專利名稱：人參氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PgLHT及其編碼蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及 改良植物性狀，具體是促進(jìn)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、參與人參等植物脅迫反應(yīng)的相關(guān)基因及其蛋白和應(yīng)用。本發(fā)明在調(diào)節(jié)植物有機(jī)營養(yǎng)代謝、防御反應(yīng)和提高人參等植物的栽培品質(zhì)方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
人參(P. ginseng C. A. Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物,是名貴中藥材。但是人參是一種忌連作的植物，而且對(duì)土壤的營養(yǎng)等要求十分苛刻，其中氮對(duì)人參的生長非常重要。人參體內(nèi)的許多重要化合物均含有氮，如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、色素以及一些生長激素等。在人參的栽培和組織及細(xì)胞培養(yǎng)過程中，無機(jī)氮通常是其生長的限制因子，氮肥的不合理施用不僅對(duì)人參的品質(zhì)和產(chǎn)量造成不良的影響，而且還引起環(huán)境退化。因而氮素的施用以及植物對(duì)氮素的吸收代謝研究日益受到重視。隨著研究手段的改進(jìn)和研究的深入，有越來越多的證據(jù)表明植物也能吸收有機(jī)態(tài)氮。人參種植地氣候常年低溫，土壤有機(jī)質(zhì)通過微生物的礦化作用受抑制，因而土壤有機(jī)質(zhì)含量高，無機(jī)氮含量常常較低；有機(jī)氮含量常高于無機(jī)氮，因而有機(jī)氮對(duì)生長在這一地帶的植物和微生物非常重要。植物細(xì)胞質(zhì)膜控制著養(yǎng)分的進(jìn)出，有研究表明，細(xì)胞能通過質(zhì)膜上的特異性載體蛋白主動(dòng)吸收氨基酸。近年來對(duì)蓖麻、擬南芥質(zhì)膜的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究較多。此外，鹽脅迫也能誘導(dǎo)一些植物產(chǎn)生氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如鹽脅迫誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生兩個(gè)脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Rentsch, 1996),但I(xiàn)garashi等(2000)報(bào)道,水稻植株體內(nèi)的脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(OsProT)不受鹽脅迫的誘導(dǎo)。Boorer (1997)將主要在根中表達(dá)的擬南芥氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AAPs克隆到爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)來研究其對(duì)氨基酸的吸收，發(fā)現(xiàn)AAPs能轉(zhuǎn)運(yùn)中性、酸性和堿性等多種氨基酸。植物的第一個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(擬南芥AAP1/NAT2)的克隆和鑒定就是采用使植物cDNA在缺失某一氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酵母突變體上表達(dá)而進(jìn)行功能互補(bǔ)。因缺失某一氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的酵母不能吸收該氨基酸，而將植物的該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)虢湍钢斜磉_(dá)后該酵母就可以吸收該氨基酸。擬南芥AAP1/NAT2可轉(zhuǎn)運(yùn)多種氨基酸，但更傾向運(yùn)轉(zhuǎn)中性氨基酸，它含有486個(gè)氨基酸殘基，有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。其中N末端處于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，C末端面向細(xì)胞外，已知His337對(duì)AAP1/NAT2的結(jié)構(gòu)和功能是關(guān)鍵的氨基酸殘基，其改變將影響該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)氨基酸的運(yùn)轉(zhuǎn)(Bush等，1996 ;01&叩和仙811，1997)。AAP1/NAT2在植物組織中廣泛表達(dá)，其在體內(nèi)可能參與氮再分配。擬南芥的兩個(gè)脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ProTl、ProT2已被分離，ProTl在所有器官中表達(dá)，尤其是根、莖、花中表達(dá)量大，ProT2則遍布整個(gè)植株，水或鹽脅迫能誘導(dǎo)ProT2強(qiáng)烈表達(dá)，說明在脅迫條件下ProT2在氮分配方面起重要作用(Rentsch等，1996)。從擬南芥克隆得的賴氨酸、LHTl在所有組織中表達(dá)，在幼苗的根、幼葉、花、花粉以及長果中強(qiáng)烈表達(dá)，說明LHTl參與將賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到異養(yǎng)組織中。Bick等(1998)獲得蓖麻兩個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因RcAAPl、RcAAP2，在幼苗的子葉和根中表達(dá)量大，RcAAPl主要在根中表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄物分布于根尖多種類型細(xì)胞中，包括表皮、皮層，中柱細(xì)胞中也有較多的表達(dá)量，表明這兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能參與種子發(fā)芽和從土壤中吸收氨基酸，還可能參與側(cè)根發(fā)生或木質(zhì)部的氨基酸運(yùn)輸。研究亦發(fā)現(xiàn)蓖麻RcAAP3氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可參與積累氨基酸供蛋白質(zhì)合成，不僅寒冷地帶植物可以吸收氨基酸的植物，農(nóng)作物也可吸收氨基酸。Liu等(2010)研究發(fā)現(xiàn)擬南芥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtLHTl通過調(diào)節(jié)谷氨酰胺等氨基酸的動(dòng)態(tài)平衡參與SA介導(dǎo)的防御反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)植物有機(jī)營養(yǎng)代謝及其防御反應(yīng)方面具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠促進(jìn)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和參與人參等植物脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因序列如SEQ ID NO. I所示及其編碼的蛋白序列如SEQ ID NO. 2所示，為今后開發(fā)基
因工程產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為
本發(fā)明提供了一種人參氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PgLHT，其基因序列如SEQ ID NO. I所
/Jn ο本發(fā)明還提供了一種用于擴(kuò)增PgPDRl基因的簡并引物對(duì)，所述引物對(duì)如SEQ IDNO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。本發(fā)明還提供了含有PgLHT基因的重組載體，具體包括植物表達(dá)載體PBI121，即，將PgLHT基因克隆到空載體pBI121中，獲得重組載體pBI 121-PgLHT ;原核表達(dá)載體pET28a，S卩，將PgPDR2基因克隆到空載體pET28a中，獲得重組載體pET28a_PgLHT。PgLHT基因亦可克隆到其他空載體中，或制備成轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及重組菌。本發(fā)明還提供了 PgLHT基因在促進(jìn)人參氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及脅迫反應(yīng)中的應(yīng)用；PgLHT基因在人參育種中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種由SEQ ID NO. I所示PgLHT基因編碼的人參氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白的序列如SEQ ID NO. 2所不。本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO. 2所示蛋白在促進(jìn)人參氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及脅迫反應(yīng)中的應(yīng)用，以及該蛋白在人參育種中的應(yīng)用。本發(fā)明利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，利用植物L(fēng)HT基因同源性設(shè)計(jì)簡并引物，采用簡并引物PCR技術(shù)和RACE等方法分離與鑒定氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和參與人參等植物脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因序列，并通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將基因轉(zhuǎn)入煙草，經(jīng)過異源表達(dá)鑒定證明PgLHT基因的轉(zhuǎn)功能。研究發(fā)現(xiàn)PgLHT基因表達(dá)具有組織特異性且與人參脅迫反應(yīng)密切相關(guān)。所述PgLHT基因增強(qiáng)人參植物的抗性等方面有顯著的效果?？梢酝ㄟ^該基因或其衍生物篩選或改良人參甚至其它植物，獲得環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的優(yōu)良植物品種。亦可以采用組織培養(yǎng)或轉(zhuǎn)基因方式促進(jìn)人參等植物的有機(jī)營養(yǎng)代謝。


圖I是本發(fā)明的PCR擴(kuò)增PgLHT基因圖示；圖中，I表示簡并引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M表不 Marker ；圖2是本發(fā)明的PgLHT蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測圖；圖3是本發(fā)明的PgLHT基因編碼氨基酸序列及其與其它植物L(fēng)HT基因同源性比較圖；圖4是本發(fā)明的PgLHT基因編碼氨基酸序列進(jìn)化樹分析圖；圖5是本發(fā)明的PgLHT基因在人參不同組織中的表達(dá)水平圖；圖6是本發(fā)明的PgLHT基因在鹽脅迫條件下(50mM NaCl處理)的人參細(xì)胞中表達(dá)水平7是本發(fā)明的PgLHT基因在ABA誘導(dǎo)條件下(20 μ M ABA處理)的人參細(xì)胞中表達(dá)水平圖 圖8是本發(fā)明的PgLHT基因在MeJA誘導(dǎo)條件下(100 μ M MeJA處理)的人參細(xì)胞中表達(dá)水平9是本發(fā)明的PgLHT基因在SA誘導(dǎo)條件下(200 μ M SA處理)的人參細(xì)胞中表達(dá)水平圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施實(shí)例IPgLHT基因的獲得I、人參懸浮細(xì)胞培養(yǎng)(I)取吉林長白山人參產(chǎn)區(qū)四年生人參根，自來水浸泡45min后沖洗2次，先用75%乙醇浸泡30秒(sec)，無菌水沖洗2次，無菌室超凈工作臺(tái)上用O. l%HgCl2消毒，不斷攪動(dòng)，無菌蒸餾水沖洗4-5次。(2)在無菌條件下，將消毒過的外植體接種到含有2，4_D (2. Omg/L)和KT (O. 5mg/L)的MS培養(yǎng)基中。經(jīng)3次繼代培養(yǎng)后外植體完全脫分化，待完全形成愈傷組織后，每IOOml三角瓶接種6個(gè)外植體，培養(yǎng)條件如前述，培養(yǎng)45天(d)后將愈傷組織行繼代培養(yǎng)，以補(bǔ)充培養(yǎng)物所需的營養(yǎng)物質(zhì)和其它要求。接種30d后進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)，以后每3-4周繼代一次。(3)當(dāng)?shù)玫接鷤M織后，將其轉(zhuǎn)入到MS液體培養(yǎng)基中。愈傷組織塊直徑應(yīng)小于3mm。若組織塊較大可用無菌解剖刀將其分割成小塊。液體培養(yǎng)基分裝在50ml的錐形瓶內(nèi)，每IOml液體培養(yǎng)基接種I. 5-2. Og愈傷組織，接種后震蕩培養(yǎng)，120rpm, 24°C，暗培養(yǎng)。每隔
4-7d繼代一次。2、人參懸浮細(xì)胞總RNA提取(1)3000\8離心5!11；[11收集的懸浮細(xì)胞,在研缽內(nèi)用液氮充分研磨成粉末。每40mg研磨的粉末置于1.5ml離心管中，加入Iml TRIzoI試劑，40 μ L β-巰基乙醇，用移液器吸頭重懸細(xì)胞沉淀，室溫孵育5-10min。(2)加入O. 2ml氯仿，振搖15sec,室溫孵育10_15min。(3) 4°C、12000Xg離心15min，收集上層無色水相于I. 5ml離心管中，勿吸動(dòng)中間
層，棄沉淀。(4)加入0.4ml 3mol/L醋酸銨(pH 5. 2)，O. 6ml異丙醇，輕柔振蕩混勻，室溫孵育
5-10min(RNA 沉淀)。4°C、12000 X g 離心 IOmin,棄上清。(5)加入Iml 75%乙醇并振蕩；4°C，7500X g離心5min，棄上清，重復(fù)該步驟。(6)空氣中干燥lOmin，加入20 μ LDEPC水溶解RNA。(7)RNA的非變性瓊脂糖凝膠電泳在O. 5 X TBE中進(jìn)行，瓊脂糖濃度為1% (每IOOml凝膠中加入2· 5μ L的10mg/ml EB), 4 μ L上樣量，8v/cm恒壓40min,然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察所提取RNA的完整性。3、cDNA 合成純化mRNA后，以oligo (dT)為引物，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄總mRNA。(I)反應(yīng)體系如下
Template mRNA5 μ
5xsynthesis buffer4 ftL
dNTP mixture (10 mM)I liL
RNase InhibitorI μL
oligo(dT) (50 μΜ)2
M-MLV(200U/pL)I ^xL
RN'ase-free H0I f.iL
Total volume20 pL(2)輕柔攬祥混勾；室溫放直IOmin后，移至恒溫水浴箱；42 C，Ih ;結(jié)束后，冰上冷去P 2min。4、簡并引物PCR擴(kuò)增(I)簡并引物設(shè)計(jì)與合成利用Bioedit軟件對(duì)已報(bào)道的7種植物L(fēng)HT基因序列大豆(Glycine max,GmLHT, XM003547627)、蓖麻(Ricinus communis, RcLHT, XM002509522)、葡萄(Vitisvinifera, VvLHT, XM_002265272)、百脈根(Lotus japonicus, LjLHT, JF705953)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon, BdLHT, XM003573278)、擬南芥(Arabidopsis thaliana,AtLHTl, NM180778)、毛果楊(Populus trichocarpa, PtrLHTl, XM002321645)進(jìn)行同源性比對(duì)，找出高度保守的區(qū)域，采用Primer 5. O軟件設(shè)計(jì)簡并引物如下Pl 5/ -TGGCAAATGGTKGADATGCATGA-3' ；(SEQ ID NO. 3)P2 5/ -WATCTGGTADCTWCCDATDACATG-3'。(SEQ ID NO. 4)其中Y = C/T ；D = A/G/T ；R = A/G ；I =次黃嘌呤核苷酸。引物由上海英駿生物有限公司合成。(2) PCR 擴(kuò)增以cDNA為模板，用簡并引物P1、P2進(jìn)行“touchdown” PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為10XPCR緩沖液 5μ L、MgCl2 (25mmol/L) 3 μ L、dNTP (2. 5mmol/L)8μ L, Pl (20ymol/L) 2μ L、P2 (20 μ mol/L) 2 μ L、cDNA 2 μ L、dd Η2027· 5 μ L 和 LATaqDNApolymerase (5U/μ L) O. 5 μ L。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min ;94°C變性 30s、62°C退火 2min、72°C延伸 2min，2個(gè)循環(huán)；94°C變性30s、60°C退火2min、72°C延伸2min，2個(gè)循環(huán)；94°C變性30s、58°C退火2min、72°C延伸 2min，2 個(gè)循環(huán);94°C變性 30s、56°C退火 2min、72°C延伸 2min，26 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。I. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。(3)擴(kuò)增片段膠回收、連接、測序及分析
將PCR產(chǎn)物膠回收后連接至pGEM-T Easy載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。PCR初步鑒定正確后，將重組質(zhì)粒PGEM-LHT送上海英駿公司測序。測序后獲得I條序列長度為729bp的基因片段，測序結(jié)果利用NCBI中的Blast工具與GenBank的dbEST數(shù)據(jù)庫和蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)，與其他植物L(fēng)HT基因高度同源。4、cDNA全長擴(kuò)增根據(jù)簡并引物擴(kuò)增獲得的729bp LHT基因序列設(shè)計(jì)5'端和3'端擴(kuò)增引物，5' -RACE 引物(GSP5)和 3' -RACE 引物(GSP3)分別為:GSP5 5/ -CTCGGGTGTTGAAGGGATTGTTGC-3; ；(SEQ ID NO. 5)
GSP3 5/ -GTCCACTTTGTCCTCTCCCATCTCC-3;。(SEQ ID NO. 6)①RNA提取及其反轉(zhuǎn)錄RNA提取采用上述方法進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄采用SMART RACE cDNA Amplification Kit中反轉(zhuǎn)錄酶和引物。②Y端擴(kuò)增反應(yīng)體系
PCR-Grade Water34.5 μL
IOxAdvantage 2 PCR Buffer5.0 μL
dNTP Mix (10 mM)1.0 μL
SOxAdvantage 2 Polymerase Mix1.0 μL
Sf-RACE-Ready cDNA2.5 μL
UPM (ΙΟχ)5.0 ,uL
GSP5 (ΙΟμΜ)1.0 μL③5'端擴(kuò)增反應(yīng)條件
94lC2 mi η,I cycles:
94°C30 sec,72°C I min, 5 cycles;
94 O30 sec，70''C 30 sec, I TC I min, 5 cycles;
94 °C30 sec.68 XJ 30 sec； I'TC I min, 20 cycles④:V端擴(kuò)增體系
PCR-Grade Water34.5 μL
IQxAclvarttage 2 PCR Buffer5.0 μL
dNTP Mix (10 mM)1.0 nL
50;< Advantage 2 Polymerase Mix1.0 μL
S^RACE-Ready cDNA2.5 liL
UPM (I Ox)5.0 μ GSP3 (ΙΟμΜ) 1.0 μ
⑤3'端擴(kuò)增反應(yīng)條件
940C 2 min, I cycles:
94°C 30 sec. 72rC I min 30 sec 5 cycles;
9i ( 30 sec, 70 u 30 sec· 72,C I min 30 sec. 5 cycles;
94°C 30 sec, 68V 30 sec, 72°C I min 30 sec, 20 cycles⑥電泳及其測序PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，膠回收并與pGEM-T Easy載體連接，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5a，提取單菌落質(zhì)粒。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR檢測，檢測無誤后送上海英駿公司測序。測序后獲得5'端cDNA長度為909bp，3'端cDNA長度為1250bp，經(jīng)拼接后得到包含完整編碼框的全長為1350bp的序列(PgLHT)，提交到Genbank，登錄號(hào)為JX896444。5、序列分析經(jīng)過測序成功獲得了長度為1889bp的cDNA序列，利用NCBI中在線分析工具BLAST 和 ORF Finder (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 和 http://www.ncbi. nlm. nih. gov/gorf/orfig. cgi)進(jìn)行比較和ORF查找發(fā)現(xiàn)該序列中CDS序列長度為1350bp，對(duì)其編碼的氨基酸序列采用CLUSTALX軟件分析比較，與其他植物L(fēng)HT基因如大豆(GmLHT )、蓖麻(RcLHT，)、葡萄(VvLHT)、百脈根(LjLH)、二穗短柄草(BdLHT )、擬南芥(AtLHTl )、毛果楊(PtrLHTl)的同源性大于 75%。利用 TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2. 0/)在線分析軟件分析跨膜結(jié)構(gòu)域,結(jié)果顯示該蛋白為跨膜蛋白。并使用MEGA4軟件以鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。系統(tǒng)樹中分支的置信水平用自引導(dǎo)值(Bootstrap test)估計(jì),重復(fù)1000次,結(jié)果顯示該基因與葡萄、蓖麻和大豆的LHT基因親緣性最近。6、表達(dá)分析取新鮮的人參的根、不定根、芽、種子和發(fā)根，分別提取RNA ;再以20μΜΑΒΑ，200 μ M SA, 100 μ M MeJA和5OmM NaCl分別處理人參根O、1、3、6、12和24h，提取各時(shí)間點(diǎn)人參根總RNA。Woligod (T) 18為引物，AMV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，并以β-actin為內(nèi)參，利用real-time PCR擴(kuò)增PgLHT基因，PgLHT和β -actin擴(kuò)增引物分別為PgLHT F 5/ -CTGGGAGATGTAGCGTTTGC-3' ；(SEQ ID NO. 7)R5/ -GGTGTTGAAGGGATTGTTGC-3; ；(SEQ ID NO. 8)β -actin F 5/ -CGTGATCTTACAGATAGCTTCATGA-3' ；(SEQ ID NO. 9)R 5/ -AGAGAAGCTAAGATTGATCCTCC-3'。(SEQ ID NO. 10)反應(yīng)體系為2X S Y B RPremix Kx Ru嚴(yán) II 25 μι 引物 I (ΙΟμΜ)I μ
引物 2 (ΙΟμΜ)I μι
cDNAIμL
ddH022 μL采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序95°C 30sec ；95°C 40sec,60°C 30sec共40個(gè)循環(huán)；95°C 15sec，60°C lmin，95°C 15sec。每個(gè)樣品三次重復(fù) 。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，采用2_Λ 方法計(jì)算PgLHT基因在不同組織和不同處理?xiàng)l件下表達(dá)水平的差異。結(jié)果顯示其在芽孢中表達(dá)最高，其次是不定根和根，種子中表達(dá)最低。MeJA和NaCl可以顯著誘PgLHT基因表達(dá)且呈時(shí)間依賴性變化。實(shí)施實(shí)例2表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化I、植物過表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株篩選(I)分別用 BamH I 和 Sac I 雙酶切 pBI121 和 PgLHT，回收 pBI121 載體和 PgLHT基因片段。將兩片段連接并轉(zhuǎn)化DH5a，篩選出重組子，重組質(zhì)粒命名為pBI121-PgLHT。其中擴(kuò)增PgLHT基因的上下游引物分別為PgLHT F 1:5/ -CGGGATCCCGCACCATGGTTTCCCAAGCTCAGAC-3; ;(SEQ ID NO. 11)Rl 5/ ~CGCGAGCTCGGCTCCTTTGCTGCTTATGAGAA~3/。(SEQ ID NO. 12)其中劃線部分為BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)。(2)根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備①在含有100 μ g/ml利福霉素的YEB平板上劃線培養(yǎng)農(nóng)桿菌LBA4404，28°C暗培養(yǎng)2d。②挑取單菌落接種到含有100 μ g/ml利福霉素的YEB培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜。③將過夜活化的農(nóng)桿菌按1:50的比例稀釋到50ml含有100 μ g/ml的卡那霉索的YEB培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至0D600約為O. 4-0. 6，冰浴30min。④于4°C, 5000rpm離心lOmin,棄上清液,用IOml O. 15mM NaCl懸浮菌體。⑤于4°C, 5000rpm離心IOmin,棄上清液,用2ml 20mM CaCl2懸浮菌體。⑥每管200 μ L分裝，液氮速凍，_70°C保存。(3)根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化①將根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，緩慢解凍。②加入O. 5 μ gpBI 121-PgLHT 質(zhì)粒 DNA，輕輕混勻，冰浴 30min。③置液氮中冷凍2min，迅速移入37°C水浴中熱激5min，再迅速冰浴2min，之后加Λ 800 μ L YEB液體培養(yǎng)基，于28 °C振蕩培養(yǎng)3_4h。④5000rpm離心5min沉淀菌體,棄掉800 μ L上清后重新懸浮菌體,均勻涂布于含有100 μ g/ml利福霉素和50 μ g/ml卡那霉素的YEB培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2_3d。(4)根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒提取和鑒定①PCR鑒定挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于I. 5ml含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)，用PgLHT基因特異性引物F5/ -CTGGGAGATGTAGCGTTTGC-3' ；(SEQ ID NO. 7)R5/ -GGTGTTGAAGGGATTGTTGC-3; ；(SEQ ID NO. 8)PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含有預(yù)期片段。PCR反應(yīng)程序如下940C 30sec,55°C 45sec,72°C 30sec，35 個(gè)循環(huán)；72°C 2min。②酶切鑒定挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于含有100 μ g/ml的利福霉素和50 μ g/ml的卡那霉素的YEB培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pBI 121-PgLHT，采用上述方法以BamH I和Sac I酶切提取的質(zhì)粒。
(5)含pBI121_PgLHT質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)28°C劃線培養(yǎng)含有pBI121_PgLHT質(zhì)粒的農(nóng)桿菌約2d。挑取單菌落接種于含有100mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜，至0D600約為O. 6時(shí)收集菌液，4000rpm離心lOmin，沉淀重懸于1/2MS液體培養(yǎng)基中。(6)葉盤法侵染煙草將煙草幼葉置于自來水中沖洗3-4次，然后在70%乙醇中浸泡30_60sec，10%次氯酸鈉中消毒10_20min，再用無菌水充分沖洗，然后置于無菌培養(yǎng)皿中，將葉片切成O. 5-1cm2的小片，將剪好的葉片分別放入含有pBI121-PgLHT質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液中侵染5min，將葉片上的菌液用無菌濾紙吸干。(7)共培養(yǎng)侵染過并吸干表面菌液的葉盤，氣孔面朝上，緊靠著放在共培養(yǎng)基上(MS+6-BAI. Omg/L+IAA O. lmg/L)，黑暗處培養(yǎng) 2d。(8)篩選及分化培養(yǎng)暗培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)換到篩選分化培養(yǎng)基上(MS+6-BA I. Omg/L+IAA O. lmg/L+Kan100mg/L+Cef300mg/L),每15d換一次篩選分化培養(yǎng)基,至分化出的煙草長至3_5cm時(shí)轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中。(9)生根培養(yǎng)將分化至3-5cm的煙草分別切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(1/2MS+IBA 2. Omg/L)。(10)移栽當(dāng)再生植株的根長至5_8cm時(shí)，打開封口膜煉苗2_3d，將幼苗移栽至花盆內(nèi)，移栽后最初的5-10d罩上透明塑料，保持90%_100%的濕度，并在罩上打些小孔以利于氣體交換。移栽的基質(zhì)以及花盆均預(yù)先消毒。(7)轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板，采用上述重組質(zhì)粒鑒定所用的PgLHT基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。經(jīng)鑒定得到分化成苗的Ttl代陽性轉(zhuǎn)基因植株。2、幼苗抗脅迫能力的鑒定取形態(tài)長勢基本一致的野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株，分成兩份，分別至含20 μ ΜΑΒΑ,200 μ M SA, 100 μ M MeJA 和 50mM NaCl 的 MS 固體培養(yǎng)基上，于(25 士 2) °C，相對(duì)濕度 70%，每天16h光照/8h黑暗的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)中生長，每個(gè)處理至少10株苗。繼續(xù)培養(yǎng)10天后，觀察轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草幼苗的生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株具有較強(qiáng)的抗脅迫能力。3、原核表達(dá)分析(I) PCR 擴(kuò)增以已擴(kuò)增的PgLHT基因?yàn)槟０澹陨舷掠畏謩e添加BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增，其擴(kuò)增所用的引物如下(劃線部分分別為BamH I和Sac I酶切位點(diǎn))5' ~CGGGAATTCATGGTTTCCCAAGCTCAGAC~3/ (SEQ ID NO. 13)5' ~CGGGAATTCTCCTTTGCTGCTTATGAGAA~3/ (SEQ ID NO. 14)反應(yīng)體系同上，PCR反應(yīng)程序如下94°C 30sec，55°C 45sec，72°C 4min 30sec，35個(gè)循環(huán)；72°C IOmin。(2)酶切、連接轉(zhuǎn)化及其篩選分別用BamH I和Sac I雙酶切pET28a和PCR產(chǎn)物，回收pET28a和PCR產(chǎn)物片段。將兩片段連接并轉(zhuǎn)化BL21，通過卡那霉素篩選、PCR擴(kuò)增和酶切鑒定出重組子，重組質(zhì)粒命名為 pET28a-PgLHT。(3) PgLHT蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及其功能分析挑取含有重組pET28a-PgLHT 質(zhì)粒的菌落 BL21 (DE3)，至 IOml LB (含 Kan 50 μ g/ml)中37°C過夜培養(yǎng)。取I ml菌液加入到含IOOmlLB培養(yǎng)基(含Kan 50 μ g/ml), 37°C震蕩培養(yǎng)至0D600約為O. 4-0. 6。加入IPTG至終濃度為ImM進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔Ih收集一次菌液，5000 Xg離心lOmin，收獲沉淀，以Ig菌體加入4ml PBS緩沖液的比例重懸，加入5 X SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，沸水浴5min取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。選取PgLHT蛋白表達(dá)量高的時(shí)間點(diǎn)，加入不同種類氨基酸等底物，分析PgLHT蛋白的功能，并結(jié)合His-tag進(jìn)行蛋白純化,體外解析其結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種人參氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PgLHT，其特征在于，所述PgLHT基因序列如SEQ IDNO. I所示。
2.一種用于擴(kuò)增權(quán)利要求I所述PgLHT基因的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)如SEQID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。
3.—種重組載體，由空載體和插入該空載體的目的基因組成，其特征在于，所述目的基因?yàn)闄?quán)利要求I所述的PgLHT基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于，所述空載體為pBI121或pET28a。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述PgLHT基因在促進(jìn)人參氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及脅迫反應(yīng)中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述PgLHT基因在人參育種中的應(yīng)用。
7.一種人參氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其特征在于，所述蛋白由SEQ ID NO. I所示的基因編碼，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述蛋白在促進(jìn)人參氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及脅迫反應(yīng)中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述蛋白在人參育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因PgLHT及其編碼蛋白和應(yīng)用。該氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因PgLHT序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。研究發(fā)現(xiàn)PgLHT基因表達(dá)具有組織特異性且與人參脅迫反應(yīng)密切相關(guān)。所述PgLHT基因增強(qiáng)人參植物的抗性等方面有顯著的效果?？梢酝ㄟ^該基因或其衍生物篩選或改良人參甚至其它植物，獲得環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的優(yōu)良植物品種。亦可以采用組織培養(yǎng)或轉(zhuǎn)基因方式促進(jìn)人參等植物的有機(jī)營養(yǎng)代謝。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102952812SQ20121046238
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者羅志勇, 張儒, 祝捷, 謝小雷, 黃景嘉, 陳湘暉 申請(qǐng)人:中南大學(xué)