專利名稱：利用⁶⁰Co r射線輻射誘變紅葉石楠體細胞育種的方法
利用6°Co r射線輻射誘變紅葉石楠體細胞育種的方法技術領域
本發(fā)明屬于植物輻射誘變處理技術領域，具體涉及一種利用6tlC0 r射線輻射誘變紅葉石楠體細胞育種的方法。
背景技術：
紅葉石楠(Photiniafraser)是從光葉石楠(P. glabra)和石楠(P. serrulata)的雜交種中選育的新品種，屬薔薇科石楠屬常綠小喬木，具有生長迅速，耐修剪，株形緊湊，萌芽力強，適用范圍廣等特點，成為一種觀賞價值極高的園林植物。中國在20世紀90年代中期，從國外引種后開始進行大批量的速繁和推廣。引入的優(yōu)良品種也因長期扦插繁殖，易感染病害、蟲害，葉片易脫落，觀賞性下降，良種化程度降低。劣質種苗的使用又導致紅葉石楠固有的優(yōu)良特性日益喪失。因此，為了滿足該產業(yè)對優(yōu)良品種的需要，研究開發(fā)快速、高效的品種培育及育種材料創(chuàng)新技術具有重要意義。
在林木育種工作中，傳統(tǒng)雜交育種是個非常漫長的過程，生物技術育種要獲得優(yōu)良品種一般也需要長達數(shù)年或數(shù)十年。輻射育種技術是利用射線誘發(fā)生物遺傳性的改變， 并經人工選擇培育新的優(yōu)良品種的技術。該技術具有打破性狀連鎖、實現(xiàn)基因重組、突變頻率高、突變類型多、變異性狀穩(wěn)定和方法簡便等特點。目前，國內對紅葉石楠的研究主要集中在組織快繁及工廠化育苗成套技術、扦插繁殖育苗技術、引種適應性和園林應用等方面 (楊靜，2008 ;畢麗華，2011 ;方敏彥，2012 ；)。而國外，則主要集中在對不同品種生理特點和栽培繁殖技術的研究(Haynes，1991 ;Tokatli，2011)。經檢索國內外至今尚未見有關利用 60Co r射線輻射誘變紅葉石楠體細胞育種方法的相關研究報道。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種利用6tlCo !■射線輻射誘變紅葉石楠體細胞育種的方法。
本發(fā)明所述利用6tlCo r射線輻射誘變紅葉石楠體細胞育種的方法，其特征在于 以在愈傷組織增殖培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)獲得的紅葉石楠胚性愈傷組織為輻射材料，用輻照劑量為15-45Gy的6tlCo r射線輻射對其處理1_2小時，然后將輻射處理后的愈傷組織轉到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，在溫度為25±2°C條件下暗培養(yǎng)30-35天，之后將暗培養(yǎng)后的紅葉石楠材料轉移到組培室光照條件下培養(yǎng)，溫度為25 ± 2°C，光照為1500LX-1800LX，光照時間為 14-16h/d，15±2d后分化產生綠芽，綠芽先轉到愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20±2d，轉移到生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培育，直至得到完整紅葉石楠組培苗即可移栽至大田種植；
其中
上述愈傷組織增殖培養(yǎng)基組成為改良MS+2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4_D)0. Img/ L+6-節(jié)基氨基嘌呤(BA) O. 5mg/L+ 萘乙酸(NAA) 20. Omg/L+phytagel 3. Og/L+ 鹿糖 20g/L ；
上述愈傷組織分化培養(yǎng)基組成為改良MS+6-芐基氨基嘌呤(BA) 2. Omg/ L+phytagel3. 5g/L+ 鹿糖 20g/L ；
上述生根培養(yǎng)基組成為1/2MS+吲哚丁酸(IBA) O. 2mg/L ；
上述各種培養(yǎng)基在高壓滅菌前，調整pH值至5. 8。
上述的利用6tlCo r射線輻射誘變紅葉石楠體細胞育種的方法中所述6tlCo r射線輻射處理的輻照劑量優(yōu)選設置為30Gy，處理時間優(yōu)選設置為90分鐘。
本發(fā)明以紅葉石楠的胚性愈傷組織為材料，以6tlCo r射線為輻射源，研究了不同劑量的6tlCo r射線結合低溫處理對愈傷組織生長、分化和植株再生的影響，運用離體培養(yǎng)方法從突變細胞再生出完整植株，建立了紅葉石楠體細胞6tlCo r射線輻射誘變育種的方法。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點和積極效果
I、本發(fā)明選用高頻再生能力的胚性愈傷組織為材料，克服了現(xiàn)有技術經輻射誘變獲得隱性突變體和嵌合體的缺陷，有利于得到誘變純合體，提高輻射誘變效率，從而拓寬了紅葉石楠種質資源，為高產、優(yōu)質品種的選育奠定了基礎。
2、本發(fā)明采用了輻射誘變處理技術，其中采用輻照劑量為30Gy的6tlCo !■射線處理 90分鐘，愈傷組織綠芽分化率高達79%。


圖I、對照(未輻射)分化綠芽。
圖2、30Gy劑量輻射分化綠芽。
圖3、對照(未輻射)再生植株移栽苗。
圖4、30Gy劑量輻射再生植株移栽苗。
具體實施方式
實施例I
以試管苗第3到第6片展開葉為外植體，葉片帶短葉柄，將葉片周圍帶鋸齒狀葉緣切去，葉片沿主脈切成左右2半，在葉片上輕劃I刀，葉背朝下緊貼培養(yǎng)基放置，接種在改良 MS+2, 4-DO. lmg/L+BAO. 5mg/L+NAA20. Omg/L+3. Og/L phytagel+20g/L 鹿糖胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，PH值5. 8，暗培養(yǎng)10d，誘導體胚性愈傷組織為輻射材料。
用輻射劑量為45Gy的6ciCor射線對上述輻射材料輻射處理60分鐘，將輻射后的材料，轉入改良MS+2. Omg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖胚性愈傷組織分化培養(yǎng)基上，pH 值5. 8，在溫度為25 ±2°C條件下繼續(xù)暗培養(yǎng)30d，中間繼代一次。
將上述培養(yǎng)材料轉移到溫度為25°C，光照為1500LX，光照時間為16h/d組培室條件下培養(yǎng)，約15d分化產生綠芽，綠芽轉入改良MS+2. Omg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d。
將上述生長發(fā)育健壯的叢芽長到4cm切成單株轉接到1/2MS+IBA O. 2mg/L生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20d形成具有根、莖、葉的完整再生植株，即可煉苗移栽。
通過本發(fā)明方法獲得的愈傷組織綠芽分化率為47%。
實施例2
以試管苗第3到第6片展開葉為外植體，葉片帶短葉柄，將葉片周圍帶鋸齒狀葉緣切去，葉片沿主脈切成左右2半，在葉片上輕劃I刀，葉背朝下緊貼培養(yǎng)基放置，接種在改良 MS+2, 4-DO. lmg/L+BAO. 5mg/L+NAA20. Omg/L+3. Og/L phytagel+20g/L 鹿糖胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，PH值5. 8，暗培養(yǎng)10d，誘導體胚性愈傷組織為輻射材料。
用輻射劑量為30Gy的6°Co_r射線對輻射材料輻射處理90分鐘，將輻射后的材料， 轉入改良MS+2. Omg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖胚性愈傷組織分化培養(yǎng)基上，pH值5.8，在溫度為25°C條件下繼續(xù)暗培養(yǎng)35d，中間繼代一次。
將上述培養(yǎng)材料轉移到溫度為26°C，光照為1800LX，光照時間為16h/d組培室條件下培養(yǎng)，約15d分化產生綠芽，綠芽轉入改良MS+2. Omg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d。
將上述生長發(fā)育健壯的叢芽長到4cm切成單株轉接到1/2MS+IBA O. 2mg/L生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15d形成具有根、莖、葉的完整再生植株，即可煉苗移栽。
通過本發(fā)明方法獲得的愈傷組織綠芽分化率為79%。
實施例3
以試管苗第3到第6片展開葉為外植體，葉片帶短葉柄，將葉片周圍帶鋸齒狀葉緣切去，葉片沿主脈切成左右2半，在葉片上輕劃I刀，葉背朝下緊貼培養(yǎng)基放置，接種在改良 MS+2, 4-DO. lmg/L+BAO. 5mg/L+NAA20. Omg/L+3. Og/L phytagel+20g/L 鹿糖胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，pH值5. 8，暗培養(yǎng)10d，誘導體胚性愈傷組織為輻射材料。
用輻射劑量為15Gy的6tlCor射線對輻射材料輻射處理120分鐘，將輻射后的材料， 轉入改良MS+2. 0mg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖胚性愈傷組織分化培養(yǎng)基上，pH值5.8，之后在溫度為25°C條件下繼續(xù)暗培養(yǎng)40d，中間繼代一次。
將上述培養(yǎng)材料轉移到溫度為27°C，光照為2000LX，光照時間為14h/d組培室條件下培養(yǎng)，約15d分化產生綠芽，綠芽轉入改良MS+2. 0mg/L BA+3. 5g/Lphytagel+20g/L蔗糖愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d。
將上述生長發(fā)育健壯的叢芽長到4cm切成單株轉接到1/2MS+IBA 0. 2mg/L生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20d形成具有根、莖、葉的完整再生植株，即可煉苗移栽。
通過本發(fā)明方法獲得的愈傷組織綠芽分化率為67%。
本發(fā)明所述改良MS培養(yǎng)基成分為
權利要求
1.一種利用6tlCo r射線輻射誘變紅葉石楠體細胞育種的方法，其特征在于以在愈傷組織增殖培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)獲得的紅葉石楠胚性愈傷組織為輻射材料，用輻照劑量為 15-45Gy的6tlCo r射線輻射對其處理1_2小時，然后將輻射處理后的愈傷組織轉到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，在溫度為25±2°C條件下暗培養(yǎng)30-35天，之后將暗培養(yǎng)后的紅葉石楠材料轉移到組培室光照條件下培養(yǎng)，溫度為25 ± 2 °C，光照為1500LX-1800LX，光照時間為 14-16h/d，15±2d后分化產生綠芽，綠芽先轉到愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20±2d，轉移到生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培育，直至得到完整紅葉石楠組培苗即可移栽至大田種植；其中上述愈傷組織增殖培養(yǎng)基組成為改良MS+2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) O. lmg/L+6-芐基氨基嘌呤(BA) O. 5mg/L+ 萘乙酸(NAA) 20. Omg/L+phytagel 3. Og/L+ 鹿糖 20g/L ；上述愈傷組織分化培養(yǎng)基組成為改良MS+6-芐基氨基嘌呤(BA) 2. Omg/ L+phytagel3. 5g/L+ 鹿糖 20g/L ；上述生根培養(yǎng)基組成為1/2MS+吲哚丁酸(IBA) O. 2mg/L ；上述各種培養(yǎng)基在高壓滅菌前，調整PH值至5. 8。
2.根據權利要求I所述的利用6tlCor射線輻射誘變紅葉石楠體細胞育種的方法，其特征在于所述6tlCo r射線輻射處理的輻照劑量設置為30Gy，處理時間設置為90分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用60Co r射線輻射誘變紅葉石楠體細胞育種的方法，是以在愈傷組織增殖培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)獲得的紅葉石楠胚性愈傷組織為輻射材料，用輻照劑量為15-45Gy的60Co r射線輻射對其處理1-2小時，然后將輻射處理后的愈傷組織轉到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，在溫度為25±2℃條件下暗培養(yǎng)30-35天，之后轉移到組培室光照條件下培養(yǎng)，愈傷組織綠芽分化率高達79%，由輻射誘變篩選的細胞再生出植株。本發(fā)明適宜用于植物新品種選育，為在細胞水平上開展植物體細胞突變體育種提供條件。
文檔編號A01H4/00GK102934613SQ20121050042
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權日2012年11月30日
發(fā)明者燕麗萍, 梁慧敏, 夏陽, 劉翠蘭, 毛秀紅, 孫超 申請人:山東省林業(yè)科學研究院, 江蘇農林職業(yè)技術學院