm的鋼制框架，底層墊塑料板，四周及頂層罩以40目紗網(wǎng)，該養(yǎng)苗籠也作為·養(yǎng)蟲籠用于煙粉風(fēng)的飼養(yǎng)、同時(shí)也用于傳毒后的番爺植株的培養(yǎng))。該番茄黃化曲葉病毒(周濤等.北京地區(qū)番茄黃化曲葉病毒病的鑒定及防治對(duì)策.植物保護(hù).2010年第02期)，公眾可從野外采集，也可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。2. Q型煙粉虱的飼養(yǎng)Q型煙粉風(fēng)均米自房山韓村河，飼養(yǎng)于溫室養(yǎng)蟲籠內(nèi)的棉花寄主上。飼養(yǎng)溫度26±1°C，相対濕度50% 60%，光照周期每天14小時(shí)光照10小時(shí)黑暗。該Q型煙粉虱(徐艷霞等.番茄黃化曲葉病毒對(duì)B型和Q型煙粉虱雌蟲體長及卵大小的影響.中國蔬菜.2012年第10期)，公眾可從野外采集，也可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。3.帶毒煙粉虱的獲得將棉花上飼養(yǎng)的Q型煙粉風(fēng)用捕蟲器轉(zhuǎn)移到保存有毒原植株的養(yǎng)苗籠內(nèi)。在26°C、相対濕度50% 60%，每天16小時(shí)光照8小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)3天，使原先不帶毒的Q型煙粉虱感染TYLCV，同時(shí)經(jīng)PCR檢測(cè)鑒定確定Q型煙粉虱感染TYLCV，成為帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱。4.番茄黃化曲葉病毒病的調(diào)查番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)病癥狀按嚴(yán)重程度劃分為0、0. 5、1、3、5、7、9共7個(gè)等級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0級(jí)不發(fā)病，無癥狀；0. 5級(jí)新葉葉緣輕微黃化或輕花葉；I級(jí)新葉葉緣明顯黃化，約1/3葉片黃化，葉變小；3級(jí)1/3-1/2葉片黃化，頂稍葉片進(jìn)ー步變小(約1/2正常葉)，病株比健株矮約1/3 ；5級(jí)1/2-2/3葉片黃化，頂稍葉片變得更小(約1/3正常葉)，病株比健株矮約1/2 ；7級(jí)整個(gè)植株葉片黃化、變小，病株比健株矮約1/2 — 3/4 ；9級(jí)植株枯死或接近枯死；發(fā)病率及病情指數(shù)公式發(fā)病率=發(fā)病的植株數(shù)/調(diào)查總植株數(shù)X 100% ；
病情指數(shù)=E (各級(jí)病株數(shù)X該病級(jí)值)/ (調(diào)查總株數(shù)X最高級(jí)數(shù))X 100。5. PCR檢測(cè)鑒定為感染TYLCV的方法如下首先提取番茄基因組總DNA或Q型煙粉虱的基因組總DNA作為PCR反應(yīng)體系的模板；PCR 引物序列為TYLCV-R :5，-CCAATAAGG CGT AAG CGT GTA GAC-3’(序列 1)；TYLCV-F 5’-ACG CAT GCC TCT AAT CCA GTG TA-3’(序列2)，根據(jù)TYLCV基因組特異性保守序列設(shè)計(jì)；PCR 反應(yīng)程序94で 2min ；94°C 30sec,55°C 45sec,72°C 30sec，共 32 個(gè)循環(huán)；72で10min，4°C保存。反應(yīng)完畢后，從PCR產(chǎn)物中取5 yl，以I. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，擴(kuò)增的目標(biāo)序列大小應(yīng)為543bp，如得到543bp的條帶，該番茄植株感染TYLCV。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、煙粉虱傳毒時(shí)間(幼苗苗齡)的優(yōu)化以對(duì)番爺黃化曲葉病毒敏感的番爺品種仙客6號(hào)作為測(cè)試品種來確定煙粉風(fēng)傳毒的最佳時(shí)間，具體的實(shí)驗(yàn)方法如下番爺種子播種于直徑25cm的花盆中，待番爺?shù)贗片真葉長出時(shí),移栽于直徑約IOcm的塑料杯內(nèi)，并將其置于防蟲網(wǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，以避免受煙粉虱或病毒的侵染，待生長至2片、3片、4片真葉時(shí)分別用于煙粉虱傳毒實(shí)驗(yàn)。將番茄小苗移栽于直徑約IOcm的塑料杯，緩苗5天左右，生長至2片、3片、4片真葉片時(shí)，每個(gè)處理挑選出20 30株生長狀況良好，株高一致的植株，放入用于煙粉虱傳毒的微型紗籠內(nèi)(傳毒微型紗籠由40目尼龍紗網(wǎng)、皮筋等材料制作而成，做成袋子的形狀，以罩住番茄幼苗，粉虱可以從袋子下部吹入，再通過皮筋扎緊)，每個(gè)微型紗籠放入I株幼苗，再用捕蟲器捕捉6頭帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱吹入微型籠內(nèi)，進(jìn)行單株接種傳毒，然后將傳毒后的番茄幼苗放入養(yǎng)苗籠內(nèi)用常規(guī)方法培養(yǎng)。詳細(xì)觀察和記錄番茄幼苗的蟲害癥狀及番茄黃化曲葉病毒病癥狀的出現(xiàn)時(shí)間和病情發(fā)展情況。同時(shí)設(shè)20株未經(jīng)傳毒處理的對(duì)照。其中，整個(gè)傳毒過程均在室內(nèi)進(jìn)行，室內(nèi)的溫度為25_27°C，空氣的相対濕度為50-60%，光照條件為每天14小時(shí)光照10小時(shí)黑暗，光照的強(qiáng)度為9千勒克司。結(jié)果表明，煙粉虱傳毒給2片真葉的仙客6號(hào)幼苗吋，2周后，仙客6號(hào)的發(fā)病率為100%，但有明顯的蟲害癥狀，植株生長不良；煙粉虱傳毒給仙客6號(hào)3片真葉幼苗吋，2周后，仙客6號(hào)的發(fā)病率為100%,但有輕微蟲害癥狀,植株生長及病毒病癥狀部分受到蟲害影響；煙粉虱傳毒給仙客6號(hào)4片真葉幼苗吋，2周后，仙客6號(hào)的發(fā)病率為100%，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的蟲害癥狀，呈現(xiàn)典型的番茄黃化曲葉病毒病癥狀。未經(jīng)傳毒處理的對(duì)照均生長正常，無蟲害癥狀也無番茄黃化曲葉病毒病癥狀。實(shí)施例2、煙粉虱傳毒蟲ロ密度的優(yōu)化以對(duì)番爺黃化曲葉病毒敏感的番爺品種仙客6號(hào)作為測(cè)試品種來確定煙粉風(fēng)傳毒的最佳蟲ロ密度，具體的實(shí)驗(yàn)方法如下I、人工接種帶毒煙粉虱于番茄幼苗番茄種子播種于直徑25cm的花盆中，待番茄第I片真葉張出吋，按品種劃分，分別移栽于直徑約IOcm的塑料杯內(nèi)，并將其置于防蟲網(wǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，以避免受煙粉虱或病毒的侵染，待生長至4片真葉時(shí)用于煙粉虱傳毒實(shí)驗(yàn)。
將番茄小苗移栽于直徑約IOcm的塑料杯，緩苗5天左右，生長至4片真葉片時(shí)，挑選出100株生長狀況良好,株高一致的植株,放入用于煙粉風(fēng)傳毒的微型紗籠內(nèi)(傳毒微型紗籠由40目尼龍紗網(wǎng)、皮筋等材料制作而成，做成袋子的形狀，以罩住番茄幼苗，粉虱可以從袋子下部吹入，再通過皮筋扎緊)，每個(gè)微型紗籠放入I株幼苗，再用捕蟲器捕捉帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱吹入微型籠內(nèi)，進(jìn)行單株接種傳毒。將這100株幼苗(每株幼苗的總?cè)~面積為8平方厘米)分為5個(gè)處理，每個(gè)處理均為25株。處理I中，每個(gè)微型紗籠均分別吹入2頭帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱；處理2中，每個(gè)微型紗籠均分別吹入4頭帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱；處理3中，每個(gè)微型紗籠均分別吹入6頭帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱；處理4中，每個(gè)微型紗籠均分別吹入8頭帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱；處理5為未經(jīng)傳毒處理的對(duì)照，每個(gè)微型紗籠均不吹入煙粉虱。傳毒后，將番茄幼苗放入養(yǎng)苗籠內(nèi)用常規(guī)方法培養(yǎng)。詳細(xì)觀察和記錄番茄幼苗的煙粉虱蟲害癥狀和番茄黃化曲葉病毒病癥狀的出現(xiàn)時(shí)間和病情發(fā)展情況。其中，整個(gè)傳毒過程均在室內(nèi)進(jìn)行，室內(nèi)的溫度為25_27°C，空氣的相対濕度為50-60%，光照條件為每天14小時(shí)光照10小時(shí)黑暗，光照的強(qiáng)度為9千勒克司?！そY(jié)果表明，處理1，當(dāng)使用2頭煙粉虱傳毒給4片真葉的仙客6號(hào)幼苗吋，2周后，仙客6號(hào)的發(fā)病率較低，僅為50%，沒有可見的蟲害癥狀；處理2，當(dāng)使用4頭煙粉虱傳毒給4片真葉的仙客6號(hào)幼苗吋，2周后，仙客6號(hào)的發(fā)病率也較低，僅為75%，沒有明顯的蟲害癥狀；處理3，當(dāng)使用6頭煙粉虱傳毒給4片真葉的仙客6號(hào)幼苗吋，2周后，仙客6號(hào)的發(fā)病率為100%，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的蟲害癥狀，不影響病毒病病級(jí)的判斷；處理4，當(dāng)使用8頭煙粉虱傳毒給4片真葉的仙客6號(hào)幼苗吋，2周后，仙客6號(hào)的發(fā)病率為100%，但有較明顯的蟲害癥狀發(fā)生，此時(shí)蟲害癥狀已經(jīng)可以影響到病毒病病級(jí)的判斷。未經(jīng)傳毒處理的對(duì)照均生長正常，無蟲害癥狀也無番茄黃化曲葉病毒病癥狀。實(shí)施例3、給番茄接種番茄黃化曲葉病毒鑒定番茄對(duì)番茄黃化曲葉病毒的抗性I.基本材料和方法I. I番茄品種及其幼苗培育如表I所示，包括仙客6號(hào)、金棚I號(hào)等13個(gè)番茄品種，番茄品種來自北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心；番茄種子播種于直徑25cm的花盆中，待番茄第I片真葉張出吋，按品種劃分，分別移栽于直徑約IOcm的塑料杯內(nèi)，并將其置于防蟲網(wǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，以避免受煙粉虱或病毒的侵染，待生長至4片真葉時(shí)用于煙粉虱傳毒實(shí)驗(yàn)。I. 2煙粉虱傳毒(人工接種帶毒煙粉虱于番茄幼苗)每個(gè)番茄品種挑選出30株生長狀況良好，株高一致的4片真葉植株，放入用于煙粉虱傳毒的微型紗籠內(nèi)(傳毒微型紗籠由40目尼龍紗網(wǎng)、皮筋等材料制作而成，做成袋子的形狀，以罩住番茄幼苗，粉虱可以從袋子下部吹入，再通過皮筋扎緊)，每個(gè)微型紗籠放入I株幼苗，再用捕蟲器捕捉6頭帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱吹入微型籠內(nèi)，進(jìn)行單株接種傳毒。然后將傳毒后的番茄幼苗按品種分類，放入養(yǎng)苗籠內(nèi)用常規(guī)方法培養(yǎng)。詳細(xì)觀察和記錄番茄幼苗病毒病癥狀的出現(xiàn)時(shí)間和病情發(fā)展情況，同時(shí)定期進(jìn)行番茄黃化曲葉病毒的PCR檢測(cè)。其中，整個(gè)傳毒過程均在室內(nèi)進(jìn)行，室內(nèi)的溫度為25_27°C，空氣的相対濕度為50-60%，光照條件為每天14小時(shí)光照10小時(shí)黑暗，光照的強(qiáng)度為9千勒克司。I. 3番爺病毒病的調(diào)查與分析番茄傳毒后，定期觀察不同番茄品種的初發(fā)病時(shí)間及病情發(fā)展情況，人工接種傳毒較田間自然傳毒發(fā)病快，感病品種在傳毒I周后個(gè)別植株表現(xiàn)出極其輕微發(fā)病癥狀。分別在傳毒I、2、3周后進(jìn)行PCR檢測(cè)，并在2周、3周后調(diào)查發(fā)病率及癥狀病級(jí)，計(jì)算其病情指數(shù)，同時(shí)在3周后對(duì)番茄各品種進(jìn)行病毒含量水平的ELISA檢測(cè)，確定TYLCV在不同品種中增值情況的差異。I. 4番茄黃化曲葉病毒病的PCR檢測(cè)煙粉虱接種傳毒I周后，感病品種通常已經(jīng)開始顯現(xiàn)很輕微的發(fā)病癥狀。所以，分別在傳韋I、2、3周后，各品種中隨機(jī)選擇5株，進(jìn)打PCR檢測(cè)，確定病韋對(duì)不冋品種感染時(shí)間的相對(duì)差距，以此判斷不同品種對(duì)TYLCV的易感性。 I. 5ELISA對(duì)番茄黃化曲葉病毒的定量檢測(cè)煙粉虱傳毒3周后，番茄開始開花坐果，株高已接近養(yǎng)苗籠頂部，不同番茄品種的病情發(fā)展及差異已經(jīng)十分明顯，這時(shí)對(duì)不同番茄品種進(jìn)行病毒含量水平的ELISA檢測(cè)，確定TYLCV在不同品種中增值的差異，作為判斷番茄抗、耐病程度的指標(biāo)之一。ELISA采用三抗體夾心檢測(cè)法(TAS-ELISA)。檢測(cè)的具體步驟參照安德珍生物技術(shù)(北京)有限公司ELISA試劑盒提供的步驟進(jìn)行。結(jié)果使用酶聯(lián)檢測(cè)儀在405nm光度下讀取吸光值0D405，吸光值0D405的大小可反映不同品種的病毒含量水平(見圖I)。2結(jié)果與分析2. I病毒的PCR檢測(cè)及番茄病情發(fā)展調(diào)查對(duì)13個(gè)番茄品種進(jìn)行了煙粉虱室內(nèi)人工接種傳毒試驗(yàn)，傳毒時(shí)間是番茄幼苗4片真葉時(shí)，煙粉風(fēng)接種6頭/株。人工接種后感病品種在傳韋I周后就表現(xiàn)出輕微發(fā)病癥狀。采用定期觀察的方式，對(duì)各番茄品種的發(fā)病時(shí)間和發(fā)病病級(jí)進(jìn)行了詳細(xì)記錄，計(jì)算其發(fā)病率及病情指數(shù)。同時(shí)采集各品種樣品，針對(duì)番茄黃化曲葉病毒進(jìn)行PCR分子鑒定，傳毒后不同時(shí)間進(jìn)行的PCR檢測(cè)及病情調(diào)查綜合結(jié)果見表I。表I不同番茄品種病情調(diào)查及PCR檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法，包括如下步驟將生長至4片真葉的待鑒定番爺植株放入40目網(wǎng)袋內(nèi)，一個(gè)網(wǎng)袋內(nèi)放入一株所述待鑒定番爺植株,將帶番爺黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱放入所述網(wǎng)袋內(nèi)，每個(gè)所述網(wǎng)袋內(nèi)放入6頭所述帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱進(jìn)行接種傳毒，完成番茄黃化曲葉病毒的接種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述方法在室內(nèi)進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述室內(nèi)的溫度為25-27°C，空氣的相對(duì)濕度為50-60%，光照條件為每天14小時(shí)光照10小時(shí)黑暗，所述光照的強(qiáng)度為9千勒克司。
4.權(quán)利要求1-3中任一所述的方法在鑒定番茄對(duì)番茄黃化曲葉病毒的抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法。本發(fā)明的給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法，包括如下步驟將生長至4片真葉的待鑒定番茄植株放入40目網(wǎng)袋內(nèi)，一個(gè)網(wǎng)袋內(nèi)放入一株所述待鑒定番茄植株，將帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱放入所述網(wǎng)袋內(nèi)，每個(gè)所述網(wǎng)袋內(nèi)放入6頭所述帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱進(jìn)行接種傳毒，完成番茄黃化曲葉病毒的接種。本發(fā)明給生長至4片真葉的番茄植株以6頭/株的蟲口密度單株接種番茄黃化曲葉病毒，對(duì)番茄黃化曲葉病毒敏感的植株在接種1周后就發(fā)病，2周后發(fā)病率達(dá)100%。
文檔編號(hào)A01G7/06GK102948336SQ20121045098
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者羅晨, 田兆豐, 劉偉成, 張帆, 盧向陽, 吳慧玲, 劉德文 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院