專(zhuān)利名稱(chēng)：一種成年大鼠竇房結(jié)精確定位和取材的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種實(shí)驗(yàn)材料的取材方法，具體涉及對(duì)成年大鼠竇房結(jié)快速定位及精確取材的方法，本發(fā)明還涉及對(duì)成年大鼠竇房結(jié)連續(xù)切片肉眼精確定位方法。
背景技術(shù)：
大鼠是最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中，大鼠的竇房結(jié)定位是一項(xiàng)技術(shù)難題。竇房結(jié)(sinoatrialnode,以下或簡(jiǎn)稱(chēng)SAN)是哺乳動(dòng)物心臟正常節(jié)律的起搏點(diǎn)，正常的SAN功能是心臟泵功能得以實(shí)現(xiàn)的前提條件。大鼠的竇房結(jié)解剖位置隱蔽，體積小， 僅通過(guò)肉眼觀察難以發(fā)現(xiàn)，然而其在心臟自律性活動(dòng)中卻占有非常重要的位置。關(guān)于成年大鼠SAN的位置和切取方法，目前尚存爭(zhēng)議。有研究報(bào)道，人及大多數(shù)哺乳類(lèi)動(dòng)物的SAN位置大致位于上腔靜脈與右心耳交界處以下，結(jié)的長(zhǎng)軸與界溝平行，大多數(shù)偏靜脈竇側(cè)，結(jié)的上端可達(dá)界溝與右心耳嵴交界處，下端可達(dá)下腔靜脈口。但有關(guān)大鼠SAN位置的研究結(jié)果相去甚遠(yuǎn)，有研究認(rèn)為大鼠SAN絕大多數(shù)位于界嵴腔靜脈竇側(cè)心外膜下，少數(shù)位于界嵴處或偏右心耳側(cè)。也有研究認(rèn)為，新生SD大鼠SAN位于上腔靜脈與右心房交界處以上的上腔靜脈近側(cè)段壁內(nèi)，呈馬蹄形。而有關(guān)SAN的定位方法描述，如①在上腔靜脈旁的心外膜下，心肌細(xì)胞分布疏松，染色較淡，膠原纖維和結(jié)締組織成分較多；②距SAN中央?yún)^(qū)不遠(yuǎn)處有較多的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)纖維和脂肪組織，由此從心外膜向內(nèi)膜比較容易找到結(jié)中央?yún)^(qū)；③有結(jié)動(dòng)脈，不一定都位于SAN的中央。而關(guān)于心臟SAN的切取方法，目前研究認(rèn)為通過(guò)大體和體視顯微鏡確定其部位有技術(shù)上的困難，只有通過(guò)連續(xù)切片才能成功地進(jìn)行研究，人及大多數(shù)哺乳類(lèi)動(dòng)物的SAN位置大致位于上腔靜脈與右心耳交界處以下，竇房結(jié)的長(zhǎng)軸與界溝平行，大多數(shù)偏靜脈竇側(cè)，竇房結(jié)的上端可達(dá)界溝與右心耳嵴交界處，下端可達(dá)下腔靜脈口。以上各種研究從定位、取材的角度講都不夠準(zhǔn)確。由于現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法較為精確地確定成年大鼠SAN的位置,實(shí)驗(yàn)中對(duì)大鼠SAN取材定位不明確；心臟SAN的切取過(guò)程中，常常需要切片近千張，工作量龐大。因此建立大鼠SAN的準(zhǔn)確定位并清晰顯示的方法對(duì)SAN基礎(chǔ)研究和臨床相關(guān)疾病的診治均具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種方法，能夠?qū)Τ赡甏笫骃AN準(zhǔn)確定位并清晰地顯示出，使實(shí)踐中可準(zhǔn)確切取成年大鼠SAN，而且該方法應(yīng)該簡(jiǎn)單、快速。本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是對(duì)成年大鼠竇房結(jié)的定位和取材，本發(fā)明進(jìn)行了如下研究I、宏觀定位、精確取材方法；2、連續(xù)切片肉眼精確定位方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是
一種對(duì)成年大鼠竇房結(jié)的定位和取材方法，包括宏觀定位和精確取材步驟，其特征是，所述宏觀定位是將大鼠竇房結(jié)定位于上腔靜脈近心端壁內(nèi)并延伸至右心房與上腔靜脈交界區(qū)，并用在體縫線(xiàn)打結(jié)法標(biāo)記右上腔靜脈；所述精確取材是在宏觀定位的基礎(chǔ)上，沿上腔靜脈遠(yuǎn)端取下大鼠心臟。所述用在體縫線(xiàn)打結(jié)法標(biāo)記右上腔靜脈是在大鼠胸腔內(nèi)尋找右側(cè)上腔靜脈，用O號(hào)縫線(xiàn)在靜脈遠(yuǎn)心端打結(jié)做標(biāo)記；所述沿上腔靜脈遠(yuǎn)端取下大鼠心臟是沿上腔靜脈遠(yuǎn)端、離斷其它與心臟相連的根部大血管，取下完整心臟；然后剪下右心房及與之相連的上腔靜脈近心段，分離并去除上腔靜脈周?chē)慕Y(jié)締組織。所述精確取材還包括對(duì)取材的竇房結(jié)進(jìn)行固定，方法是先進(jìn)行組織修剪，修剪的標(biāo)準(zhǔn)是以上腔靜脈與右心房交界區(qū)為中心，在向上向下各1.5mm處橫斷上腔靜脈與右心房；然后用濾紙包裹取好的組織入10%中性緩沖福爾馬林固定；將固定后的組織脫水后用石蠟包埋。所述包埋方向?yàn)樯锨混o脈遠(yuǎn)端向下、靜脈壁立埋。 上述精確取材還包括通過(guò)連續(xù)切片定位竇房結(jié)的步驟，方法是用切片機(jī)對(duì)石蠟包埋的組織連續(xù)切片，切片過(guò)程中同時(shí)用肉眼觀察竇房結(jié)在上腔靜脈壁的位置和形態(tài)，以定位竇房結(jié)。所述切片方向?yàn)樽陨锨混o脈斷端至心房，切片厚3μπι;所述觀察竇房結(jié)在上腔靜脈壁的位置和形態(tài)為，當(dāng)靜脈壁局部開(kāi)始增寬，并且增寬處?kù)o脈壁上出現(xiàn)明顯動(dòng)脈管腔時(shí)，表明是竇房結(jié)開(kāi)始出現(xiàn)的部位。具體操作步驟如下I、宏觀定位大鼠胸腔內(nèi)尋找右側(cè)上腔靜脈，用O號(hào)縫線(xiàn)在靜脈遠(yuǎn)心端打結(jié)做標(biāo)記。2、取材沿上腔靜脈遠(yuǎn)端、離斷其它與心臟相連的根部大血管，取下完整心臟；剪下右心房及與之相連的上腔靜脈近心段，分離并去除上腔靜脈周?chē)慕Y(jié)締組織；3、固定固定前先進(jìn)行組織修剪，修剪的標(biāo)準(zhǔn)是以上腔靜脈與右心房交界區(qū)為中心，在向上向下各I. 5mm處橫斷上腔靜脈與右心房；然后用濾紙包裹取好的組織(防止組織折疊卷曲)入10%中性緩沖福爾馬林固定；將固定后的組織脫水后用石蠟包埋，包埋方向?yàn)樯锨混o脈遠(yuǎn)端向下、靜脈壁立埋。所述連續(xù)切片肉眼定位方法是用切片機(jī)對(duì)上述石蠟包埋的組織連續(xù)切片，切片方向?yàn)樽陨锨混o脈斷端至心房，切片厚3 μ m，切片過(guò)程中同時(shí)用肉眼觀察切片中上腔靜脈壁的形態(tài)，當(dāng)靜脈壁局部開(kāi)始增寬，并且增寬處?kù)o脈壁上出現(xiàn)明顯動(dòng)脈管腔時(shí)，表明是SAN開(kāi)始出現(xiàn)的部位。本文中所述的“上腔靜脈”亦可稱(chēng)為“前腔靜脈”。本發(fā)明用以下方法分別確認(rèn)了上述方法對(duì)成年大鼠竇房結(jié)是精確定位并取材的I、大鼠SAN組織染色HE染色和Masson三色染色同時(shí)進(jìn)行。對(duì)上述切片進(jìn)行快速HE染色，通過(guò)光鏡觀察證實(shí)含有SAN組織。2、大鼠SAN組織電鏡標(biāo)本制作將大鼠SAN組織半薄切片與甲苯胺藍(lán)快速染色定位；經(jīng)大鼠SAN組織電鏡標(biāo)本精確定位和染色證實(shí)是大鼠SAN組織。本發(fā)明在進(jìn)行SAN取材時(shí)保留上腔靜脈的近心段。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)成年大鼠SAN位于上腔靜脈近心端壁內(nèi)并延伸至右心房與上腔靜脈交界區(qū)；在宏觀定位的基礎(chǔ)上，采用在體縫線(xiàn)打結(jié)法標(biāo)記右上腔靜脈的方法可以準(zhǔn)確取到成年大鼠的SAN組織。在體縫線(xiàn)打結(jié)法確保了對(duì)上腔靜脈取材的準(zhǔn)確性和SAN組織的完整性、縮短了取材時(shí)間，有助于成年大鼠SAN準(zhǔn)確取材；SAN精確取材方法準(zhǔn)確、可靠，可以增加SAN取材的精確程度，減少取材部位，減少了病理技術(shù)人員的工作量和切片等耗材的用量。本發(fā)明提供了一種成年大鼠SAN精確取材及快速定位的方法，連續(xù)切片和肉眼定位相結(jié)合,并通過(guò)HE和Masson染色進(jìn)行SAN組織形態(tài)學(xué)觀察；通過(guò)半薄切片定位和進(jìn)一步超薄切片進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。對(duì)正確判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果、確定準(zhǔn)確的電鏡取材部位和分離傳導(dǎo) 細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)等均有重要意義。本發(fā)明將現(xiàn)有的病理技術(shù)系統(tǒng)化，建立了對(duì)大鼠SAN進(jìn)行在體定位、精確取材及連續(xù)切片時(shí)肉眼定位的方法，本方法主要優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、省力、快速、結(jié)果精確；本發(fā)明采用在體縫線(xiàn)打結(jié)法標(biāo)記右上腔靜脈、SAN精確取材的方法。在體縫線(xiàn)打結(jié)法確保了對(duì)上腔靜脈取材的準(zhǔn)確性和SAN組織的完整性、縮短了取材時(shí)間、增加SAN取材的精確程度，減少取材部位，減少了病理技術(shù)人員的工作量和切片等耗材的用量。


圖I是成年大鼠心臟右側(cè)面觀，示右上腔靜脈打結(jié)標(biāo)記部位。圖2在體成年大鼠心臟右側(cè)面觀，示SAN位置。圖3成年大鼠右上腔靜脈橫切面，Λ示靜脈壁局部開(kāi)始增寬處(石蠟切片肉眼觀察)。圖4成年大鼠右上腔靜脈橫切面，靜脈壁局部增寬處常為SAN開(kāi)始出現(xiàn)的部位，▲7]\ SAN 動(dòng)脈(HEscalebar=50 μ m)。圖5成年大鼠SAN組織連續(xù)切片，★示SAN組織(HE scale bar=50 μ m)0圖6成年大鼠SAN組織,示SAN組織結(jié)構(gòu)(HE scale bar=50 μ m)。圖7 成年大鼠 SAN 組織，示 SAN 動(dòng)脈(HE scale bar=50 μ m)。圖8成年大鼠SAN組織，示SAN內(nèi)的P細(xì)胞和T細(xì)胞(HE scale bar=50ym)。圖9成年大鼠SAN組織,示SAN周?chē)纳窠?jīng)節(jié)和神經(jīng)纖維(HE scalebar=50 μ m)。圖10成年大鼠SAN組織，★示大鼠SAN組織(Masson染色scale bar=50ym)。圖11成年大鼠SAN組織，示SAN內(nèi)膠原纖維網(wǎng)架和細(xì)胞成分(Masson染色scalebar=50μ m)。圖12成年大鼠SAN組織，示SAN動(dòng)脈壁豐富的膠原纖維(Masson染色scalebar=50μ m)。圖13成年大鼠SAN組織半薄切片，示SAN組織精確定位結(jié)果(甲苯胺藍(lán)染色scalebar=25μ m)。圖14成年大鼠SAN內(nèi)的P細(xì)胞，示細(xì)胞核圓形或橢圓形，細(xì)胞器少，分布不規(guī)則，多靠近細(xì)胞周邊，胞質(zhì)清亮(TEM scale bar=500nm)。圖15成年大鼠SAN內(nèi)的P細(xì)胞，示P細(xì)胞膜上小凹結(jié)構(gòu)(▲) (TEMscalebar=500nm)o圖16成年大鼠SAN內(nèi)的T細(xì)胞，示細(xì)胞器較多，肌原纖維肌節(jié)明顯，Z線(xiàn)清楚，細(xì)胞核與肌原纖維間有線(xiàn)粒體群(TEM scale bar=500nm)。
具體實(shí)施例方式I材料和方法I. I實(shí)驗(yàn)動(dòng)物二級(jí)Wistar雄性大鼠20只，鼠齡10周，體重250±20g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并統(tǒng)一喂養(yǎng)。采用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室飼料，自由進(jìn)食、水，室內(nèi)溫度為21 23°C，相對(duì) 濕度60%。1. 2大鼠SAN光鏡取材和固定采用縫線(xiàn)打結(jié)標(biāo)記右上腔靜脈、大鼠SAN精確取材方法。首先以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠(50mg/kg)，解剖胸腔，暴露心臟，在體原位尋找大鼠右側(cè)上(前)腔靜脈，用O號(hào)縫線(xiàn)在靜脈遠(yuǎn)心端打結(jié)做標(biāo)記(見(jiàn)圖I)(原因離體新鮮靜脈壁組織非常薄，周?chē)Y(jié)締組織很豐富，離體后靜脈壁塌陷，與周?chē)Y(jié)締組織混雜在一起，難以分辨，導(dǎo)致取材時(shí)間延長(zhǎng)；而且剔除結(jié)締組織時(shí)，容易誤傷靜脈壁)。然后沿上(前)腔靜脈遠(yuǎn)端、其它與心臟相連的大血管根部離斷血管，取下完整心臟，以銳利剪刀剪下右心房及與之相連的上(前)腔靜脈，分離并去除上腔靜脈周?chē)慕Y(jié)締組織，最后對(duì)取下組織進(jìn)行進(jìn)一步修剪，以上(前)腔靜脈與右心房交界區(qū)為中心，在向上向下各I. 5mm處橫斷上腔靜脈與右心房，以濾紙包裹取好的組織(防止組織折疊卷曲)入10%中性緩沖福爾馬林固定。固定后的組織經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋(包埋方向上腔靜脈遠(yuǎn)端向下、靜脈壁立埋)。I. 3大鼠SAN組織連續(xù)切片定位方法采用肉眼觀察初步定位和HE染色精確定位法。用LEICARM2255切片機(jī)對(duì)組織進(jìn)行連續(xù)切片(方向?yàn)樽陨锨混o脈斷端至心房)，切片厚3 μ m。切片過(guò)程中可用肉眼觀察切片上的上腔靜脈壁的形態(tài)，當(dāng)靜脈壁局部開(kāi)始增寬，并且增寬處?kù)o脈壁上出現(xiàn)明顯動(dòng)脈管腔時(shí)，此部位一般是SAN開(kāi)始出現(xiàn)的部位，對(duì)切片進(jìn)行快速HE染色，光鏡觀察以證實(shí)是否含有SAN組織，以備收集陽(yáng)性組織切片。1. 4大鼠SAN組織染色方法 將含有SAN組織的陽(yáng)性切片中的每相鄰2張為一組，一張進(jìn)行HE染色、一張進(jìn)行Masson三色染色，以觀察SAN組織形態(tài)。I. 4. IHE 染色方法切片經(jīng)二甲苯(I、II、III)脫蠟，各15min，然后經(jīng)無(wú)水乙醇(I、11)、95%乙醇(I、
II)和90%乙醇各5min，經(jīng)80%、70%、50%乙醇和蒸餾水各2min，然后經(jīng)蘇木精染色lmin，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，自來(lái)水沖洗反藍(lán)Imin后，用蒸餾水稍洗，經(jīng)伊紅染液10s，蒸餾水沖洗，再經(jīng)50%、70%、80%和90%乙醇各2min,經(jīng)95%乙醇(KU、III)、無(wú)水乙醇(I、II )各2min，最后經(jīng)二甲苯(I、II、III)透明處理各lOmin，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察SAN形態(tài)結(jié)構(gòu)。I. 4. 2Masson 三色染色法
石臘切片按常規(guī)方法脫臘至水,經(jīng)Regaud蘇木素液染5min ；95%乙醇洗2次；在苦味酸乙醇液中分色，流水沖洗；再經(jīng)麗春紅酸性品紅染色5min，用蒸餾水稍洗；經(jīng)1%磷鑰酸溶液處理5min，不經(jīng)水洗，直接用醋酸苯胺藍(lán)復(fù)染5min，再經(jīng)1%冰醋酸處理lmin，然后經(jīng)95%乙醇、無(wú)水乙醇脫水多次，二甲苯透明，用中性樹(shù)膠封片，于光鏡下觀察SAN形態(tài)結(jié)構(gòu)。I. 5大鼠SAN組織電鏡標(biāo)本制作方法I. 5. I大鼠SAN組織電鏡取材方法以1%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，解剖胸腔，暴露心臟，尋找到右側(cè)上(前)腔靜并用O號(hào)縫線(xiàn)在靜脈遠(yuǎn)心端打結(jié)做標(biāo)記。沿上(前)腔靜脈遠(yuǎn)端、其它與心臟相連的大血管根部離斷血管，取下完整心臟，立即置于4°C預(yù)冷的生理鹽水中沖洗殘留血液，然后入預(yù)冷4°C戊二醛中固定lmin，以銳利剪刀剪下右心房及與之相連的上(前)腔靜脈，分離并去除上腔靜脈周?chē)慕Y(jié)締組織，以上腔靜脈-右心耳交界區(qū)為中心，以銳利剪刀自中心點(diǎn)向上、向下各Imm處橫斷靜脈壁和心房。沿靜脈壁長(zhǎng)軸縱行剖開(kāi)組織，在體視學(xué)顯微鏡下 展開(kāi)，沿靜脈縱軸平分成3-4塊長(zhǎng)方形組織塊(ImmX O. 5mmX 2mm)。I. 5. 2大鼠SAN組織電鏡固定與包埋方法采用靜脈壁定向包埋的方法。①前固定3%戊二醛、0.07mol/LPBS液(ρΗ7·4，下同)4 °C固定2h。②漂洗4°C O. 07mol/LPBS、0. 19mol/L蔗糖緩沖液反復(fù)漂洗。③后固定4°C 1%鋨酸、O. 24mol/LPBS液固定。④漂洗4°C O. 07mol/LPBS、0. 19mol/L蔗糖緩沖液漂洗15min。⑤脫水4°C條件下，分別經(jīng)50%乙醇IOmiη>70%乙醇10min、90%乙醇10min、90%乙醇與90%丙酮(I I)混合液10min、90%丙酮10min、100%丙酮15min逐步脫水，最后在室溫下100%丙酮15min。⑥浸透室溫下經(jīng)100%丙酮與包埋劑I : I溶液浸透30min，然后入純包埋劑浸透過(guò)夜。⑦包埋沿靜脈壁縱軸方向?qū)M織塊進(jìn)行縱向包埋，分別經(jīng)37°C (12h)、45°C (12h)、60°C (12h)
壞人
口 OI. 5. 3大鼠SAN組織半薄切片與甲苯胺藍(lán)快速染色方法在顯微鏡下，用刀片修去多余的包埋介質(zhì)，暴露出組織。取包埋塊固定于超薄切片機(jī)上，連續(xù)切取I μ m半薄切片，將切片轉(zhuǎn)移至滴有蒸餾水滴的載玻片上，在烤片機(jī)上烤干。取下帶有余溫的切片，迅速滴加05%甲苯胺藍(lán)染液(PBS配制)，室溫下染色lmin，蒸餾水沖洗后，立即光鏡下觀察，確定是否含有SAN及其在切片上的確切位置。I. 5. 4大鼠SAN組織電鏡標(biāo)本精確定位和染色方法在體視顯微鏡下，根據(jù)光鏡下確定的SAN位置進(jìn)行修塊，然后制作厚度為60nm超薄切片。超薄切片分別經(jīng)乙酸鈾染液避光染色lOmin，檸檬酸鉛染色I(xiàn)Omin后，飛利浦透射電鏡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。2 結(jié)果2. I大鼠SAN宏觀定位結(jié)果成年大鼠SAN位于上(前)腔靜脈與右心房交界區(qū)及交界區(qū)以上的上(前)腔靜脈壁內(nèi)，呈馬蹄形(見(jiàn)圖2)。2. 2大鼠SAN組織連續(xù)切片觀察初步定位及顯微鏡下驗(yàn)證結(jié)果切片過(guò)程中肉眼觀察所切下的上腔靜脈壁的形態(tài)，當(dāng)靜脈壁局部開(kāi)始增寬時(shí)(見(jiàn)圖3)，此部位即是SAN開(kāi)始出現(xiàn)的部位，對(duì)該切片進(jìn)行HE染色，光鏡觀察以驗(yàn)證是否含有SAN組織(見(jiàn)圖4)。鏡下觀察連續(xù)切片，可見(jiàn)到上腔靜脈與右心房交界區(qū)附近不同的部位的竇房結(jié)組織(見(jiàn)圖5)。圖中，A示上腔靜脈與右心房交界區(qū)以上，上腔靜脈壁內(nèi)的SAN ;B示上腔靜脈與右心耳嵴交界區(qū)部位的SAN ；C示上腔靜脈與右心房交界區(qū)部位的SAN ；D示上腔靜脈與右心房交界區(qū)以下，可見(jiàn)SAN邊緣。 2. 3大鼠SAN組織學(xué)特點(diǎn)2. 3. IHE 染色結(jié)果SAN內(nèi)的細(xì)胞成分呈淺紅色，心肌細(xì)胞和血管壁平滑肌細(xì)胞呈紅色。SAN區(qū)染色淺淡，細(xì)胞排列稀疏，與周?chē)男姆考』蜓鼙谄交∫子趨^(qū)分。大鼠SAN外形呈馬蹄形，由位于內(nèi)側(cè)壁上的內(nèi)側(cè)部和位于外側(cè)壁的外側(cè)部以及位于腹側(cè)壁上的連接內(nèi)、外側(cè)部的腹側(cè)部組成(見(jiàn)圖6)。
SAN所在部位，內(nèi)側(cè)達(dá)血管內(nèi)皮下，外側(cè)達(dá)血管外膜下，幾乎占據(jù)靜脈壁全層。在SAN內(nèi)還可見(jiàn)到I 3條不等的動(dòng)脈，即SAN動(dòng)脈貫穿結(jié)內(nèi)各部，多偏居于結(jié)的一側(cè)(見(jiàn)圖7)。SAN主要包括三種細(xì)胞成分起搏(P)細(xì)胞(pacemaker cell)、過(guò)渡(T)細(xì)胞(transistivecell)和少量心房肌細(xì)胞。細(xì)胞染色與細(xì)胞內(nèi)肌原纖維含量有關(guān)，位于SAN邊緣的普通心房肌細(xì)胞胞漿染色最深，T細(xì)胞染色介于心房肌和P細(xì)胞之間，P細(xì)胞染色最淺。細(xì)胞間質(zhì)主要由纖維和基質(zhì)等結(jié)締組織(見(jiàn)圖8)。P細(xì)胞多位于結(jié)的內(nèi)側(cè)膨大區(qū)，散在分布或3-5個(gè)成群，較心房肌細(xì)胞小，細(xì)胞界限欠清，細(xì)胞多呈圓形、橢圓形、梭形或多邊形。細(xì)胞核相對(duì)較大，呈圓形、橢圓形，位于細(xì)胞中央，核染色較淡，偶見(jiàn)雙核。由于胞漿內(nèi)胞質(zhì)豐富而細(xì)胞器相對(duì)較少，故使胞漿清亮發(fā)空，染色淺淡(見(jiàn)圖8)。T細(xì)胞又稱(chēng)過(guò)渡細(xì)胞，由于其大小、形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)介于P細(xì)胞與心房肌細(xì)胞之間，故名。細(xì)胞多呈長(zhǎng)圓柱形、梭形，比心房肌細(xì)胞短而窄。細(xì)胞內(nèi)肌原纖維等較P細(xì)胞多，可見(jiàn)完整肌節(jié)(見(jiàn)圖8)。SAN除以上3種細(xì)胞外，結(jié)內(nèi)還含有一些纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞及較多的膠原纖維。在SAN外周還可見(jiàn)到較多神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)纖維分布(見(jiàn)圖9)。2. 3. 2Masson三色染色結(jié)果SAN內(nèi)的膠原纖維染成綠色，細(xì)胞成分呈淡紅色，SAN周?chē)募〖?xì)胞呈紅色。大鼠SAN結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞排列稀疏，與臨近的血管壁平滑肌易于區(qū)分(見(jiàn)圖10)。其內(nèi)部膠原纖維含量較多，以綠色的膠原纖維構(gòu)成網(wǎng)架，細(xì)胞成分就分布在這些網(wǎng)架結(jié)構(gòu)的間隙中(見(jiàn)圖
11)。SAN動(dòng)脈管壁較厚，其內(nèi)含豐富的膠原纖維，構(gòu)成管壁支架，與周?chē)M織內(nèi)的膠原纖維相互連接(見(jiàn)圖12)。2. 4大鼠SAN組織半薄切片定位及超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)2. 4. I半薄切片甲苯胺藍(lán)快速染色定位結(jié)果通過(guò)甲苯胺藍(lán)快速染色，可將細(xì)胞核染成深藍(lán)色，細(xì)胞漿呈灰藍(lán)色，包埋介質(zhì)不著色。大鼠SAN位于上(前)腔靜脈壁內(nèi)，結(jié)構(gòu)較疏松，較周?chē)o脈壁平滑肌染色淺淡(見(jiàn)圖13)。根據(jù)半薄切片染色結(jié)果，對(duì)半薄切片進(jìn)行精確定位。2. 4. 2成年大鼠SAN超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(I)P細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
電鏡下P細(xì)胞多為梭形或卵圓形，單個(gè)散在或3-5成群分布。與普通心肌細(xì)胞相t匕，體積較小，但胞核相對(duì)較大，呈圓形或卵圓形。胞質(zhì)清亮，細(xì)胞器少，分布不規(guī)則，多靠近細(xì)胞周邊，肌絲束少或無(wú)，基本上見(jiàn)不到完整的肌節(jié)。線(xiàn)粒體較少，大小不等，多呈散在分布(見(jiàn)圖14)。P細(xì)胞膜表面欠光滑，有許多小凹(見(jiàn)圖15)，小凹呈橢圓形，與細(xì)胞表面垂直，分布欠規(guī)律，其存在增大了細(xì)胞表面積，但其功能目前尚不清楚。(2) T細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)電鏡下，T細(xì)胞為梭形或長(zhǎng)圓柱形，大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)均介于P細(xì)胞與普通心肌細(xì)胞之間，胞質(zhì)豐富，粗、細(xì)肌絲規(guī)則排列， 形成典型的肌節(jié)，肌原纖維增多，線(xiàn)粒體豐富，形態(tài)多樣，與肌原纖維相間排列(見(jiàn)圖16)。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)成年大鼠竇房結(jié)的定位和取材方法，包括宏觀定位和精確取材步驟，其特征是，所述宏觀定位是將大鼠竇房結(jié)定位于上腔靜脈近心端壁內(nèi)并延伸至右心房與上腔靜脈交界區(qū)，并用在體縫線(xiàn)打結(jié)法標(biāo)記右上腔靜脈；所述精確取材是在宏觀定位的基礎(chǔ)上，沿上腔靜脈遠(yuǎn)端取下大鼠心臟。
2.權(quán)利要求I所述的方法，所述用在體縫線(xiàn)打結(jié)法標(biāo)記右上腔靜脈是在大鼠胸腔內(nèi)尋找右側(cè)上腔靜脈，用O號(hào)縫線(xiàn)在靜脈遠(yuǎn)心端打結(jié)做標(biāo)記；所述沿上腔靜脈遠(yuǎn)端取下大鼠心臟是沿上腔靜脈遠(yuǎn)端、離斷其它與心臟相連的根部大血管，取下完整心臟；然后剪下右心房及與之相連的上腔靜脈近心段，分離 并去除上腔靜脈周?chē)慕Y(jié)締組織。
3.權(quán)利要求I所述的方法，所述精確取材還包括對(duì)取材的竇房結(jié)進(jìn)行固定，方法是先進(jìn)行組織修剪，修剪的標(biāo)準(zhǔn)是以上腔靜脈與右心房交界區(qū)為中心，在向上向下各I. 5mm處橫斷上腔靜脈與右心房；然后用濾紙包裹取好的組織入10%中性緩沖福爾馬林固定；將固定后的組織脫水后用石蠟包埋。
4.權(quán)利要求3所述的方法，所述包埋方向?yàn)樯锨混o脈遠(yuǎn)端向下、靜脈壁立埋。
5.權(quán)利要求3或4所述的方法，還包括通過(guò)連續(xù)切片定位竇房結(jié)的步驟，方法是用切片機(jī)對(duì)石蠟包埋的組織連續(xù)切片，切片過(guò)程中同時(shí)用肉眼觀察竇房結(jié)在上腔靜脈壁的位置和形態(tài)，以定位竇房結(jié)。
6.權(quán)利要求5所述的方法，所述切片方向?yàn)樽陨锨混o脈斷端至心房，切片厚3μ m ;所述觀察竇房結(jié)在上腔靜脈壁的位置和形態(tài)為，當(dāng)靜脈壁局部開(kāi)始增寬，并且增寬處?kù)o脈壁上出現(xiàn)明顯動(dòng)脈管腔時(shí)，表明是竇房結(jié)開(kāi)始出現(xiàn)的部位。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)成年大鼠竇房結(jié)快速定位及精確取材的方法，大鼠竇房結(jié)宏觀定位于上腔靜脈近心端壁內(nèi)并延伸至右心房與上腔靜脈交界區(qū)，采用在體縫線(xiàn)打結(jié)法標(biāo)記右上腔靜脈后，沿上腔靜脈遠(yuǎn)端取下大鼠心臟。本發(fā)明還涉及對(duì)成年大鼠竇房結(jié)連續(xù)切片肉眼精確定位方法。對(duì)取材的竇房結(jié)進(jìn)行固定后連續(xù)切片，切片過(guò)程中同時(shí)用肉眼觀察竇房結(jié)在上腔靜脈壁的位置和形態(tài)，以精確定位竇房結(jié)。
文檔編號(hào)A61D1/00GK102961197SQ20121047771
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者彭瑞云, 劉燕青, 高亞兵, 董霽, 姚斌偉, 張靜, 趙黎 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所