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誘導(dǎo)ot型百合花藥獲得(雙)單倍體植株的方法及其培養(yǎng)基的制作方法

文檔序號:209652閱讀:892來源:國知局
專利名稱:誘導(dǎo)ot型百合花藥獲得(雙)單倍體植株的方法及其培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)OT型百合花藥獲得(雙)單倍體植株的方法及其培養(yǎng)基,通過OT百合花藥培養(yǎng)得到再生單倍體或雙單倍體(二倍體)植株,屬于植物組織培養(yǎng)和花卉育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)
單倍體是指具有配子染色體數(shù)的個體或組織,僅有一個染色體組所構(gòu)成的個體稱為單倍體,單倍體經(jīng)過自然或人工加倍后即可得到雙單倍體。單倍體、雙單倍體材料在植物育種和遺傳基礎(chǔ)理論研究中都具有重要的意義,可用于分子標(biāo)記選擇和遺傳圖譜繪制,是轉(zhuǎn)基因最佳的受體群體。在育種實踐中,利用雙單倍體育種技術(shù)不僅可以快速獲得純系,縮 短育種周期,而且可以得到更多更廣泛的變異,特別是隱性性狀更容易得到表現(xiàn),從而豐富育種基礎(chǔ)材料的類型,加速育種進(jìn)程。目前獲得單倍體的一種主要手段是離體花藥培養(yǎng)獲得單倍體再生植株。一般通過花藥培養(yǎng)獲得再生植株有二種發(fā)生方式,即胚狀體發(fā)育途徑(直接發(fā)育途徑)和愈傷組織發(fā)育途徑(間接發(fā)育途徑)。第一種途徑通常是由花藥內(nèi)部的小孢子直接發(fā)育而來,即由具有單套染色體的細(xì)胞發(fā)育而來,所得到的再生植株幾乎全部為單倍體或雙單倍體。第二種途徑通常是由花藥壁細(xì)胞直接發(fā)育得到愈傷組織,即由具有二套染色體的體細(xì)胞發(fā)育而來,所得到的再生植株大多與親本具有相同的基因組成,所以這一途徑通常是不希望出現(xiàn)的。百合(Lilium spp.)為百合科百合屬多年生球根花卉植物,是世界著名的商品花卉之一,在鮮切花市場占有十分重要的地位。近年來,OT型百合(東方百合與喇叭百合的雜交種)逐漸成為國內(nèi)花卉市場上較為流行的百合類型。目前百合的新品種越來越多,對經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的品種的研究和利用逐漸成為百合育種工作的重點。百合雜交育種主要存在兩個問題,一是育種周期長,從種子播種到開花要經(jīng)歷2-3年時間,生長周期長;二是種間雜交困難。百合雜交育種普遍存在不親和性的問題,不僅受精困難,而且受精后很難獲得種子,因此單倍體育種技術(shù)理論上可以成為百合育種的另一種主要手段。所以百合的單倍體育種技術(shù)研究具有重要的生產(chǎn)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種誘導(dǎo)OT型百合花藥獲得(雙)單倍體植株的培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的誘導(dǎo)培養(yǎng)基用于獲得OT型百合單倍體植株或雙單倍體(二倍體)植株。一種誘導(dǎo)OT型百合花藥獲得(雙)單倍體植株的培養(yǎng)基,是在B5培養(yǎng)基中添加6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、蔗糖和瓊脂,得到的固體培養(yǎng)基,其中,6-BA的終濃度是I. 5 2. 5mg/l,2,4-D的終濃度是I. 5 2. 5mg/l,蔗糖的終濃度是6(Tl00g/l,瓊脂的終濃度是l(Tl5g/l。優(yōu)選的,6-BA的終濃度是2mg/l,2,4-D的終濃度是2mg/l,蔗糖的終濃度是90g/l,瓊脂的終濃度是14g/l。本發(fā)明培養(yǎng)基的完整配方(組成和終濃度)
硝酸鉀25_mg/l
硫酸銨134mg/I
磷酸 + :M 鈉130.44mg/l
硫酸鎂121.56mg/l
尤水&(化鈣113.23mg/l· 碘化 If0.75mg/l
爾酸3mg/l
水硫酸鐘10mg/l
七水硫酸鋅2mg/L
—:水 11酸_0.25mg/l
--ft 水硫酸銅0.025mg/l
六水氯化鈷0.025mg/l
乙........胺四乙酸........37.3mg/1
七水硫酸亞鐵27.8mg/l
肌醇I OOmg/!
Ife酸硫K素10mg/l
鹽酸吡哆醇Imgfl
煙酸lmg/1
6-芐氨基腺嘌時 2mg/l 2,4-;:氣苯氣乙酸 2mg/l 蔗糖90g/l
瓊脂14g/l本發(fā)明的另一目的是提供一種誘導(dǎo)OT型百合花藥獲得(雙)單倍體植株的方法,采
用上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基獲得OT型百合單倍體植株或雙單倍體(二倍體)植株。一種誘導(dǎo)OT型百合花藥獲得(雙)單倍體植株的方法,包括以下步驟I)將OT型百合的花蕾置于低溫、黑暗條件下f 3天;2)將OT型百合的花藥置于上述本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,經(jīng)過熱激處理,培養(yǎng),最
終得到單倍體或者雙單倍體(二倍體)植株。步驟(I)中,低溫為4 6°C,黑暗條件是指密閉、不透光的環(huán)境,以I天最好。步驟(2)中,所述的花藥先經(jīng)過預(yù)處理,即將花蕾剝?nèi)ポ嗥突ò辏缓髮⒒ㄋ幱?br> 75%酒精浸泡45飛O秒,之后用2. 5wt%次氯酸鈉溶液浸泡12 15分鐘,最后用無菌去離子水沖洗。將預(yù)處理后的花藥放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,然后對花藥進(jìn)行熱激處理,所述的熱激處理(脅迫處理)為將花藥置于37°C及黑暗條件下放置7天,經(jīng)過熱激處理后,于25°C培養(yǎng)f 2個月。 本發(fā)明的(雙)單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以有效地誘導(dǎo)OT型百合花藥分化和再生,不定芽發(fā)生率可高達(dá)60%。本發(fā)明通過對OT型百合花藥進(jìn)行離體培養(yǎng),誘導(dǎo)花藥內(nèi)部的小孢子發(fā)育為完整的單倍體或者雙單倍體植株,為單倍體育種提供多種純合的育種材料,創(chuàng)造了更多地新型種質(zhì),提高了選擇和育種效率。


圖I為本發(fā)明由花藥內(nèi)部小孢子經(jīng)體胚途徑形成的不定芽。圖2為本發(fā)明將不定芽轉(zhuǎn)移到成苗培養(yǎng)基后長大的成苗。圖3-1和圖3-2分別為本發(fā)明獲得的單倍體植株和二倍體植株的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。圖4為本發(fā)明再生植株根尖染色體計數(shù)(單倍體)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明,但本發(fā)明并不限于以下實施例。一、OT型百合單倍體植株的誘導(dǎo)方法I、取材采集處于單核靠邊期的OT型百合的花蕾,處于這個時期的花蕾形態(tài)特征為花蕾呈綠色,包裹緊密,花藥乳白色,略泛青;鏡檢可見絕大部分小孢子處在單核靠邊期。基因型不同,蕾長不同,一般蕾長在2. 5^3. 5厘米之間。2、花藥的預(yù)處理將采來的花蕾置于密閉容器內(nèi),置于4_6°C冰箱中1-2天。然后剝?nèi)ポ嗥突ò辏诔瑑艄ぷ髋_中,用75%酒精處理45飛O秒,之后用2. 5%次氯酸鈉消毒12 15分鐘,然后用無菌水沖洗3次,每次2分鐘。3、花藥的脅迫處理本實驗采用的脅迫處理方式為熱激處理,即將花藥于37°C及黑暗條件下放置7天。4、花藥胚狀體的獲得將預(yù)處理后的花藥腹面向下平放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,經(jīng)過脅迫處理后,于25°C培養(yǎng)
1-2個月。如圖I所示為本發(fā)明由花藥內(nèi)部小孢子經(jīng)體胚途徑形成的不定芽(再生芽)。上述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在B5培養(yǎng)基中添加6_BA、2,4_D、蔗糖和瓊脂得到的固體培養(yǎng)基其中6-BA的終濃度是2mg/l,2,4_D的終濃度是2mg/l,蔗糖的終濃度是90g/l,瓊脂的終濃度是14g/l ;pH為6. 0,B5基本培養(yǎng)基的溶劑是水。表I本發(fā)明采用的B5培養(yǎng)基的完整配方(不含蔗糖和瓊脂)化學(xué)式終濃度mg/1
大量元素
硝酸鉀KNO^2500
硫酸銨(NH4)2SO4134
磷酸二氫納KH2PO4130.44
硫酸鎂MgSO4121. 56
無水氯化辛丐CaCl2113.23微量元素
碘化鉀KI075
硼酸W3
一水硫酸猛MnSO4 · H2O10
七水硫酸鋅ZnSO4 · 7H202
二水鉬酸納Na2MoO4 · 2H20025
五水硫酸銅CuSO4 · 5H20O. 025
六水氯化鈷CoCl2 · 6H20O. 025
乙二胺四乙酸二納Na2-EDTA37 3
七水硫酸亞鐵FeSO4 · 7Η202 Γ8有機(jī)成分
肌醇100
鹽酸硫胺素V10
鹽酸吡哆醇
煙酸

在上述的B5培養(yǎng)基中添加6_BA、2,4_D、蔗糖和瓊脂得到的本發(fā)明的培養(yǎng)基,見表2。表2本發(fā)明培養(yǎng)基的配方
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)OT百合花藥獲得單倍體或雙單倍體植株的培養(yǎng)基,其特征在于在B5培養(yǎng)基中添加6-芐氨基腺嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖和瓊脂,得到固體培養(yǎng)基,其中,6-芐氨基腺嘌呤的濃度是I. 5^2. 5mg/l,2, 4-二氯苯氧乙酸的濃度是I. 5^2. 5mg/l,蔗糖的濃度是6(Tl00g/l,瓊脂的濃度是l(Tl5g/l。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)OT型百合花藥獲得單倍體或雙單倍體植株的培養(yǎng)基,其特征在于6_芐氨基腺嘌呤的濃度是2mg/l,2,4- 二氯苯氧乙酸的濃度是2mg/l,蔗糖的濃度是90g/l,瓊脂的濃度是14g/l。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)OT型百合花藥獲得單倍體或雙單倍體植株的培養(yǎng)基,其特征在于所述B5培養(yǎng)基的組成和濃度如下硝酸押2500mg/I硫酸銨134mg/l·磷酸 鈉130.44mg/l.硫酸鎂12L56mg/l無水氯化ff113.23mg/l碘化鉀0.75mg/l 刪酸3mg/l--·水硫酸償I Omg/I 七水硫酸鋅2mg/l _一:水鍆酸鈉0,25mg/l Il水硫酸銅0.025nig/l六水&[化鉆0.025mg/l乙:胺岡乙 ft: 二鈉 37.3mg/l七水硫酸亞鐵27.8mg/丨肌醇〗00mg/l ft酸硫胺素IOmgZl ft酸吡哆醇lmg/1 煙酸lmg/1。
4.一種誘導(dǎo)OT型百合花藥獲得單倍體或雙單倍體植株的方法,包括以下步驟 1)將OT型百合的花蕾置于低溫、黑暗條件下f3天; 2)然后將OT型百合的花藥置于權(quán)利要求1-3中任一項所述的培養(yǎng)基上,經(jīng)過熱激處理,培養(yǎng),最終得到單倍體或者雙單倍體植株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)OT型百合花藥獲得單倍體或雙單倍體植株的方法,其特征在于所述低溫的溫度為4 6°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)OT型百合花藥獲得單倍體或雙單倍體植株的方法,其特征在于所述的花藥先經(jīng)過預(yù)處理,將花藥用75%酒精浸泡45飛O秒,之后用2. 5wt%次氯酸鈉溶液浸泡12 15分鐘,最后用無菌水沖洗。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)OT型百合花藥獲得單倍體或雙單倍體植株的方法,其特征在于所述的熱激處理為將花藥置于37°C及黑暗條件下放置7天。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)OT型百合花藥獲得單倍體或雙單倍體植株的方法,其特征在于所述的培養(yǎng)為經(jīng)過熱激處理后,于25°C培養(yǎng)f 2個月。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)OT型百合花藥獲得(雙)單倍體植株的方法及其培養(yǎng)基,屬于植物組織培養(yǎng)和花卉育種領(lǐng)域。首先將OT型百合的花蕾置于低溫、黑暗條件下1~3天;然后將OT型百合的花藥置于培養(yǎng)基上,經(jīng)過熱激處理,培養(yǎng),最終得到單倍體或者雙單倍體植株;所用的培養(yǎng)基為在B5培養(yǎng)基中添加6-芐氨基腺嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖和瓊脂,得到的固體培養(yǎng)基,其中,6-芐氨基腺嘌呤的濃度是1.5~2.5mg/l,2,4-二氯苯氧乙酸的濃度是1.5~2.5mg/l,蔗糖的濃度是60~100g/l,瓊脂的濃度是10~15g/l。本發(fā)明為單倍體育種提供多種純合的育種材料,提高了育種選擇和育種效率。
文檔編號A01H1/08GK102939900SQ20121047941
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者趙泓, 王賢, 周滌, 熊敏, 衛(wèi)尊征 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院
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