專利名稱：一種通過酶解和微生物發(fā)酵生產(chǎn)高效生物肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種通過酶解和微生物發(fā)酵生產(chǎn)高效生物肽的方法，屬于微生物飼料添加劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)小肽的主要方法有分離法、酸堿水解法、生物合成法、DNA重組技術(shù)、蛋白質(zhì)酶解法以及生物發(fā)酵法。分離法是將動物體組織中富含的多種活性肽提取作為添加劑，但用此法獲得的肽成本較高，副作用較大且來源種類有限。酸堿水解法是通過強酸、強堿的作用分解大分子蛋白質(zhì)為小分子肽，但由于強酸強堿具有腐蝕性，會帶來大量污 染，并且酸堿水解過程中水解程度不易控制，氨基酸受到較大破壞，影響肽的結(jié)構(gòu)和功能。生物合成法是把精細化工生產(chǎn)的氨基酸人工嫁接成單肽，此法主要用于生產(chǎn)高活性的藥理級小肽，其缺點是副產(chǎn)品多、成本高、效率低、產(chǎn)品需分離提純，而且生產(chǎn)過程中大量使用的有毒溶劑不僅會污染環(huán)境，而且有損人體健康。DNA重組技術(shù)目前僅限于大分子活性多肽和蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，該法中小分子基因片段操作、表達與檢測均存在著不少困難，且不易篩選到高效表達的菌株、菌株的產(chǎn)量較低。蛋白質(zhì)酶解法具有產(chǎn)品安全性高、生產(chǎn)條件溫和、水解易控制、可定位生產(chǎn)特定的肽等優(yōu)點。缺點是蛋白質(zhì)水解過程中產(chǎn)生的苦味、臭味無法完全控制，降低和脫除水解過程中的苦味和臭味的成本較高；蛋白利用率不高；用于水解的酶制劑僅限于食品工業(yè)中少數(shù)幾種微生物蛋白酶、動物蛋白酶和植物蛋白酶；蛋白質(zhì)酶解法由于沒有微生物的參與改造，所產(chǎn)生的肽類大多帶有苦味，適口性差，無法完全去除原料中的抗營養(yǎng)因子。生物發(fā)酵法則采用現(xiàn)代生物發(fā)酵工程技術(shù)，通過發(fā)酵過程中微生物分泌的酶將基料中的部分蛋白酶解為小肽，它具有原料來源廣泛、反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)成本低、環(huán)保等優(yōu)點，但產(chǎn)肽率相對酶解法較低。因此，如何能有效的提高小肽的生產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本同時降低和去除蛋白質(zhì)酶解造成的產(chǎn)品缺陷，成為了小肽工業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)的一個研究重點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，針對上述缺陷，提供一種通過酶解和微生物發(fā)酵生產(chǎn)高效生物肽的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種通過酶解和微生物發(fā)酵生產(chǎn)高效生物肽的方法，其特征在于( I)將發(fā)酵底物粉碎并混合均勻后，加水拌料，然后蒸煮滅菌；(2)滅菌后的發(fā)酵底物溫度降到50 55°C時，加入蛋白酶進行水解；(3)發(fā)酵底物水解完畢后，溫度降至28 35°C時，將混合菌液加入水解后的發(fā)酵底物中，攪拌均勻，在恒溫條件下好氧發(fā)酵；(4)發(fā)酵完畢的物料經(jīng)低溫烘干后進行粉碎即得到所述高效生物肽成品；步驟(I)中，所述的發(fā)酵底物的組成為高蛋白豆柏50 60重量份、谷氨酸菌體蛋白10 20重量份以及脫酚棉籽蛋白30 40重量份；各組分經(jīng)粉碎并過40目篩后混合均勻；步驟(3)中，所述的混合菌液為黑曲霉(Aspergillus niger)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)的菌液按照1:1:1:1的比例混合得到的混合菌液；混合菌液按5 10%的重量百分比接種入水解后的發(fā)酵底物中。如上所述的方法，優(yōu)選地，步驟(I)中所述的加水拌料，是對發(fā)酵底物按料水比1:1 2加水后進行拌料，拌料后發(fā)酵底物的水分在40 55%之間；加入的水提前用0.1 0. 2mol/L的鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到6. 0-7. 0之間；步驟(I)中所述的蒸煮滅菌，是在115 121°C、0. 07 0.1lMPa條件下蒸煮滅菌20 30mino 如上所述的方法，優(yōu)選地，步驟(2)中所述的蛋白酶為木瓜蛋白酶，按發(fā)酵底物重量的I 2%。加入40萬U/g的木瓜蛋白酶。如上所述的方法，優(yōu)選地，步驟(2)中所述的水解為保持50 55°C的溫度水解10 12h。如上所述的方法，優(yōu)選地，所述的黑曲霉菌液和米曲霉菌液是按以下方法制成的制備一級種子培養(yǎng)基蔗糖30g、NaN033g、MgS04 *7H20 0. 5g、KCl 0. 5g、FeS04 *4H200. 014g、K2HP04l. 0g，蒸餾水IOOOmL混合均勻，調(diào)節(jié)pH為6. 0 6. 5，在溫度115 121。。下滅菌20 30min ；制備二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20kg、麥芽浸粉5kg、酵母浸粉5kg、玉米粉10kg，無菌純水1000L，pH自然，在溫度115 121°C下滅菌20 30min ；一級種子培養(yǎng)1000mL三角瓶中裝一級種子培養(yǎng)基500mL，接入菌種斜面制成濃度1. 5 2. OX IO6個/mL的孢子懸液50mL，28 30°C下以130r/min振蕩培養(yǎng)24h ；二級種子培養(yǎng)將經(jīng)所述一級種子培養(yǎng)的菌液按照5 10%的重量比接種到二級種子罐中，在28 30°C、通風(fēng)量體積比為1:0. 5 I的條件下，以100r/min機械攪拌，培養(yǎng)24 48h ；液體發(fā)酵培養(yǎng)將經(jīng)所述二級種子培養(yǎng)的菌液按照5 10%的質(zhì)量比接種到發(fā)酵罐中，在28 30°C、通風(fēng)量體積比為1:0. 5 I的條件下，以100r/min機械攪拌，培養(yǎng)24 48h。如上所述的方法，優(yōu)選地，所述的熱帶假絲酵母菌液是按以下方法制成的制備一級種子培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基130.1g,蒸餾水IOOOmL混合均勻，在溫度115 121°C 下滅菌 15min 30min ；制備二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖蜜120kg、葡萄糖10kg、麥芽浸粉10kg、酵母浸粉 10kg、MgSO4 7H201. 5kg、KH2P042. 0kg，無菌純水 1000L, pH 自然，在溫度 115 121°C 下滅菌 20 30min ；一級種子培養(yǎng)1000mL三角瓶中裝一級種子培養(yǎng)基500mL，將菌種斜面按環(huán)/80 IOOmL的比例接種入一級種子培養(yǎng)基中，28 30°C下以130r/min振蕩培養(yǎng)24 48h ；二級種子培養(yǎng)將經(jīng)所述一級種子培養(yǎng)的菌液按照5 10%的重量比接種到二級種子罐中，在28 30°C、通風(fēng)量體積比為1:0. 5 I的條件下，以100r/min機械攪拌，培養(yǎng)24 48h ；液體發(fā)酵培養(yǎng)將經(jīng)所述二級種子培養(yǎng)的菌液按照5 10%的重量比接種到發(fā)酵罐中，在28 30°C、通風(fēng)量體積比為1:0. 5 I的條件下，以100r/min機械攪拌，培養(yǎng)24 48h。如上所述的方法，優(yōu)選地，所述的枯草芽孢桿菌菌液是按以下方法制成的制備一級種子培養(yǎng)基蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、NaCl 5g,蒸懼水IOOOmL混合均勻，在溫度115 121°C下滅菌20min 30min。制備二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖15kg、酵母浸粉5kg、MgSO4 · 7H20O. 5kg，無菌純水1000L，PH自然，在溫度115 121°C下滅菌20min 30min。
一級種子培養(yǎng)1000mL三角瓶中裝一級種子培養(yǎng)基500mL，將菌種斜面按環(huán)/50 70mL的比例接種入一級種子培養(yǎng)基中，32 35°C下以130r/min振蕩培養(yǎng)24 48h ；二級種子培養(yǎng)將經(jīng)所述一級種子培養(yǎng)的菌液按照5 10%的重量比接種到二級種子罐中，在32 35°C、通風(fēng)量體積比為1:0. 5 I的條件下，以100r/min機械攪拌，培養(yǎng)24 48h ；液體發(fā)酵培養(yǎng)將經(jīng)所述二級種子培養(yǎng)的菌液按照5 10%的重量比接種到發(fā)酵罐中，在32 35°C、通風(fēng)量體積比為1:0. 5 I的條件下，以100r/min機械攪拌、培養(yǎng)24 48h。如上所述的方法，優(yōu)選地，步驟(3)中所述的好氧發(fā)酵，是將由發(fā)酵底物和混合菌液攪拌均勻組成的發(fā)酵物料平鋪在發(fā)酵床上，發(fā)酵物料堆高厚度為25 30cm，控制溫度在28 35°C，相對濕度在85 90%的條件下發(fā)酵72 168h，發(fā)酵期間每隔24h將物料翻動一次。如上所述的方法，優(yōu)選地，步驟(4)中所述的低溫烘干的溫度為80 100°C，所述烘干后物料的粉碎的粒度為至少95%通過80目篩且100%通過65目篩。如上所述的方法制備得到的高效生物肽。如上所述方法制備得到的高效生物肽，其中的生物活性小肽含量> 26. 10%，粗蛋白質(zhì)含量> 52. 00%ο本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明選用性能優(yōu)良的菌種和蛋白酶，并采用酶解和微生物固態(tài)發(fā)酵相結(jié)合的生產(chǎn)工藝，經(jīng)過對酶解、接種后的高蛋白豆柏、谷氨酸菌體蛋白和脫酚棉籽蛋白混合發(fā)酵底物進行深度固態(tài)發(fā)酵后，可獲得高濃度微生物活性肽產(chǎn)品，從而提供了一種易于規(guī)?；a(chǎn)的生物活性肽的制備方法及按照該方法所制備得到的活性肽制品。更具體地說，本發(fā)明提供的通過酶解和微生物發(fā)酵生產(chǎn)高效生物肽的方法具有以下優(yōu)點1、利用本發(fā)明方法，生物活性小肽的生產(chǎn)率大幅提高，并且本發(fā)明方法的生產(chǎn)工藝簡單、生產(chǎn)成本低，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。2、本發(fā)明對酶解后的物料通過微生物二次發(fā)酵后對某些苦味肽基團進行修飾和重組，使小肽之間、小肽與氨基酸之間發(fā)生移接、重排，制得的活性肽產(chǎn)品具有溶解性好，無苦味和異味，口感好，溶解粘度小，受熱不凝固等優(yōu)點?？朔嗣附夥óa(chǎn)品苦味大和口感差等缺點，應(yīng)用前景較好，是生產(chǎn)飼用小肽的最佳選擇。3、采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的高效生物肽中，小肽含量較高且質(zhì)量好，本發(fā)明產(chǎn)品中的生物活性小肽含量(DM) > 26. 10%，粗蛋白質(zhì)含量(DM) > 52. 00%。


圖1為本發(fā)明方法的流程示意圖。
具體實施例方式以下通過具體實施例詳細說明本發(fā)明的技術(shù)及特點，但這些實施例并非用以限定本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明以下實施例中所用黑曲霉(Aspergillus niger)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)菌種是 分別購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)和中國農(nóng)業(yè)微生物微生物保藏管理中心(ACCC)的野生菌種。保藏號分別為CGMCC 3. 316,CGMCC 2. 617,CGMCC 3. 4437,ACCC10619。實施例1參見圖1，按照以下方法制備本實施例的生物活性肽1.將高蛋白豆柏500kg、谷氨酸菌體蛋白200kg、脫酚棉籽蛋白350kg經(jīng)粉碎后過40目篩混合均勻制成發(fā)酵底物。2.發(fā)酵底物按料水比1:1. 2進行加水拌料，將物料水分調(diào)節(jié)到50%左右，加入的水提前用0. 2mol/L的鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到6. 5，然后在121°C、0.1 IMPa條件下蒸煮滅菌30mino3.待滅菌后的發(fā)酵底物溫度降到50°C時，按發(fā)酵底物重量1%。的比例加入木瓜蛋白酶(40萬U/g) 1kg，保溫水解12h。4 將黑曲霉(Aspergillus niger)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is)分別按以下方法進行增菌培養(yǎng)和液態(tài)發(fā)酵(I)黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)A.制備一級種子培養(yǎng)基蔗糖 30g、NaN033g、MgSO4 7H20 0. 5g、KC10. 5g、FeSO4 4H20 0. 014g、K2HPO4L Og,蒸餾水 IOOOmL 混合均勻，調(diào)節(jié) pH 為 6. 0 6. 5，在溫度115°C下滅菌 30min。B.制備二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20kg、麥芽浸粉5kg、酵母浸粉5kg、玉米粉10kg，無菌純水1000L，pH自然，在溫度121°C下滅菌30min。C.培養(yǎng)條件—級種子培養(yǎng)IOOOmL三角瓶中裝一級種子培養(yǎng)基500mL,接入菌種斜面制成的孢子懸液(1. 5 2. OX IO6 個/mL) 50mL，28°C、130r/min、振蕩培養(yǎng) 24h。二級種子培養(yǎng)10L自動種子發(fā)酵罐裝二級種子培養(yǎng)基5L，然后將上述經(jīng)一級種子培養(yǎng)的菌液按照10%的質(zhì)量比接種到二級種子罐中，28 30°C、通風(fēng)量體積比1:1、機械攪拌 100r/min、培養(yǎng) 24h。
液體發(fā)酵培養(yǎng)50L自動發(fā)酵罐裝發(fā)酵培養(yǎng)基25L，將上述經(jīng)二級種子培養(yǎng)的菌液按照10%的質(zhì)量比接種到發(fā)酵罐中，28°C、通風(fēng)量體積比1:1、機械攪拌100r/min、培養(yǎng)24h。(2)熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)A.制備一級種子培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基130.1g,蒸懼水IOOOmL混合均勻,在溫度115。。下滅菌 15min。B.制備二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖蜜120kg、葡萄糖10kg、麥芽浸粉10kg、酵母浸粉 10kg、MgSO4 · 7H201. 5kg、ΚΗ2Ρ042· 0kg,無菌純水 1000L, pH 自然，在溫度121°C 下滅菌 30min。C.培養(yǎng)條件一級種子培養(yǎng)1000mL三角瓶中裝一級種子培養(yǎng)基500mL，將菌種斜面按環(huán)/IOOmL的比例接種入一級種子培養(yǎng)基中，28°C、130r/min、振蕩培養(yǎng)24h。二級種子培養(yǎng)10L自動種子發(fā)酵罐裝二級種子培養(yǎng)基5L，將上述經(jīng)一級種子培養(yǎng)的菌液按照10%的重量比接種到二級種子罐中，28°C、通風(fēng)量體積比1:0. 8、機械攪拌100r/min、培養(yǎng) 24h。液體發(fā)酵培養(yǎng)50L自動發(fā)酵罐裝發(fā)酵培養(yǎng)基25L，將上述經(jīng)二級種子培養(yǎng)的菌液按照10%的質(zhì)量比接種到發(fā)酵罐中，28°C、通風(fēng)量體積比1:0. 8、機械攪拌100r/min、培養(yǎng)24h。(3)枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)A.制備一級種子培養(yǎng)基蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、NaCl 5g,蒸懼水IOOOmL混合均勻，在溫度121°C下滅菌30min。
B.制備二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖15kg、酵母浸粉5kg、MgSO4 · 7H200. 5kg,無菌純水1000L, pH自然,在溫度121°C下滅菌30min。C.培養(yǎng)條件一級種子培養(yǎng)1000mL三角瓶中裝一級種子培養(yǎng)基500mL，將菌種斜面按環(huán)/50mL的比例接種入一級種子培養(yǎng)基中，35°C、130r/min、振蕩培養(yǎng)24h。二級種子培養(yǎng)10L自動種子發(fā)酵罐裝發(fā)酵培養(yǎng)基5L，將上述經(jīng)一級種子培養(yǎng)的菌液按照10%的質(zhì)量比接種到二級種子罐中，35°C、通風(fēng)量體積比1:1、機械攪拌100r/min、培養(yǎng)24h。液體發(fā)酵培養(yǎng)50L自動種子發(fā)酵罐裝發(fā)酵培養(yǎng)基25L，將上述經(jīng)二級種子培養(yǎng)的菌液按照10%的質(zhì)量比接種到發(fā)酵罐中，35°C、通風(fēng)量體積比1:1、機械攪拌100r/min、培養(yǎng)24h。5.發(fā)酵底物水解完畢后，溫度降至30°C時，將4種菌液按1:1:1:1比例進行混合，然后將混合混合菌液按10%的重量百分比接種入水解后的發(fā)酵底物中，混合均勻后平鋪在發(fā)酵床上，發(fā)酵物料堆高厚度為25cm，控制溫度30°C，相對濕度85 90%條件下發(fā)酵120h，發(fā)酵期間每隔24h將物料翻動一次。6.發(fā)酵完畢的物料經(jīng)80°C低溫烘干后進行細粉碎即得高效生物肽成品，粉碎粒度為至少95%通過80目篩、100%通過65目篩。7.按照以上方法制備得到的高效生物肽，采用三氯乙酸法檢測小肽含量為26.90% (DM)，凱氏定氮法檢測粗蛋白質(zhì)含量為55.00% (DM)0
實施例2參見圖1，按照以下方法制備本實施例的生物活性肽1.將高蛋白豆柏600kg、谷氨酸菌體蛋白100kg、脫酚棉籽蛋白300kg經(jīng)粉碎后過40目篩混合均勻制成發(fā)酵底物。2.發(fā)酵底物按料水比1:1. 2進行加水拌料，將物料水分調(diào)節(jié)到50%左右，加入的水提前用0. 2mol/L的鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到6. 5，然后在121°C、0.1 IMPa條件下蒸煮滅菌30mino3.待滅菌后的發(fā)酵底物溫度降到50°C時，按發(fā)酵底物重量1.5%。的比例加入木瓜蛋白酶(40萬U/g) 1kg，保溫水解12h。4 將黑曲霉(Aspergillus niger)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、米曲霉 (Aspergillus oryzae)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)分別按如實施例1所述的方法進行增菌培養(yǎng)和液態(tài)發(fā)酵。5.發(fā)酵底物水解完畢后，溫度降至30°C時，將4種菌液按1:1:1:1比例進行混合，然后將混合混合菌液按10%的重量百分比接種入水解后的發(fā)酵底物中，混合均勻后平鋪在發(fā)酵床上，發(fā)酵物料堆高厚度為25cm，控制溫度30°C，相對濕度85 90%條件下發(fā)酵120h，發(fā)酵期間每隔24h將物料翻動一次。6.發(fā)酵好的物料經(jīng)80°C低溫烘干后進行細粉碎即得高效生物肽成品，粉碎粒度為至少95%通過80目篩、100%通過65目篩。7.按照以上方法制備得到的高效生物肽，采用三氯乙酸法檢測小肽含量為26. 10% (DM)，凱氏定氮法檢測粗蛋白質(zhì)含量為52. 00%(DM)。
權(quán)利要求
1.一種通過酶解和微生物發(fā)酵生產(chǎn)高效生物肽的方法，其特征在于，(1)將發(fā)酵底物粉碎并混合均勻后，加水拌料，然后蒸煮滅菌；(2)滅菌后的發(fā)酵底物溫度降到50 55°C時，加入蛋白酶進行水解；(3)發(fā)酵底物水解完畢后，溫度降至28 35°C時，將混合菌液加入水解后的發(fā)酵底物中，攪拌均勻，在恒溫條件下好氧發(fā)酵；(4)發(fā)酵完畢的物料經(jīng)低溫烘干后進行粉碎即得到所述高效生物肽成品；步驟(I)中，所述的發(fā)酵底物的組成為高蛋白豆柏50 60重量份、谷氨酸菌體蛋白 10 20重量份以及脫酚棉籽蛋白30 40重量份；各組分經(jīng)粉碎并過40目篩后混合均勻； 步驟(3)中，所述的混合菌液為黑曲霉、熱帶假絲酵母、米曲霉和枯草芽孢桿菌的菌液按照1:1:1:1的比例混合得到的混合菌液；混合菌液按5 10%的重量百分比接種入水解后的發(fā)酵底物中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的加水拌料，是對發(fā)酵底物按料水比1:1 2加水后進行拌料，拌料后發(fā)酵底物的水分在40 55%之間；加入的水提前用O.1 O. 2mol/L的鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到6. 0-7. O之間；步驟(I)中所述的蒸煮滅菌，是在115 121°C、0. 07 O.1 IMPa條件下蒸煮滅菌20 30mino
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的蛋白酶為木瓜蛋白酶， 按發(fā)酵底物重量的I 2%。加入40萬U/g的木瓜蛋白酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的水解為保持50 55°C 的溫度水解10 12h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黑曲霉菌液和米曲霉菌液是按以下方法制成的制備一級種子培養(yǎng)基蔗糖 30g、NaN033g、MgSO4 · 7H20 O. 5g、KCl 0. 5g、FeSO4 · 4H200.014g、K2HP04l. Og,蒸餾水IOOOmL混合均勻，調(diào)節(jié)pH為6· O 6· 5，在溫度115 121。。下滅菌20 30min ；制備二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20kg、麥芽浸粉5kg、酵母浸粉5kg、玉米粉 10kg，無菌純水1000L，pH自然，在溫度115 121°C下滅菌20 30min ；一級種子培養(yǎng)=IOOOmL三角瓶中裝一級種子培養(yǎng)基500mL，接入菌種斜面制成濃度1.5 2. OX IO6個/mL的孢子懸液50mL，28 30°C下以130r/min振蕩培養(yǎng)24h ；二級種子培養(yǎng)將經(jīng)所述一級種子培養(yǎng)的菌液按照5 10%的重量比接種到二級種子罐中，在28 30°C、通風(fēng)量體積比為1:0. 5 I的條件下，以100r/min機械攪拌，培養(yǎng)24 48h ；液體發(fā)酵培養(yǎng)將經(jīng)所述二級種子培養(yǎng)的菌液按照5 10%的質(zhì)量比接種到發(fā)酵罐中， 在28 30°C、通風(fēng)量體積比為1:0. 5 I的條件下，以100r/min機械攪拌，培養(yǎng)24 48h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的熱帶假絲酵母菌液是按以下方法制成的制備一級種子培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基130. lg，蒸餾水IOOOmL混合均勻，在溫度115 121°C 下滅菌 15min 30min ；制備二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基鹿糖蜜120kg、葡萄糖10kg、麥芽浸粉10kg、酵母浸粉 IOkg^MgSO4 · 7H201. 5kg、KH2P042. 0kg，無菌純水 1000L，pH 自然，在溫度 115 121。。 下滅菌20 30min ；一級種子培養(yǎng)1000mL三角瓶中裝一級種子培養(yǎng)基500mL，將菌種斜面按環(huán)/80 IOOmL的比例接種入一級種子培養(yǎng)基中，28 30°C下以130r/min振蕩培養(yǎng)24 48h ；二級種子培養(yǎng)將經(jīng)所述一級種子培養(yǎng)的菌液按照5 10%的重量比接種到二級種子罐中，在28 30°C、通風(fēng)量體積比為1:0. 5 I的條件下，以100r/min機械攪拌，培養(yǎng)24 48h ；液體發(fā)酵培養(yǎng)將經(jīng)所述二級種子培養(yǎng)的菌液按照5 10%的重量比接種到發(fā)酵罐中， 在28 30°C、通風(fēng)量體積比為1:0. 5 I的條件下，以100r/min機械攪拌，培養(yǎng)24 48h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌菌液是按以下方法制成的制備一級種子培養(yǎng)基蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、NaCl 5g,蒸懼水IOOOmL混合均勻,在溫度115 121°C下滅菌20min 30min。制備二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖15kg、酵母浸粉5kg、MgSO4 · 7H20 0. 5kg， 無菌純水1000L, pH自然，在溫度115 121°C下滅菌20min 30min。一級種子培養(yǎng)1000mL三角瓶中裝一級種子培養(yǎng)基500mL，將菌種斜面按環(huán)/50 70mL的比例接種入一級種子培養(yǎng)基中，32 35°C下以130r/min振蕩培養(yǎng)24 48h ；二級種子培養(yǎng)將經(jīng)所述一級種子培養(yǎng)的菌液按照5 10%的重量比接種到二級種子罐中，在32 35°C、通風(fēng)量體積比為1:0. 5 I的條件下，以100r/min機械攪拌，培養(yǎng)24 48h ；液體發(fā)酵培養(yǎng)將經(jīng)所述二級種子培養(yǎng)的菌液按照5 10%的重量比接種到發(fā)酵罐中， 在32 35°C、通風(fēng)量體積比為1:0. 5 I的條件下，以100r/min機械攪拌、培養(yǎng)24 48h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的好氧發(fā)酵，是將由發(fā)酵底物和混合菌液攪拌均勻組成的發(fā)酵物料平鋪在發(fā)酵床上，發(fā)酵物料堆高厚度為25 30cm，控制溫度在28 35°C，相對濕度在85 90%的條件下發(fā)酵72 168h，發(fā)酵期間每隔24h將物料翻動一次。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的低溫烘干的溫度為 80 100°C，所述烘干后物料的粉碎的粒度為至少95%通過80目篩且100%通過65目篩。
10.按照權(quán)利要求1 9中任一項所述方法制備得到的高效生物肽。
全文摘要
一種通過酶解和微生物發(fā)酵生產(chǎn)高效生物肽的方法，是將發(fā)酵底物粉碎并混合均勻后，加水拌料，然后蒸煮滅菌；待溫度降到50～55℃時，加入蛋白酶進行水解；水解完畢后，溫度降至28～35℃時，將混合菌液加入水解后的發(fā)酵底物中，攪拌均勻，在恒溫條件下好氧發(fā)酵；發(fā)酵完畢的物料經(jīng)低溫烘干后進行粉碎即得到所述高效生物肽成品。所述發(fā)酵底物的組成為高蛋白豆粕50～60重量份、谷氨酸菌體蛋白10～20重量份以及脫酚棉籽蛋白30～40重量份；各組分經(jīng)粉碎并過40目篩后混合均勻。所述的混合菌液為黑曲霉、熱帶假絲酵母、米曲霉和枯草芽孢桿菌的菌液按照1:1:1:1的比例混合得到的混合菌液；混合菌液按5～10%的重量百分比接種入水解后的發(fā)酵底物中。
文檔編號A23K1/16GK102994605SQ20121049506
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者張有聰, 郝永清, 史彬林, 任國軍 申請人:張有聰