專利名稱：皺木耳菌株kbs-28及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及皺木耳菌株KBS-28及制備方法。
背景技術(shù)：
皺木耳Juricw/aria別名脆木耳、多皺木耳、砂耳等,屬于木耳目木耳科木耳屬的一種
在皺木耳栽培技術(shù)中，優(yōu)良菌種的獲得是關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。皺木耳菌株的獲得通常是利用子實(shí)體或孢子進(jìn)行分離、純化，直接應(yīng)用于皺木耳的栽培或菌絲體生產(chǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)的不足在于其生物學(xué)特性目前仍處于試驗(yàn)研究階段，生物轉(zhuǎn)化率較低，而且還要用熟料栽培，生產(chǎn)工藝及技術(shù)要素要求較高，因而制約了皺木耳商品經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。另外只能根據(jù)菌絲形態(tài)及分離物來初步確定是否為皺木耳純培養(yǎng)物；生產(chǎn)的菌種一般用固體菌種。目前在國內(nèi)采用 液體菌種進(jìn)行皺木耳資源的保護(hù)應(yīng)用不廣泛。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是克服現(xiàn)有技術(shù)不足，利用云南原產(chǎn)地皺木耳子實(shí)體篩選出優(yōu)良菌株，采用生物技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定，制備皺木耳液體及固體優(yōu)良菌種，為皺木耳資源保護(hù)提供優(yōu)良菌種
本發(fā)明采用的真菌是皺木耳delicata KBS-28 ;保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2012年10月11日；保藏登記入冊的編號CGMCC No. 6705
實(shí)體一般較小，膠質(zhì)，耳形或圓盤形，無柄，著生于腐木上，直徑1-7 cmXl-4cm。子實(shí)層生里面，淡紅褐色，有白色粉末，有明顯皺褶并形成網(wǎng)格，外面稍皺，紅褐色。孢子透明無色，光滑，圓筒形，彎曲，10-13 μ mX5-6 μ m,擔(dān)子棒狀,三橫隔,40-45 μ mX4_5 μ m本發(fā)明的技術(shù)方案
①采集野生皺木耳子實(shí)體；
②組織分離或孢子分離；
③純化菌株及菌株鑒定；
④生物學(xué)特性比較及生產(chǎn)性狀比較；
⑤確定優(yōu)良菌株；
⑥菌種生產(chǎn)及菌種應(yīng)用；
經(jīng)過反復(fù)篩選，獲得菌絲體產(chǎn)量高、抗污染的皺木耳液體菌種專用菌株KBS-28 本發(fā)明真菌delicata培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)
菌種分離純化培養(yǎng)基2%皺木耳下腳料、O. 001%VB1、2%葡萄糖、2%瓊脂；
皺木耳菌株分離及鑒定方法1、將皺木耳子實(shí)體組織塊或孢子液接種到上述試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于18-24°C下培養(yǎng)5-10天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得皺木耳分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得皺木耳純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定,通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的皺木耳(Auriculeirieidelicata) Identities=524/537 (97%)，Gaps=8/537 (1%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為皺木耳菌絲體
本發(fā)明皺木耳菌種的制備方法分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種
液體菌種制備方法
液體培養(yǎng)基配方為30%蔗渣、10 20%麩皮、10 20%土豆、O. 5 1%蔗糖，余下為水，pH自 然
1、將皺木耳的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160r/min，培養(yǎng)時(shí)間5_7天
3、將搖瓶菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0. 8ν/(ν ·π η);攪拌轉(zhuǎn)速為120-160r/min ;接種量為5-10% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. O ;溫度為20-26°C ;通氣培養(yǎng)72-96小時(shí)，獲得皺木耳液體菌種
固體菌種制備方法
固體培養(yǎng)基配方為木屑890%、麩皮10%、碳酸鈣1%、ρΗ自然
1、將皺木耳的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160 r/min，培養(yǎng)時(shí)間5_7天
2、采用前述固體培養(yǎng)基配方。將培養(yǎng)料混合后，加水拌均勻后，裝入750ml的大口瓶中，壓緊封口后在120°C滅菌60分鐘，接入液體菌種，于20-26°C培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長滿
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例一
1、將皺木耳子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于18°C下培養(yǎng)10天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得皺木耳分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18°C下培養(yǎng)7天，獲得皺木耳純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定,通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的皺木耳iAuriculariadelicata) Identities=525/528 (99%)，Gaps=l/528 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為皺木耳菌絲體
Auricularia delicata KBS-28的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，18°C下培養(yǎng)7天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為30%蔗渣、10%麩皮、10% 土豆、O. 5%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。于20°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120rpm，培養(yǎng)時(shí)間7天，獲得一級液體菌種
將一級液體菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0. 8v/(v *min)；攪拌轉(zhuǎn)速為120r/min ;接種量為5% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. O ;溫度為22°C ;通氣培養(yǎng)96小時(shí)，獲得皺木耳液體菌種實(shí)施例二
菌種制備的步驟與實(shí)施例一相同
1、將皺木耳子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于22°C下培養(yǎng)6天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的 菌株，獲得皺木耳分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于22°C下培養(yǎng)6天，獲得皺木耳純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定,通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的皺木耳(Auriculeirieidelicata) Identities=525/528 (99%)，Gaps=l/528 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為皺木耳菌絲體
Auricularia delicata KBS-28的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，22°C下培養(yǎng)6天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為30%蔗渣、15%麩皮、15% 土豆、O. 6%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。于22°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，培養(yǎng)時(shí)間6天，獲得一級液體菌種
將一級液體菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0. 8v/(v *min)；攪拌轉(zhuǎn)速為140r/min ;接種量為8% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. O ;溫度為24°C ;通氣培養(yǎng)84小時(shí)，獲得皺木耳液體菌種實(shí)施例三
1、將皺木耳子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得皺木耳分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，獲得皺木耳純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定,通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的皺木耳(Auriculeirieidelicata) Identities=525/528 (99%)，Gaps=l/528 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為皺木耳菌絲體
Auricularia deIicataH的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，24°C下培養(yǎng)5天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為30%蔗渣、20%麩皮、20% 土豆、O. 5%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。于26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為160rpm，培養(yǎng)時(shí)間5天，獲得一級液體菌種
將一級液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為木屑890%、麩皮10%、碳酸鈣1%、PH自然。將各原料按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml, 120°C滅菌60分鐘后，接種后置于26°C培養(yǎng)15天，獲得皺木耳固體菌種實(shí)施例四
1、將皺木耳子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得皺木耳分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，獲得皺木耳純化試管種 3、采用供試子實(shí)體與對應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定,通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的皺木耳(Auriculeirieidelicata) Identities=525/528 (99%)，Gaps=l/528 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為皺木耳菌絲體
Auricularia deIicataH的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，24°C下培養(yǎng)5天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為30%蔗渣、18%麩皮、10% 土豆、1%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。于26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為160rpm，培養(yǎng)時(shí)間5天，獲得一級液體菌種
將一級液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為木屑890%、麩皮10%、碳酸鈣1%、PH自然。將各原料按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml, 120°C滅菌60分鐘后，接種后置于20°C培養(yǎng)20天，獲得皺木耳固體菌種。
權(quán)利要求
1.一種皺木耳菌株，其特征在于所述菌株為ofe/icaia ) KBS-28,該菌株的保藏號為CGMCC NO. 6705。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皺木耳菌株的制備方法，所述菌株是經(jīng)過常規(guī)的液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的，其特征在于所述液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下 液體培養(yǎng)基配方為5-10%麩皮、O. 5-1%黃豆粉、O. 5-1%麥芽糖、1-3%玉米粉，余下為水，pH自然; 固體培養(yǎng)基配方為木屑75-90%、麩皮5-20%、磷肥1%、石膏1%、羊。
全文摘要
本發(fā)明涉及皺木耳菌株的篩選及制備方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的菌株AuriculariadelicataKBS-28已于2012年10月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.6705。利用該菌株制備的液體及固體優(yōu)良菌種，應(yīng)用于皺木耳的促繁有著顯著的社會、經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A01H15/00GK102986538SQ201210503869
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月2日
發(fā)明者羅孝坤, 郭永紅, 張微思, 朱立, 田永生 申請人:中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所, 云南省供銷合作社科學(xué)研究所, 昆明菌苑食品有限公司