專利名稱：一種評價轉(zhuǎn)基因棉花對糞甲蟲影響的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因作物生態(tài)風(fēng)險評價技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種評價轉(zhuǎn)Bt基因棉花對糞甲蟲影響的檢測方法。
背景技術(shù)：
目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，顯著地提高了農(nóng)作物產(chǎn)量，但由于其不同于傳統(tǒng)意義上的作物育種，人們很難預(yù)測基因進入一個新的遺傳背景會產(chǎn)生什么樣的后果。所以，各國科學(xué)家在注重轉(zhuǎn)基因作物帶來效益的同時，也一直關(guān)注其潛在的生態(tài)風(fēng)險。
1987年，Vaeck首次報道將Bt殺蟲蛋白基因轉(zhuǎn)入棉花，開啟了轉(zhuǎn)基因棉花的大規(guī)模種植年代。截至目前，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種植面積占全球棉花種植面積的20%以上。其中，作為世界上抗蟲棉種植面積最大的國家，我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種植面積超過棉花種植總面積的70%?？瓜x棉能有效提高棉花產(chǎn)量、減少殺蟲劑用量、節(jié)約勞力等，具有巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。然而，由于不同類型Bt殺蟲蛋白有不同的殺蟲譜，因而轉(zhuǎn)基因棉花中不同Bt基因表達必然會對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等許多非靶標(biāo)昆蟲產(chǎn)生影響。因此，隨著轉(zhuǎn)基因棉花在全球范圍內(nèi)的大規(guī)模種植，對其生態(tài)安全性尤其是轉(zhuǎn)Bt基因?qū)Ψ前袠?biāo)昆蟲影響的評價工作也大量開展。而對于轉(zhuǎn)基因棉花可能對土壤動物產(chǎn)生的影響，主要集中于鱗翅目昆蟲及其幼蟲，關(guān)于抗蟲棉對土壤動物中的鞘翅目昆蟲影響的評價則很少開展，尤其是鞘翅目中非常重要的一類-糞甲蟲的相關(guān)研究尚未見報道。糞甲蟲是一類全變態(tài)昆蟲，其生活周期有卵、幼蟲、蛹和成蟲四個階段。糞甲蟲成蟲對新鮮動物糞便(尤其是牛糞)極為喜好，除在牛糞中取食外，還在其中交配、產(chǎn)卵并完成卵化等過程，因此其生活史主要是在動物糞便或其他碎屑系統(tǒng)中完成，是一類典型的大型土壤動物。糞甲蟲在生態(tài)系統(tǒng)功能過程如促進養(yǎng)分循環(huán)，增加生物擾動，提高植物生產(chǎn)力，二次種子傳播者，控制寄生蟲，與有益寄生蟲的協(xié)同進化，控制蒼蠅及傳粉等中具有非常重要的作用。糞甲蟲成蟲為咀嚼式口器，主要取食牛糞中微生物含量高的流質(zhì)食物和易消化的植物殘渣，固體食物顆粒直徑一般小于O. 03mm，其幼蟲對食物的選擇性不強。環(huán)境條件適宜的情況下，糞甲蟲在3-6天就開始產(chǎn)卵，卵化時間在產(chǎn)卵后5天左右開始，其幼蟲階段較長，也可能以幼蟲的形式越冬。因此，通過將棉花粉碎(顆粒直徑小于O. 03mm)與牛糞充分混合后飼養(yǎng)糞甲蟲，能快速有效地檢測抗蟲棉對糞甲蟲群落特征和結(jié)構(gòu)的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于填補目前評價轉(zhuǎn)Bt基因棉花對糞甲蟲影響的檢測方法空白。本發(fā)明的方法，是根據(jù)糞甲蟲的取食特點和生活史特征，利用新鮮牛糞與粉碎棉花葉的混合物飼養(yǎng)糞甲蟲，能快速有效地檢測轉(zhuǎn)Bt基因棉花對非靶標(biāo)生物的影響。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用新鮮牛糞與粉碎棉花葉的混合物檢測轉(zhuǎn)Bt基因棉花對糞甲蟲的影響。上述牛糞為新鮮牛糞。
上述粉碎棉花葉為新鮮棉花葉，粉碎后的顆粒直徑小于O. 03mm。本發(fā)明具有如下的有益效果
本發(fā)明屬于檢測新方法，由于考慮到糞甲蟲的取食特點，將新鮮棉花葉粉碎至顆粒直徑小于O. 03_后，不會影響糞甲蟲及其幼蟲對棉花葉的取食。考慮到糞甲蟲的生活史特征，利用糞甲蟲對新鮮牛糞的依賴性，有效吸引甲蟲，同時牛糞的成本低廉，極大地節(jié)約了成本。另外，本發(fā)明充分利用糞甲蟲的產(chǎn)卵期和卵化期較短的特征，能夠在短期內(nèi)檢測到轉(zhuǎn)基因棉花對甲蟲種群特征的影響，極大地縮短了檢測周期。本發(fā)明操作方法簡單，成本低，檢測時間短，對于評價轉(zhuǎn)Bt基因棉花對糞甲蟲的影響具有廣闊的應(yīng)用前景。實驗證明，使用本發(fā)明所提供的利用新鮮牛糞與粉碎棉花評價轉(zhuǎn)Bt基因作物對糞甲蟲群落影響的方法，達到了預(yù)期目的。


圖I為轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉及其親本處理中的甲蟲產(chǎn)卵率比較 圖2為轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉及其親本處理中的甲蟲卵化率比較 圖3為轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉及其親本處理中的甲蟲成蟲死亡率比較圖。
具體實施例方式本發(fā)明的方法主要包括如下四個部分
I、收集新鮮棉花葉并粉碎收集轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉及其親本的新鮮棉花葉，于冰箱內(nèi)在-10°C冷凍24小時后粉碎，顆粒直徑小于O. 03mm。2、收集新鮮牛糞新鮮牛糞中不包含任何大型分解者，避免其他分解者與目標(biāo)糞甲蟲的相互關(guān)系而影響檢測結(jié)果。3、新鮮牛糞與粉碎棉花葉均勻混合將不含其它分解者的新鮮牛糞與粉碎的棉花葉按照一定比例充分混合。4、檢測時間檢測開始后的第7、第14和第21天。5、檢測項目成蟲死亡率,產(chǎn)卵率和卵化率。
實施例2012年8月底，收獲轉(zhuǎn)Bt基因棉花品種(中30)及其親本(中16)的棉花葉各200g帶回實驗室，置于冰箱內(nèi)于-10°C冷凍24小時后充分粉碎，顆粒直徑小于O. 03mm。將粉碎的棉花葉40g與360g新鮮牛糞均勻混合；將混合樣400g裝入網(wǎng)孔之間為O. 2mm的紗袋內(nèi)，再將捕獲的糞甲蟲(游蕩蜉金龜)8只接種入紗袋中，將紗袋密封后置于戶外地表；分別于第7，第14和第21天記錄紗袋中的甲蟲卵，幼蟲和成蟲數(shù)量，計算其產(chǎn)卵率，卵化率和死亡率。結(jié)果顯示，中30處理中的甲蟲產(chǎn)卵率顯著低于中16 (圖I);兩個棉花品種中的卵化率無明顯差異(圖2);在第7天，中30處理中的成蟲死亡率顯著高于于中16處理，至第14天，中30處理中的成蟲死亡率達到100% (圖3)。以上實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Bt基因棉花對糞甲蟲具有明顯的影響。因此，利用新鮮牛糞與粉碎棉花葉的混合物檢測轉(zhuǎn)Bt基因棉花對非靶標(biāo)糞甲蟲影響的方法是可行的，準確的，快速的。
權(quán)利要求
1.一種評價轉(zhuǎn)基因棉花對糞甲蟲影響的檢測方法，其特征是利用粉碎棉花葉和新鮮牛糞的混合物飼養(yǎng)甲蟲用于評價轉(zhuǎn)Bt基因棉花對糞甲蟲的影響，具體由以下步驟構(gòu)成 (O收集新鮮棉花葉并粉碎收集轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉及其親本的新鮮棉花葉，于冰箱內(nèi)在-10°C冷凍24小時后粉碎，顆粒直徑小于O. 03mm ； (2)收集新鮮牛糞新鮮牛糞中不包含任何大型分解者，避免其他分解者與目標(biāo)糞甲蟲的相互關(guān)系而影響檢測結(jié)果； (3)新鮮牛糞與粉碎棉花葉均勻混合將不含其它分解者的新鮮牛糞與粉碎的棉花葉按照9:1質(zhì)量比充分混合； (4)檢測時間檢測開始后的第7、第14和第21天； (5)檢測項目成蟲死亡率，產(chǎn)卵率和卵化率。
2.權(quán)利要求I所述的一種評價轉(zhuǎn)Bt基因棉花對糞甲蟲影響的檢測方法在轉(zhuǎn)基因作物對糞甲蟲群落影響的評價中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因作物生態(tài)風(fēng)險評價技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種評價轉(zhuǎn)基因棉花對糞甲蟲影響的檢測方法。以轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉及其親本和糞甲蟲為檢測對象，收集新鮮棉花葉，于冰箱內(nèi)在-10℃冷凍24小時后粉碎，顆粒直徑小于0.03mm；稱取粉碎棉花葉與新鮮牛糞按一定比例均勻混合；將混合樣裝入網(wǎng)孔直徑為0.2mm的紗袋內(nèi)，接種糞甲蟲后密封紗袋，置于戶外地表；分別于第7，第14和第21天記錄紗袋中的甲蟲卵，幼蟲和成蟲數(shù)量，計算其產(chǎn)卵率，卵化率和成蟲死亡率。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉處理中的甲蟲成蟲死亡率高，產(chǎn)卵率和卵化率低，說明轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉對糞甲蟲具有傷害作用。該檢測方法準確，快速，成本低，便于應(yīng)用。
文檔編號A01K67/033GK102960312SQ20121050648
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者孫書存, 吳新衛(wèi), 曹瑞 申請人:南京大學(xué)