專利名稱：一種評價轉基因棉花對非靶標生物影響的檢測方法
一種評價轉基因棉花對非靶標生物影響的檢測方法技術領域
本發(fā)明屬于轉基因作物生態(tài)風險評價領域，具體涉及一種利用雙斑青步甲評價轉 Bt基因棉花抗蟲性的檢測方法。
背景技術：
轉基因棉花于1996年開始大規(guī)模商業(yè)化種植，至2010年全球種植面積達到2100 萬hm2。轉基因棉花能有效控制棉田害蟲，降低種植成本，提高棉花產(chǎn)量。轉Bt基因棉花靶標生物為鱗翅目昆蟲，大量研究結果表明其在短期內對棉鈴蟲有很強的致死作用。然而，由于棉鈴蟲的適應性，轉Bt基因棉花抗蟲性的長期效果不得而知。目前，評價轉Bt基因棉花抗蟲性方法主要有葉片飼喂幼蟲法、葉片接種蟲卵法和酶聯(lián)免疫法。前兩種方法主要用鱗翅目幼蟲死亡率反映轉Bt基因棉花的抗蟲性，幼蟲死亡率高說明抗蟲性高；酶聯(lián)免疫法的原理則是利用抗蟲蛋白表達量反映抗蟲性。但這些方法都局限在小尺度范圍內，而且成本較高，在實際應用中有很大的局限性。因此，探索合適的評價轉Bt基因棉花抗蟲性的方法十分必要。
地表甲蟲是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)生物群落的重要組成部分，地表甲蟲在維持農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性、防治農(nóng)業(yè)害蟲和維持物質循環(huán)和能量流動方面有重要作用。根據(jù)其食性差異，甲蟲可劃分為植食性甲蟲、糞食性、肉食性甲蟲和雜食性甲蟲等幾大類。其中，肉食性甲蟲如步甲、瓢蟲等可以捕食多種農(nóng)業(yè)害蟲，是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中害蟲的主要天敵。相對于其他天敵，地表甲蟲移動范圍窄，以鱗翅目昆蟲為食的地表甲蟲對棉鈴蟲數(shù)量變化反應尤為敏感。研究表明，轉基因作物能夠改變農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的處于較高營養(yǎng)級水平的捕食性甲蟲的種群動態(tài)。
雙斑青步甲是棉田生態(tài)系統(tǒng)捕食性甲蟲中的優(yōu)勢種，主要捕食鱗翅目昆蟲。轉Bt 基因棉花對鱗翅目昆蟲有毒性，鱗翅目昆蟲取食含有殺蟲晶體蛋白的棉花會致死，數(shù)量減少，雙斑青步甲因得不到足夠食物而死亡或遷出棉田，數(shù)量降低。因此，可以根據(jù)雙斑青步甲的種群數(shù)量預測轉Bt基因棉花對鱗翅目昆蟲的致死程度，從而評價轉Bt基因棉花的抗蟲性。 發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于介紹一種利用棉田生態(tài)系統(tǒng)中處于高營養(yǎng)級的捕食者的種群特征指示轉Bt基因棉花抗蟲性的檢測方法。本發(fā)明方法是根據(jù)棉田生態(tài)系統(tǒng)食物鏈特征和雙斑青步甲生物學特性，通過陷阱法和引誘劑法相結合調查地表昆蟲，利用雙斑青步甲種群數(shù)量變化快速有效地檢測大田中轉Bt基因棉花的抗蟲性。
本發(fā)明的技術方案是利用雙斑青步甲檢測轉Bt基因棉花的抗蟲性。
上述棉花是指轉Bt基因棉花及其對照親本棉花。
上述甲蟲是指用陷阱法和引誘劑法捕獲的甲蟲。
上述捕食性甲蟲是指雙斑青步甲。
本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明屬于檢測新方法，利用棉田生態(tài)系統(tǒng)主要捕食性甲蟲-雙斑青步甲作為指示物種，檢測轉Bt基因棉花抗蟲效果，不需要大規(guī)模監(jiān)測轉Bt基因棉花的靶標生物相關指標， 極大地降低了勞動強度、節(jié)約了成本。
本發(fā)明操作方法簡單、成本低、可靠性高，在評價轉Bt基因棉花抗蟲效果方面具有廣闊的應用前景。


圖1為轉Bt基因及其親本棉田生態(tài)系統(tǒng)中的雙斑青步甲與棉鈴蟲之間的關系圖；圖2為轉Bt基因及其親本棉田生態(tài)系統(tǒng)中的棉鈴蟲密度分布圖；圖3為轉Bt基因及其親本棉田生態(tài)系統(tǒng)甲蟲捕食者中的雙斑青步甲所占比例。其中， A表示其他捕食者比例，B表示雙斑青步甲比例；圖4為室內試驗雙斑青步甲對棉鈴蟲的取食率。
具體實施方式
本發(fā)明的方法主要包括如下五個部分(1)確定轉Bt基因棉田和對照棉田生態(tài)系統(tǒng)中的雙斑青步甲-棉鈴蟲-棉花的三級食物鏈關系；(2)調查棉鈴蟲的數(shù)量；(3)調查雙斑青步甲的數(shù)量(4)建立雙斑青步甲和棉鈴蟲的數(shù)量關系(5)轉Bt基因棉田中的雙斑青步甲的數(shù)量低，說明轉Bt基因棉花具有強的抗蟲性實施例
2011年7月至9月，在南京環(huán)科所六合棉花基地，調查中棉30 (轉Bt基因棉)和中棉16 (中棉30親本，非轉基因棉)棉田中的捕食者和棉鈴蟲種群數(shù)量,每個棉花品種調查三塊樣地，每塊樣地面積為2畝左右。甲蟲調查采用陷阱法和引誘法相結合的方法，在每塊樣地按棋盤法布置30個誘杯，誘杯為內壁光滑的塑料杯(高12 cm, 口徑9 cm,杯壁上方1/4處打4個直徑為1. 5mm的排水孔)，每個誘杯加I份引誘劑，引誘劑為醋、糖、酒精、蜂蜜和水的混合物。先用微火將糖醋75%酒精質量比為5 :4 :1的混合物熬制成濃糖漿，熬制后每IOml濃糖漿混入5ml蜂蜜和20ml75%酒精作為I份引誘劑。每隔7天放一次引誘劑，誘杯放置時間為10天。記錄所有捕食者的數(shù)量并統(tǒng)計雙斑青步甲的數(shù)量。棉鈴蟲密度調查為抽樣調查法即每塊樣地選取6株棉花，記錄每株棉花上的棉鈴蟲數(shù)量。分別于7、8、 9月各調查一次。另外，在室內開展雙斑青步甲對棉鈴蟲的捕食效率實驗將2只雙斑青步甲和15只棉鈴蟲成蟲放置在透明玻璃箱內，重復3次，每天記錄一次棉鈴蟲剩余數(shù)。
調查結果顯示，雙斑青步甲和棉鈴蟲的密度之間顯著正相關(圖1);轉財基因棉田中棉鈴蟲數(shù)量顯著低于親本(圖2);雙斑青步甲在棉田甲蟲中比例高于60% (圖3)。室內實驗表明，雙斑青步甲能有效捕食棉鈴蟲，平均每天取食1. 4只(圖4)。
以上實驗結果表明，轉Bt基因棉花能顯著降低棉鈴蟲的數(shù)量，從而導致其主要捕食者-雙 斑青步甲的數(shù)量也明顯降低。因此，利用雙斑青步甲檢測轉Bt基因棉花抗蟲性的方法是可行的，準確的。
權利要求
1.一種評價轉基因棉花對非靶標生物影響的檢測方法，其特征是利用雙斑青步甲作為指示物種評價轉Bt基因棉花對鱗翅目昆蟲的抗性，具體由以下步驟構成(1)確定棉田生態(tài)系統(tǒng)中的雙斑青步甲-棉鈴蟲-棉花的三級食物鏈關系；(2)調查棉鈴蟲的數(shù)量；(3)調查雙斑青步甲的數(shù)量；(4)建立雙斑青步甲和棉鈴蟲的數(shù)量關系；(5)轉Bt基因棉田中的雙斑青步甲的數(shù)量低，說明轉Bt基因棉花具有強的抗蟲性。
2.權利要求1所述的評價轉基因棉花對非靶標生物影響的檢測方法在轉基因作物抗蟲性評價中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于轉基因作物生態(tài)風險評價領域，具體涉及一種利用雙斑青步甲評價轉Bt基因棉花抗蟲性的檢測方法。該方法的原理是利用棉田生態(tài)系統(tǒng)中的食物鏈關系、即雙斑青步甲-棉鈴蟲-棉花，以捕食者種群的數(shù)量反映轉Bt基因棉花對靶標生物-鱗翅目昆蟲(棉鈴蟲)的致死程度。在多年種植轉Bt棉花棉田和對照棉花棉田內，利用陷阱法和引誘劑法相結合誘捕雙斑青步甲，比較兩種棉花棉田內的雙斑青步甲數(shù)量。雙斑青步甲在轉Bt基因棉花棉田的數(shù)量低，說明轉Bt基因棉花抗蟲性高。該檢測方法準確，成本低，便于應用。
文檔編號A01G7/00GK102986462SQ20121050648
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月3日 優(yōu)先權日2012年12月3日
發(fā)明者孫書存, 吳新衛(wèi), 曹瑞 申請人:南京大學