專利名稱：控制害蟲的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種控制害蟲的方法，特別是涉及一種用在植物中表達(dá)的CrylA蛋白來控制桃蛀螟危害植物的方法。
背景技術(shù)：
桃姓螟(Conogethes punctiferalis)屬鱗翅目螟蛾科,為雜食性害蟲，除危害玉米、高粱等作物外，還危害桃、柿、板栗等果樹，廣泛分布于我國境內(nèi)，北起黑龍江、內(nèi)蒙古，南至臺灣、海南、廣東、廣西、云南南緣，東接前蘇聯(lián)東境、朝鮮北境，西面自山西、陜西西斜至寧夏、甘肅后，折入四川、云南、西藏。危害玉米時(shí)，主要蛀食雌穗，也可蛀莖，受害株率達(dá)30%-80% ;危害高粱時(shí)，初孵幼蟲蛀入高粱幼嫩籽粒內(nèi)，用糞便或食物殘?jiān)芽诜庾?，在其?nèi)蛀害，吃空一粒又轉(zhuǎn)一粒直至三齡前，三齡后吐絲結(jié)網(wǎng)綴合小穗中間留有隧道，在里面穿行啃食籽粒，嚴(yán)重的把高粱粒蛀食一空。此外還可蛀桿，危害情況類似玉米螟。玉米和高粱是中國重要的糧食作物，每年因桃蛀螟造成的糧食損失巨大，更甚者影響到當(dāng)?shù)厝丝诘纳鏍顩r。為了防治桃蛀螟，人們通常采用的主要防治方法有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治。農(nóng)業(yè)防治是把整個(gè)農(nóng)田生態(tài)系多因素的綜合協(xié)調(diào)管理，調(diào)控作物、害蟲、環(huán)境因素、創(chuàng)造一個(gè)有利于作物生長而不利于桃蛀螟發(fā)生的農(nóng)田生態(tài)環(huán)境。如利用處理桃蛀螟越冬寄主、拾毀落果和摘除蟲果、改革耕作制度、種植抗桃蛀螟品種和種植誘集田等措施降低桃蛀螟的危害。因農(nóng)業(yè)防治必須服從作物布局和增產(chǎn)的要求，應(yīng)用有一定的局限性，不能作為應(yīng)急措施，在桃蛀螟爆發(fā)時(shí)就顯得無能為力?；瘜W(xué)防治即農(nóng)藥防治，是利用化學(xué)殺蟲劑來殺滅害蟲，是桃蛀螟綜合治理的重要組成部分，它具有快速、方便、簡便和高經(jīng)濟(jì)效益的特點(diǎn)，特別是桃蛀螟大發(fā)生的情況下，是必不可少的應(yīng)急措施，它可以在桃蛀螟造成危害前將其消滅。目前化學(xué)防治方法主要有化學(xué)誘殺、藥液噴霧等。但化學(xué)防治也有其局限性，如使用不當(dāng)往往會導(dǎo)致農(nóng)作物發(fā)生藥害、害蟲產(chǎn)生抗藥性，以及殺傷天敵、污染環(huán)境，使農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞和農(nóng)藥殘留對人、畜的安全構(gòu)成威脅等不良后果。
生物防治是利用某些有益生物或生物代謝產(chǎn)物來控制害蟲種群數(shù)量，以達(dá)到降低或消滅害蟲的目的。其特點(diǎn)是對人、畜安全，對環(huán)境污染少，對某些害蟲可達(dá)到長期控制的目的；但是效果常不穩(wěn)定，并且不論桃蛀螟發(fā)生輕重均需同樣投資進(jìn)行。為了解決農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，科學(xué)家們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些抗蟲轉(zhuǎn)基因植物以防治植物蟲害。CrylA殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是由蘇云金芽孢桿菌庫斯塔基亞種(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, B. t. k.)產(chǎn)生的不溶性伴抱結(jié)晶蛋白。Cry IA蛋白被昆蟲攝入進(jìn)入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性pH環(huán)境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉(zhuǎn)變成活性片段；活性片段和昆蟲中腸上皮細(xì)胞膜上表面上受體結(jié)合，插入腸膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)穿孔病灶，破壞細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導(dǎo)致其死亡。已證明轉(zhuǎn)CrylA基因的植株可以抵抗玉米螟、棉鈴蟲、二化螟等鱗翅目(Lepidoptera)害蟲的侵害,然而,至今尚無關(guān)于通過產(chǎn)生表達(dá)CrylA蛋白的轉(zhuǎn)基因植株來控制桃蛀螟對植物危害的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種控制害蟲的方法，首次提供了通過產(chǎn)生表達(dá)CrylA蛋白的轉(zhuǎn)基因植株來控制桃蛀螟對植物危害的方法，且有效克服現(xiàn)有技術(shù)農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等技術(shù)缺陷。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種控制桃蛀螟害蟲的方法，包括將桃蛀螟害蟲與CrylA蛋白接觸。
優(yōu)選地,所述CrylA蛋白為CrylAb蛋白或CrylAh蛋白。進(jìn)一步地,所述CrylAb蛋白存在于產(chǎn)生所述CrylAb蛋白的植物細(xì)胞中，所述桃蟲主螟害蟲通過攝食所述植物細(xì)胞與所述CrylAb蛋白接觸。更進(jìn)一步地,所述CrylAb蛋白存在于產(chǎn)生所述CrylAb蛋白的轉(zhuǎn)基因植物中，所述桃蛀螟害蟲通過攝食所述轉(zhuǎn)基因植物的組織與所述CrylAb蛋白接觸，接觸后所述桃蛀螟害蟲生長受到抑制并最終導(dǎo)致死亡，以實(shí)現(xiàn)對桃蛀螟危害植物的控制。進(jìn)一步地，所述CrylAh蛋白存在于產(chǎn)生所述CrylAh蛋白的植物細(xì)胞中，所述桃蟲主螟害蟲通過攝食所述植物細(xì)胞與所述CrylAh蛋白接觸。更進(jìn)一步地,所述CrylAh蛋白存在于產(chǎn)生所述CrylAh蛋白的轉(zhuǎn)基因植物中，所述桃蛀螟害蟲通過攝食所述轉(zhuǎn)基因植物的組織與所述CrylAh蛋白接觸，接觸后所述桃蛀螟害蟲生長受到抑制并最終導(dǎo)致死亡，以實(shí)現(xiàn)對桃蛀螟危害植物的控制。所述轉(zhuǎn)基因植物可以處于任意生育期。所述轉(zhuǎn)基因植物的組織可以為葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥或花絲。所述對桃蛀螟危害植物的控制不因種植地點(diǎn)的改變而改變。所述對桃蛀螟危害植物的控制不因種植時(shí)間的改變而改變。所述植物可以來自玉米、高粱、粟、向日葵、蓖麻、姜、棉花、桃、柿、核桃、板栗、無花果或松樹。所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述CrylA蛋白的多核苷酸的植物。優(yōu)選地，所述CrylA蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2或SEQ IDN0:3所示的氨基酸序列。所述CrylA蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6或SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述植物還可以產(chǎn)生至少一種不同于所述CrylA蛋白的第二種核苷酸。進(jìn)一步地，所述第二種核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶。優(yōu)選地，所述第二種核苷酸可以編碼CrylIe蛋白、CrylFa蛋白、Vip3A蛋白或CrylBa 蛋白。更進(jìn)一步地，所述第二種核苷酸包括SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列?？蛇x擇地，所述第二種核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。在本發(fā)明中，Cry lA蛋白在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可以伴隨著一個(gè)或多個(gè)Cry類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉(zhuǎn)基因植物中共同表達(dá)可以通過遺傳工程使植物包含并表達(dá)所需的基因來實(shí)現(xiàn)。另外，一種植物(第I親本)可以通過遺傳工程操作表達(dá)CrylA蛋白質(zhì)，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達(dá)Cry類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)。通過第I親本和第2親本雜交獲得表達(dá)引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。因此在本發(fā)明中可以使用RNAi技術(shù)特異性剔除或關(guān)閉目標(biāo)昆蟲害蟲中特定基因的表達(dá)。桃姓螟(Conogethespunctiferalis)與玉米螟(Ostrinia nubilalis)同屬鱗翅目螟蛾科，為雜食性害蟲，盡管如此，桃蛀螟與玉米螟在生物學(xué)上是清晰的、截然不同的兩個(gè)物種，至少存在以下主要區(qū)別I、食性不同。桃蛀螟不僅取食玉米等禾本科作物，同時(shí)也喜食桃、石榴、板栗、柿等果樹；而玉米螟明顯嗜好禾本科作物，最常危害高粱、玉米等。2、分布區(qū)域不同。桃蛀螟遍布中國全境，在日本、朝鮮半島、英國、澳大利亞等地也有分布。玉米螟包括亞洲玉米螟和歐洲玉米螟，其中亞洲玉米螟分布在中國東部及西南主要玉米、高粱產(chǎn)區(qū)；歐洲玉米螟主要分布在中國的新疆及歐洲、北美洲、西非及小亞細(xì)亞地區(qū)。從分布區(qū)域上來講，桃蛀螟的分布區(qū)域較歐洲玉米螟和亞洲玉米螟都要廣。3、為害習(xí)性不同。桃蛀螟為害高粱時(shí)，初孵幼蟲蛀入高粱幼嫩籽粒內(nèi)，用糞便或食物殘?jiān)芽诜庾?，在其?nèi)蛀害，吃空一粒又轉(zhuǎn)一粒直至三齡前；三齡后吐絲結(jié)網(wǎng)綴合小穗中間留有隧道，在里面穿行啃食籽粒，嚴(yán)重的把高粱粒蛀食一空；此外還可蛀桿；為害玉米時(shí),主要蛀食雌穗,蛀入幼嫩籽粒后產(chǎn)生黏性糞便堵住蛀孔,在蛀孔內(nèi)轉(zhuǎn)粒為害；同時(shí)也可蛀莖、葉片、籽粒；桃蛀螟為害時(shí)常產(chǎn)生黏性糞便，增加了霉菌發(fā)生的概率，尤其是增加了黃曲霉的發(fā)生概率，影響了詞料加工。而玉米纟貝幼蟲鮮出后，先聚集在一起，然后在植株幼嫩部分爬行，開始危害；初孵幼蟲，能吐絲下垂，借風(fēng)力飄遷鄰株，形成轉(zhuǎn)株危害；幼蟲多為五齡，三齡前主要集中在幼嫩心葉、雄穗、苞葉和花絲上活動取食，被害心葉展開后，即呈現(xiàn)許多橫排小孔；四齡以后，大部分鉆入莖桿；玉米螟可為害玉米植株地上的各個(gè)部位，葉片被幼蟲咬食后，會降低其光合效率；雄穗被蛀，常易折斷，影響授粉；苞葉、花絲被蛀食，會造成缺粒和秕粒；莖桿、穗柄、穗軸被蛀食后,形成隧道,破壞植株內(nèi)水分、養(yǎng)分的輸送,使莖桿倒折率增加，籽粒產(chǎn)量下降。各地的春、夏、秋播玉米都有不同程度受害，尤以夏播玉米最重。I、形態(tài)特征不同。I)卵形態(tài)不同桃蛀螟卵長O. 6-0. 7_，卵面粗糙，密布細(xì)小圓形刻點(diǎn)或網(wǎng)狀花紋，孵化前為橙紅色，單粒散產(chǎn)于粗糙表面；而玉米螟卵成扁平橢圓形，孵化前端部附近出現(xiàn)小黑點(diǎn)，數(shù)十粒呈魚鱗狀不規(guī)則排列。2)幼蟲形態(tài)不同桃蛀螟幼蟲體色多變，淺灰至暗紅色，腹面多為淡綠色，頭部暗褐色，體背暗紅色，腹面淡綠色，前胸背板和臀板深褐色，各體節(jié)毛片明顯，灰褐至黑褐色，第I - 8腹節(jié)上各具8個(gè)，排成兩列，前列6個(gè)較大，后列2個(gè)較小，3齡后雄性幼蟲第5腹節(jié)背面出現(xiàn)2個(gè)暗褐色性腺；而玉米螟幼蟲背部黃白色至淡暗紅褐色，頭和前胸背板深褐色，背線明顯，兩側(cè)有較模糊的暗褐色亞背線，腹部1-8節(jié)有毛瘤兩列，前列4個(gè)，后列2個(gè)。3)蛹形態(tài)不同桃蛀螟蛹初期為淡黃綠色，后變深褐色，頭部、腹部第1-8節(jié)背面密布細(xì)小突起，第5-7節(jié)腹部前緣有I條由小齒狀突構(gòu)成的突起線，腹部末端有細(xì)長卷曲的鉤刺6根；而玉米螟蛹黃褐色，腹背密布橫皺紋，腹末有5-8根鉤刺。4)成蟲形態(tài)不同 桃蛀螟成蟲黃至橙黃色，胸、腹部及翅上具有很多黑色斑點(diǎn)，前胸兩側(cè)的被毛上各具I個(gè)黑點(diǎn)，雄蛾腹部第9節(jié)末端為黑色，甚為明顯，較鈍，有黑色毛叢，雌蛾腹部末端圓錐形，末節(jié)僅背面端部有極少的黑色鱗片；而玉米螟成蟲前翅黃褐色，有兩條褐色波狀橫紋，兩紋之間有兩條黃褐色短紋，后翅灰褐色，雌蛾翅色較雄蛾淺淡，前翅呈現(xiàn)黃色，內(nèi)、外橫線及斑紋不及雄蛾明顯。5、生長習(xí)性和發(fā)生規(guī)律不同。桃蛀螟在遼寧年生1-2代，河北、山東、陜西3代，河南4代，長江流域4-5代，均以老熟幼蟲在玉米、向日葵、蓖麻等殘株內(nèi)結(jié)繭越冬；在河南I代幼蟲于5月下旬-6月下旬先在桃樹上危害，2-3代幼蟲在桃樹和高粱上都能危害，第4代則在夏播高粱和向日葵上危害，以4代幼蟲越冬，翌年越冬幼蟲于4月初化蛹，4月下旬進(jìn)入化蛹盛期，4月底-5月下旬羽化，越冬代成蟲把卵產(chǎn)在桃樹上；6月中旬-6月下旬I代幼蟲化蛹，I代成蟲于6月下旬開始出現(xiàn)，7月上旬進(jìn)入羽化盛期，2代卵盛期跟著出現(xiàn)，這時(shí)春播高粱抽穗揚(yáng)花，7月中旬為2代幼蟲危害盛期；2代羽化盛期在8月上、中旬，這時(shí)春高粱近成熟，晚播春高粱和早播夏高粱正抽穗揚(yáng)花，成蟲集中在這些高粱上產(chǎn)卵，第3代卵于7月底8月初孵化，8月中、下旬進(jìn)入3代幼蟲危害盛期；8月底3代成蟲出現(xiàn)，9月上中旬進(jìn)入盛期，這時(shí)高粱和桃果已采收，成蟲把卵產(chǎn)在晚夏高粱和晚熟向日葵上，9月中旬-10月上旬進(jìn)入4代幼蟲發(fā)生為害期，10月中、下旬氣溫下降則以4代幼蟲越冬。在河南I代卵期8天，2代4. 5天，3代4. 2天，越冬代6天；I代幼蟲歷期19. 8天，2代13. 7天，3代13. 2天，越冬代208天，幼蟲共5齡；I代蛹期8. 8天，2代8. 3天，3代8. 7天，越冬代19. 4天；一代成蟲壽命7. 3天，2代7. 2天，3代7. 6天，越冬代10. 7天。成蟲羽化后白天潛伏在高粱田經(jīng)補(bǔ)充營養(yǎng)才產(chǎn)卵，把卵產(chǎn)在吐穗揚(yáng)花的高粱上，卵單產(chǎn)，每雌可產(chǎn)卵169粒，一穗產(chǎn)卵3-5粒，在四川宜賓從秋玉米抽雄至蠟熟階段把卵產(chǎn)在雄穗、雌穗、葉鞘合縫處或葉耳正反面，百株卵量高達(dá)1729粒；幼蟲者熟后在穗中或葉腋、葉鞘、枯葉處及高粱、玉米、向日葵秸桿中越冬；雨多年份發(fā)生重，近年來受全球溫室效應(yīng)的影響，華北及東北地區(qū)夏季雨水量大，使得桃蛀螟逐步成為華北地區(qū)的主要玉米害蟲，但由于其食性雜，常在不同寄主間轉(zhuǎn)移為害，且最愛以鉆蛀果穗及莖桿為害，一般噴灑農(nóng)藥難以防治。而玉米螟的發(fā)生代數(shù)隨緯度而有顯著的差異在中國，北緯45°以北I代，45° -40° 2代，40° -30° 3代，30° -25° 4代，25° -20° 5-6代。海拔越高，發(fā)生代數(shù)越少；在四川省一年發(fā)生2-4代，溫度高、海拔低，發(fā)生代數(shù)較多，通常以老熟幼蟲在玉米莖桿、穗軸內(nèi)或高粱、向日葵的秸桿中越冬，次年4-5月化蛹，蛹經(jīng)過10天左右羽化。成蟲夜間活動，飛翔力強(qiáng)，有趨光性，壽命5 10天，喜歡在離地50厘米以上、生長較茂盛的玉米葉背面中脈兩側(cè)產(chǎn)卵，一個(gè)雌蛾可產(chǎn)卵350-700粒，卵期3-5天；玉米螟適合在高溫、高濕條件下發(fā)育，冬季氣溫較高，天敵寄生量少，有利于玉米螟的繁殖，危害較重；卵期干旱，玉米葉片卷曲，卵塊易從葉背面脫落而死亡，危害較輕。綜合上述，可確定桃蛀螟與玉米螟是兩種害蟲，且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，無法交配產(chǎn)生后代。本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補(bǔ)，反之亦然。由于DNA在植物中復(fù)制產(chǎn)生了 DNA的其它互補(bǔ)鏈。這樣，本發(fā)明包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補(bǔ)鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補(bǔ)鏈，它作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實(shí)際上是從DNA的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄的?！坝辛x”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個(gè)核苷酸，一次讀三個(gè)可以產(chǎn)生特定氨基酸)，其可作為開放閱
讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當(dāng)功能的RNA和PNA (肽核酸)。本發(fā)明中核酸分子或其片段在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明CrylA基因雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法都可以用于鑒定本發(fā)明CrylA基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進(jìn)行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個(gè)核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個(gè)核酸分子彼此間能夠進(jìn)行特異性雜交。如果兩個(gè)核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱其中一個(gè)核酸分子是另一個(gè)核酸分子的“互補(bǔ)物”。本發(fā)明中，當(dāng)一個(gè)核酸分子的每一個(gè)核苷酸都與另一個(gè)核酸分子的對應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則稱這兩個(gè)核酸分子顯示出“完全互補(bǔ)性”。如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個(gè)核酸分子為“最低程度互補(bǔ)”。類似地，如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個(gè)核酸分子具有“互補(bǔ)性”。從完全互補(bǔ)性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個(gè)分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個(gè)核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補(bǔ)性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴(yán)格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性雜交。促進(jìn)DNA雜交的適合的嚴(yán)格條件，例如，大約在45°C條件下用6. OX氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50°C條件下用2. OXSSC洗滌，這些條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴(yán)格條件的約2.0父55(、501到高度嚴(yán)格條件的約0.2\55(、501。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴(yán)格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴(yán)格條件的約65 °C。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個(gè)保持不變而另一個(gè)變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嚴(yán)格條件可為在6XSSC、0. 5%SDS溶液中，在65°C下與SEQ ID NO:4,SEQ IDNO: 5, SEQ ID N0:6 或 SEQ ID NO: 7 發(fā)生特異性雜交，然后用 2X SSC、0. 1%SDS 和 I X SSC、O. 1%SDS各洗膜I次。因此，具有抗蟲活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5, SEQID N0:6或SEQ ID NO:7雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40%-50% 同源，大約 60%、65% 或 70% 同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同源性。本發(fā)明中所述的基因和蛋白質(zhì)不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質(zhì)的殺蟲活性特征的部分和/片段(包括與全長蛋白質(zhì)相比在內(nèi)和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代氨基酸的蛋白質(zhì))、嵌合體和融合蛋白。所述“變體”或“變異”是指編碼同一蛋白或編碼有殺蟲活性的等價(jià)蛋白的核苷酸序列。所述“等價(jià)蛋白”是指與權(quán)利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗桃蛀螟害蟲的生物活性的蛋白。本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達(dá)的序列)，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質(zhì)為昆蟲毒素。 使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以修飾基因和容易的構(gòu)建基因變異體。例如，本領(lǐng)域熟知制造點(diǎn)突變的技術(shù)。又例如美國專利號5605793描述了在隨機(jī)斷裂后使用DNA重裝配產(chǎn)生其它分子多樣性的方法。可以使用商業(yè)化核酸內(nèi)切酶制造全長基因的片段，并且可以按照標(biāo)準(zhǔn)程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點(diǎn)誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切除核苷酸。還可以使用多種限制性內(nèi)切酶獲取編碼活性片段的基因?？梢允褂玫鞍酌钢苯荧@得這些毒素的活性片段。本發(fā)明可以從B. t.分離物和/或DNA文庫衍生出等價(jià)蛋白和/或編碼這些等價(jià)蛋白的基因。有多種方法獲取本發(fā)明的殺蟲蛋白。例如，可以使用本發(fā)明公開和要求保護(hù)的殺蟲蛋白的抗體從蛋白質(zhì)混合物鑒定和分離其它蛋白。特別地，抗體可能是由蛋白最恒定和與其它B. t.蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通過免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或western印跡方法使用這些抗體專一地鑒定有特征活性的等價(jià)蛋白?？墒褂帽绢I(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)程序容易的制備本發(fā)明中公開的蛋白或等價(jià)蛋白或這類蛋白的片段的抗體。然后可以從微生物中獲得編碼這些蛋白的基因。由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產(chǎn)生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平內(nèi)。這些不同的DNA序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但實(shí)質(zhì)上不影響殺蟲活性的序列，亦包括保留殺蟲活性的片段。本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選這種氨基酸變化為小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個(gè)氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個(gè)甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個(gè)殘基長。保守取代的實(shí)例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，并且已由，例如，N. Neurath和R. L. Hill在1979年紐約學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進(jìn)行了描述。最常見的互換有 Ala/Ser，Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe,Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它們相反的互換。
對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見地，這種取代可以在對分子功能起重要作用的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變進(jìn)行鑒定(如參見，Cunningham 和 Wells, 1989, Science 244 1081-1085)。后一技術(shù)是在分子中每一個(gè)帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的抗蟲活性，從而確定對該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點(diǎn)也可以通過其三維結(jié)構(gòu)的分析來測定，這種三維結(jié)構(gòu)可由核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記等技術(shù)測定(參見，如de Vos等，1992，Science 255 :306-312 ;Smith 等，1992，J. Mol. Biol 224:899-904 ;Wlodaver 等，1992，F(xiàn)EBS Letters 309 :59_64)。在本發(fā)明中，CrylA蛋白包括但不限于CrylAb、CryIAh> CrylA. 105或CrylAc蛋白，或者與上述蛋白的氨基酸序列具有至少70%同源性且對桃蛀螟具有殺蟲活性的殺蟲片段或功能區(qū)域。因此，與序列1、2和/或3所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列類似性/相同性典型的大于60%，優(yōu)選的大于75%，更優(yōu)選的大于80%，甚至更優(yōu)選的大于90%，并且可以大于95%。也可以根據(jù)更特定的相同性和/或類似性范圍定義本發(fā)明的優(yōu)選的多核苷酸和蛋白質(zhì)。例如與本發(fā)明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的相同性和 / 或類似性。本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽、終止子，增強(qiáng)子，前導(dǎo)序列，內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述CrylA蛋白的調(diào)節(jié)序列。所述啟動子為植物中可表達(dá)的啟動子，所述的“植物中可表達(dá)的啟動子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的啟動子。植物中可表達(dá)的啟動子可為組成型啟動子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達(dá)的啟動子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、Ubi啟動子、水稻G0S2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達(dá)的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)水平高于植物的其他組織(可通過常規(guī)RNA試驗(yàn)進(jìn)行測定)，如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達(dá)的啟動子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達(dá)模式的啟動子是指當(dāng)植物經(jīng)受機(jī)械或由昆蟲啃食引起的創(chuàng)傷時(shí)，啟動子調(diào)控下的編碼序列的表達(dá)較正常生長條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽(又稱分泌信號序列或?qū)蛐蛄?是指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)室，對受體蛋白質(zhì)來說，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。所述前導(dǎo)序列包含但不限于，小RNA病毒前導(dǎo)序列，如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)序列，如MDMV (玉米矮縮花葉病毒)前導(dǎo)序列；人類免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(BiP);苜蓿花葉病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列。
所述增強(qiáng)子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強(qiáng)子、玄參花葉病毒(FMV)增強(qiáng)子、康乃馨風(fēng)化環(huán)病毒(CERV)增強(qiáng)子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強(qiáng)子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強(qiáng)子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強(qiáng)子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強(qiáng)子。對于單子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子、Adh內(nèi)含子I、蔗糖合酶內(nèi)含子或水稻Actl內(nèi)含子。對于雙子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，CAT-I內(nèi)含子、pKANNIBAL內(nèi)含子、PIV2內(nèi)含子和“超級泛素”內(nèi)含子。所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號序列，包括但不限于，來源于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于蛋白酶抑制劑II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號序列和來源于α -微管蛋白(a -tubulin)基因的 多聚腺苷酸化信號序列。本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子控制和調(diào)控。當(dāng)感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達(dá)時(shí)“有效連接”表示啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于提供基因表達(dá)功能的序列(即基因表達(dá)元件，例如啟動子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)、整合酶識別位點(diǎn))、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標(biāo)記物、生物合成基因)、提供可計(jì)分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點(diǎn)特異性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。本發(fā)明中所述的“殺蟲”是指對農(nóng)作物害蟲是有毒的。更具體地，目標(biāo)昆蟲是桃蛀
螟害蟲。本發(fā)明中CrylA蛋白對桃蛀螟害蟲具有毒性。本發(fā)明中的植物，特別是高粱和玉米，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含編碼Cry IA蛋白的核苷酸序列，桃蛀螟害蟲通過攝食植物組織與該蛋白接觸，接觸后桃蛀螟害蟲生長受到抑制并最終導(dǎo)致死亡。抑制是指致死或亞致死。同時(shí)，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，該植物可基本消除對化學(xué)或生物殺蟲劑的需要(所述化學(xué)或生物殺蟲劑為針對CrylA蛋白所靶向的桃蛀螟害蟲的殺蟲劑)。植物材料中殺蟲晶體蛋白(ICP)的表達(dá)水平可通過本領(lǐng)域內(nèi)所描述的多種方法進(jìn)行檢測，例如通過應(yīng)用特異引物對組織內(nèi)產(chǎn)生的編碼殺蟲蛋白質(zhì)的mRNA進(jìn)行定量，或直接特異性檢測產(chǎn)生的殺蟲蛋白質(zhì)的量?？梢詰?yīng)用不同的試驗(yàn)測定植物中ICP的殺蟲效果。本發(fā)明中目標(biāo)昆蟲主要為桃蛀螟。本發(fā)明中，所述CrylA蛋白可以具有序列表中SEQ ID NO: I、SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。除了包含CrylA蛋白的編碼區(qū)外，也可包含其他元件，例如編碼選擇性標(biāo)記的蛋白質(zhì)。此外，包含編碼本發(fā)明CrylA蛋白的核苷酸序列的表達(dá)盒在植物中還可以與至少一種編碼除草劑抗性基因的蛋白質(zhì)一起表達(dá)，所述除草劑抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敵草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxyniI)抗性基因、磺酰脲抗性基因、對除草劑茅草枯的抗性基因、對氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制劑(如PPT)的抗性基因，從而獲得既具有高殺蟲活性、又具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物。 本發(fā)明中，將外源DNA導(dǎo)入植物，如將編碼所述CrylA蛋白的基因或表達(dá)盒或重組載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。本發(fā)明提供了一種控制害蟲的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)I、內(nèi)因防治。現(xiàn)有技術(shù)主要是通過外部作用即外因來控制桃蛀螟害蟲的危害，如農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治；而本發(fā)明是通過植物體內(nèi)產(chǎn)生能夠殺死桃蛀螟的CrylA蛋白來控制桃蛀螟害蟲的，即通過內(nèi)因來防治。2、無污染、無殘留。現(xiàn)有技術(shù)使用的化學(xué)防治方法雖然對控制桃蛀螟害蟲的危害起到了一定作用，但同時(shí)也對人、畜和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)帶來了污染、破壞和殘留；使用本發(fā)明控制桃蛀螟害蟲的方法，可以消除上述不良后果。3、全生育期防治?，F(xiàn)有技術(shù)使用的控制桃蛀螟害蟲的方法都是階段性的，而本發(fā)明是對植物進(jìn)行全生育期的保護(hù)，轉(zhuǎn)基因植物(CrylA蛋白)從發(fā)芽、生長，一直到開花、結(jié)果，都可以避免遭受桃蛀螟的侵害。4、全植株防治?，F(xiàn)有技術(shù)使用的控制桃蛀螟害蟲的方法大多是局部性的，如葉面噴施；而本發(fā)明是對整個(gè)植株進(jìn)行保護(hù)，如轉(zhuǎn)基因植物(CrylA蛋白)的葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥、花絲等都是可以抵抗桃蛀螟侵害的。5、效果穩(wěn)定?，F(xiàn)有技術(shù)使用的生物殺蟲劑需要直接噴施到作物表面，因此造成有活性的結(jié)晶蛋白(包括CrylA蛋白)在環(huán)境中被降解；本發(fā)明是使所述CrylA蛋白在植物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，有效地避免了生物殺蟲劑在自然界不穩(wěn)定的缺陷，且本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物(CrylA蛋白)的防治效果在不同地點(diǎn)、不同時(shí)間、不同遺傳背景也都是穩(wěn)定一致的。6、簡單、方便、經(jīng)濟(jì)。現(xiàn)有技術(shù)使用的生物殺蟲劑在環(huán)境中易被降解，因此需要重復(fù)生產(chǎn)和重復(fù)應(yīng)用，并為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的實(shí)際應(yīng)用帶來困難，大大地增加了成本；本發(fā)明只需種植能夠表達(dá)CrylA蛋白的轉(zhuǎn)基因植物即可，而不需要采用其它措施，從而節(jié)省了大量人力、物力和財(cái)力。7、效果徹底。現(xiàn)有技術(shù)使用的控制桃蛀螟害蟲的方法，其效果是不徹底的，只起到減輕作用；而本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物(CrylA蛋白)可以造成初孵桃蛀螟幼蟲的大量死亡，且對小部分存活幼蟲發(fā)育進(jìn)度造成極大的抑制，3天后幼蟲基本仍處于初孵狀態(tài)，都是明顯的發(fā)育不良，且已停止發(fā)育，轉(zhuǎn)基因植物大體上只受到輕微損傷。下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。


圖I為本發(fā)明控制害蟲的方法的含有CrylAb-Ol核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T構(gòu)建流程圖；圖2為本發(fā)明控制害蟲的方法的含有CrylAb-Ol核苷酸序列的重組表達(dá)載體DBN100124構(gòu)建流程圖；圖3為本發(fā)明控制害蟲的方法的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種桃蛀螟的葉片損傷圖；圖4為本發(fā)明控制害蟲的方法的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種桃蛀螟的蟲體發(fā)育圖。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明控制害蟲的方法的技術(shù)方案。第一實(shí)施例、CrylA基因的獲得和合成I、獲得CrylA核苷酸序列CrylAb-Ol殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(818個(gè)氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO: I所示；編碼相應(yīng)于所述CrylAb-Ol殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(818個(gè)氨基酸)的CrylAb-Ol核苷酸序列(2457個(gè)核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:4所示。CrylAb_02殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(615個(gè)氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO: 2所示；編碼相應(yīng)于所述CrylAb-02殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(615個(gè)氨基酸)的CrylAb-02核苷酸序列(1848個(gè)核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:5 所示。
CrylAh殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(699個(gè)氨基酸)，如序列表中SEQ ID N0:3所示；編碼相應(yīng)于所述CrylAh殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(699個(gè)氨基酸)的CrylAh-Ol核苷酸序列(2100個(gè)核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:6所示；編碼相應(yīng)于所述CrylAh殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(699個(gè)氨基酸)的CrylAh-02核苷酸序列(2100個(gè)核苷酸)，如序列表中SEQ IDNO:7所示。2、獲得Cry類核苷酸序列編碼CrylFa殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(605個(gè)氨基酸)的CrylFa核苷酸序列(1818個(gè)核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:8所示；編碼CrylIe殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(648個(gè)氨基酸)的CrylIe核苷酸序列(1947個(gè)核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO: 9所示。3、合成上述核苷酸序列所述CrylAb-Ol核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:4所示)、所述CrylAb-02核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 5所示)、所述CrylAh-Ol核苷酸序列(如序列表中SEQ IDN0:6所示)、所述CrylAh-02核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 7所示)、所述CrylFa核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:8所示)和所述CrylIe核苷酸序列(如序列表中SEQ IDN0:9所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成的所述CrylAb-Ol核苷酸序列(SEQID N0:4)的5’端還連接有NcoI酶切位點(diǎn)，所述CrylAb-Ol核苷酸序列(SEQ ID N0:4)的3’端還連接有SpeI酶切位點(diǎn)；合成的所述CrylAb-02核苷酸序列(SEQ ID N0:5)的5’端還連接有NcoI酶切位點(diǎn)，所述CrylAb-02核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)的3’端還連接有SwaI酶切位點(diǎn)；合成的所述CrylAh-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO:6)的5’端還連接有AscI酶切位點(diǎn)，所述CrylAh-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO:6)的3’端還連接有SpeI酶切位點(diǎn)；合成的所述CrylAh-02核苷酸序列(SEQ ID NO: 7)的5’端還連接有AscI酶切位點(diǎn)，所述CrylAh-02核苷酸序列(SEQ ID NO: 7)的3’端還連接有SpeI酶切位點(diǎn)；合成的所述CrylFa核苷酸序列(SEQ ID NO:8)的5’端還連接有AscI酶切位點(diǎn)，所述CryIFa核苷酸序列(SEQ ID NO:8)的3’端還連接有BamHI酶切位點(diǎn)；合成的所述CrylIe核苷酸序列(SEQ ID NO:9)的5’端還連接有NcoI酶切位點(diǎn)，所述CrylIe核苷酸序列(SEQ ID NO:9)的3’端還連接有SwaI酶切位點(diǎn)。第二實(shí)施例、重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
I、構(gòu)建含有CrylA基因的重組克隆載體將合成的CrylAb-Ol核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT :A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說明書進(jìn)行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖I所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復(fù)制起點(diǎn)；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6 RNA聚合酶啟動子；T7為Τ7 RNA聚合酶啟動子；CryIAb-OI為CrylAb-Ol核苷酸序列(SEQ ID N0:4) ；MCS為多克隆位點(diǎn))。然后將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞(Transgen, Beijing, China, CAT :CD501 )，其熱激條件為:50 μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10μ I質(zhì)粒DNA(重組克隆載體DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C水浴I小時(shí)(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有IPTG (異丙基硫代-D-半乳糖苷)和X-gal (5-溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心Imin,去上清液,沉淀菌體用100 μ I冰預(yù)冷的溶液I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8. 0)懸??；加入150μ I新配制的溶液II (0. 2Μ NaOH, 1%SDS (十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液III (4Μ醋酸鉀，2Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌后晾干；力口入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8. O)溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存?zhèn)溆?。提取的質(zhì)粒經(jīng)KpnI和BglI酶切鑒定后，對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的所述CrylAb-Ol核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，即CrylAb-Ol核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述CrylAb-02核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN02-T，其中，CrylAb-02為CrylAb-02核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)。酶切和測序驗(yàn)證重組克隆載體DBN02-T中所述CrylAb-02核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述CrylAh-Ol核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN03-T，其中，CrylAh-Ol為CrylAh-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。酶切和測序驗(yàn)證重組克隆載體DBN03-T中所述CrylAh-Ol核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBNOl-T的方法，將合成的所述CrylAh-02核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN04-T，其中，CrylAh-02為CrylAh-02核苷酸序列(SEQ ID NO: 7)。酶切和測序驗(yàn)證重組克隆載體DBN04-T中所述CrylAh-02核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBNOl-T的方法，將合成的所述CrylFa核苷酸序列連入克隆載體PGEM-T上，得到重組克隆載體DBN05-T，其中，CrylFa為CrylFa核苷酸序列(SEQ ID N0:8)。酶切和測序驗(yàn)證重組克隆載體DBN05-T中所述CrylFa核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBNOl-T的方法，將合成的所述CrylIe核苷酸序列 連入克隆載體PGEM-T上，得到重組克隆載體DBN06-T，其中，CrylIe為CrylIe核苷酸序列(SEQ ID N0:9)。酶切和測序驗(yàn)證重組克隆載體DBN06-T中所述CrylIe核苷酸序列正確插入。2、構(gòu)建含有CrylA基因的重組表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶NcoI和SpeI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和表達(dá)載體DBNBC-Ol (載體骨架pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供))，將切下的CrylAb-Ol核苷酸序列片段插到表達(dá)載體DBNBC-Ol的NcoI和SpeI位點(diǎn)之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN100124，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan:卡那霉素基因;RB:右邊界；Ubi :玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動子(SEQ ID NO: 10)；CrylAb-Ol =CrylAb-Ol核苷酸序列(SEQ ID N0:4) ；Nos :胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQID NO: 11) ；PMI :磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID NO: 12) ;LB :左邊界)。將重組表達(dá)載體DBN100124用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為50μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體DBN100124)，42°C水浴30秒；37°C水浴I小時(shí)(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動);然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5 )上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨IOg/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NcoI和SpeI酶切后鑒定，并將陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100124在NcoI和SpeI位點(diǎn)間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:4所示核苷酸序列，即CrylAb-Ol核苷酸序列。按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100124的方法，將NcoI和SwaI、AscI和BamHI分別酶切重組克隆載體DBN02-T和DBN05-T切下的所述CrylAb-02核苷酸序列和CrylFa核苷酸序列插入表達(dá)載體DBNBC-Ol，得到重組表達(dá)載體DBN100075。酶切和測序驗(yàn)證重組表達(dá)載體DBN100075中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:8所示核苷酸序列，即CrylAb-02核苷酸序列和CrylFa核苷酸序列。按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100124的方法，將AscI和SpeI酶切重組克隆載體DBN03-T切下的所述CrylAh-Ol核苷酸序列插入表達(dá)載體DBNBC-01，得到重組表達(dá)載體DBN100071。酶切和測序驗(yàn)證重組表達(dá)載體DBN100071在AscI和SpeI位點(diǎn)間即為所述CrylAh-Ol核苷酸序列。按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100124的方法，將AscI和Spel、NcoI和SwaI分別酶切重組克隆載體DBN04-T和DBN06-T切下的所述CrylAh-02核苷酸序列和CrylIe核苷酸序列插入表達(dá)載體DBNBC-OI，得到重組表達(dá)載體DBN100147。酶切和測序驗(yàn)證重組表達(dá)載體DBN100147中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:9所示核苷酸序列，即CrylAh-02核苷 酸序列和CrylIe核苷酸序列。3、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN100124、DBN100075、DBN100071和DBN100147用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 LBA4404 (Invitrgen, Chicago, USA ;Cat. No :18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為100μL農(nóng)桿菌LBA4404、3μL質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體)；置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時(shí)，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶AhdI和XbaI對重組表達(dá)載體DBN100124和DBN100075，用限制性內(nèi)切酶StyI和BglII對重組表達(dá)載體DBN100071和DBN100147酶切后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體 DBN100124、DBN100075、DBN100071 和 DBN100147 結(jié)構(gòu)完全正確。第三實(shí)施例、轉(zhuǎn)入CrylA基因的玉米植株的獲得及驗(yàn)證I、獲得轉(zhuǎn)入CrylA基因的玉米植株按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無菌培養(yǎng)的玉米品種綜31 (Z31)的幼胚與第二實(shí)施例中3所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第二實(shí)施例中2構(gòu)建的重組表達(dá)載體DBN100124、DBN100075.DBN100071和DBN100147中的T-DNA (包括玉米Ubiquitin基因的啟動子序列、CrylAb-Ol核苷酸序列、CrylAb-02核苷酸序列、CrylAh-Ol核苷酸序列、CrylAh-02核苷酸序列、CrylFa核苷酸序列、CrylIe核苷酸序列、PMI基因和Nos終止子序列)轉(zhuǎn)入到玉米染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入CrylAb-Ol核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylAb_02_CrylFa核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylAh-Ol核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入CrylAh-02-CrylIe核苷酸序列的玉米植株；同時(shí)以野生型玉米植株作為對照。對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，簡要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸幼胚，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)rylAb-Ol核苷酸序列、CrylAh-02-CrylFa核苷酸序列、CrylAh-Ol核苷酸序列和/或CrylAh-02-CrylIe核苷酸序列傳遞至幼胚之一的至少一個(gè)細(xì)胞(步驟I :侵染步驟)，在此步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD66tl=O. 4-0. 6，侵染培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖68. 5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(八5)4011^/1、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0) lmg/L，ρΗ5· 3))中以啟動接種。幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)期(3天)(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS) IOOmg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有一個(gè)選擇性的“恢復(fù)”步驟。在“恢復(fù)”步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖30g/L、2, 4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)lmg/L、瓊脂8g/L,pH5. 8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟3 :恢復(fù)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4 :選擇步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12. 5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟5 :再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(MS分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述MS分化培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上，25°C下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2. 15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實(shí)。在溫室中，每天于28°C下培養(yǎng)16小時(shí)，再于20°C下培養(yǎng)8小時(shí)。2、用TaqMan驗(yàn)證轉(zhuǎn)入CrylA基因的玉米植株分別取轉(zhuǎn)入CrylAb-Ol核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylAb_02_CrylFa核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylAh-Ol核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入CrylAh-02-CrylIe核苷酸序列的玉米植株的葉片約IOOmg作為樣品,用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA，通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測CrylA基因、CryIF基因和CrylI基因的拷貝數(shù)。同時(shí)以野生型玉米植株作為對照，按照上述方法進(jìn)行檢測分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。檢測CrylA基因、CrylF基因和CrylI基因拷貝數(shù)的具體方法如下步驟11、分別取轉(zhuǎn)入CrylAb-Ol核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylAb_02_CrylFa核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylAh-Ol核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylAh_02_CrylIe核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個(gè)樣品取3個(gè)重復(fù)；步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產(chǎn)品說明書；步驟13、用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/μ I ；步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型玉米植株的樣品作為對照，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是以下引物和探針用來檢測CrylAb-Ol核苷酸序列引物I (CFl) :CGAACTACGACTCCCGCAC 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；引物2 (CRl) GTAGATTTCGCGGGTCAGTTG 如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示；探針I(yè) (CPl) :CTACCCGATCCGCACCGTGTCC 如序列表中 SEQ ID NO: 15 所示；以下引物和探針用來檢測CrylAb-02核苷酸序列引物3 (CF2) TGCGTATTCAATTCAACGACATG 如序列表中 SEQ ID NO: 16 所示；
引物4 (CR2) CTTGGTAGTTCTGGACTGCGAAC 如序列表中 SEQ ID NO: 17 所示；探針2 (CP2) CAGCGCCTTGACCACAGCTATCCC 如序列表中 SEQ ID NO: 18 所示；以下引物和探針用來檢測CrylFa核苷酸序列引物5 (CF3) CAGTCAGGAACTACAGTTGTAAGAGGG 如序列表中 SEQ ID NO: 19 所示；引物6 (CR3) :ACGCGAATGGTCCTCCACTAG 如序列表中 SEQ ID NO: 20 所示；探針3 (CP3) :CGTCGAAGAATGTCTCCTCCCGTGAAC 如序列表中 SEQ ID NO: 21 所示；以下引物和探針用來檢測CrylAh-Ol核苷酸序列引物7 (CF4) :ATCGTGAACAACCAGAACCAGTG 如序列表中 SEQ ID NO: 22 所示；引物8 (CR4) :CTCCAGGATCTCGATCTCCG 如序列表中 SEQ ID NO: 23 所示；探針4 (CP4) :CGTGCCGTACAACTGCCTGAACAACC 如序列表中 SEQ ID NO: 24 所示；以下引物和探針用來檢測CrylAh-02核苷酸序列引物9 (CF5) :TCATTTGGGGCTTCGTCG 如序列表中 SEQ ID NO: 25 所示；引物10 (CR5) TGATTGATCAGCTGCTCAACCT 如序列表中 SEQ ID NO:26 所示；探針5 (CP5) :CCAGTGGGATGCGTTCCTCGCTC 如序列表中 SEQ ID NO: 27 所示；以下引物和探針用來檢測CrylIe核苷酸序列引物11 (CF6) :GAGCATTGATCCTTTCGTCAGTG 如序列表中 SEQ ID NO: 28 所示；引物12 (CR6) :CAAAGTACCGAGGATCTTACCAGC 如序列表中 SEQ ID NO: 29 所示；探針6 (CP6) CCTCCACAATCCAAACGGGCATCG 如序列表中 SEQ ID NO: 30 所示；PCR反應(yīng)體系為
JumpStart Taq ReadyMix (Sigma)10μ1
50x引物/探針混合物Ιμ
基因組DNA3μ1
水(ddH20)6μ1所述50Χ引物/探針混合物包含ImM濃度的每種引物各45 μ 1，100 μ M濃度的探針50 μ I和860 μ I I X TE緩沖液，并且在4°C，貯藏在琥珀試管中。PCR反應(yīng)條件為
步驟溫度時(shí)間
21950C5 分鐘
2295 0C30 秒
23600CI 分鐘
24回到步驟22，重復(fù)40次利用SDS2. 3 軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CrylAb-Ol核苷酸序列、CrylAb-02-CrylFa核苷酸序列、CrylAh-Ol核苷酸序列和CrylAh_02_CrylIe核苷酸序列均己整合到所檢測的玉米植株的染色體組中，而且轉(zhuǎn)入CrylAb-Ol核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylAb-Ol-CrylFa核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylAh-Ol核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入CrylAh-02-CrylIe核苷酸序列的玉米植株均獲得了含有單拷貝CrylA基因、CrylF基因和/或CrylI基因的轉(zhuǎn)基因玉米植株。第四實(shí)施例、轉(zhuǎn)基因玉米植株的殺蟲蛋白質(zhì)檢測I、轉(zhuǎn)基因玉米植株的殺蟲蛋白質(zhì)的含量檢測本實(shí)驗(yàn)中涉及的溶液如下萃取緩沖液8g/LNaCl, O. 2g/L KH2PO4, 2. 9g/L Na2HPO4.12H20，O. 2g/L KCl,5. 5ml/L 吐溫 20 (Tween-20), pH 7. 4 ；洗滌緩沖液PBST 8g/L NaCl，0· 2g/L KH2PO4, 2. 9g/L Na2HPO4.12H20，0. 2g/L KCl，0. 5ml/L 吐溫 20 (Tween-20), pH 7. 4 ；終止液IMHCl。分別取3mg轉(zhuǎn)入CrylAb-Ol核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylAb_01_CrylFa核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylAh-Ol核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入CrylAh-02-CrylIe核苷酸序列的玉米植株的新鮮葉片作為樣品，液氮研磨后加入800 μ I所述萃取緩沖液，4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心IOmin,取上清液用所述萃取緩沖液稀釋40倍,取80 μ I稀釋后的上清液用于ELISA檢測。鑒于所述CrylAh的氨基酸序列與CrylAb具有較高一致性，使得CrylAb的抗體可用于檢測所述CrylAh殺蟲蛋白質(zhì)。用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定法)試劑盒(ENVIRL0GIX公司，CrylAb/CrylAc試劑盒)對樣品中殺蟲蛋白質(zhì)(CrylAb蛋白和CrylAh蛋白)量占葉片鮮重的比例進(jìn)行檢測分析，具體方法參考其產(chǎn)品說明書。同時(shí)以野生型玉米植株和經(jīng)Taqman鑒定為非轉(zhuǎn)基因的玉米植株作為對照，按照上述方法進(jìn)行檢測分析。轉(zhuǎn)入CrylAb-Ol核苷酸序列的共3個(gè)株系(SI、S2和S3)，轉(zhuǎn)入CrylAb-Ol-CrylFa核苷酸序列的共3個(gè)株系(S4、S5和S6)，轉(zhuǎn)入CrylAh-Ol核苷酸序列的共3個(gè)株系(S7、S8和S9)，轉(zhuǎn)入CrylAh-02-CrylIe核苷酸序列的共3個(gè)株系(S10、Sll和S12)，經(jīng)Taqman鑒定為非轉(zhuǎn)基因的(NGM)共I個(gè)株系，野生型的(CK)共I個(gè)株系；從每個(gè)株系選3株進(jìn)行測試，每株重復(fù)6次。轉(zhuǎn)基因玉米植株的殺蟲蛋白質(zhì)(CrylAb蛋白)含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表I所示。轉(zhuǎn)基因玉米植株的殺蟲蛋白質(zhì)(CrylAh蛋白)含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。分別測得轉(zhuǎn)入CrylAb-Ol核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入CrylAb-Ol-CrylFa核苷酸序列的玉米植株的新鮮葉片中殺蟲蛋白(CrylAb蛋白)平均表達(dá)量占葉片鮮重的比例(ng/g)分別為8536. 2和8234. 7 ;轉(zhuǎn)入CrylAh-Ol核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入CrylAh_02_CrylIe核苷酸序列的玉米植株的新鮮葉片中殺蟲蛋白(CrylAh蛋白)平均表達(dá)量占葉片鮮重的比例(ng/g)分別為5374. 3和5382. 2，這一結(jié)果表明CrylAb蛋白和CrylAh蛋白在玉米中均獲得了較高的表達(dá)量和穩(wěn)定性。
表I、轉(zhuǎn)基因玉米植株的CrylAb蛋白表達(dá)量測定平均結(jié)果單株的CrylAb蛋白表達(dá)量(ng/g)每種植株的CrylAb蛋白
(每株重復(fù)6次)表達(dá)量(ng/g)
植株 I 23 平均表達(dá)量(ng/g)
517160.2 10444.49080.8
528534.4 8581.27330.2 8536.2
538817.4 9185.77691.2
547U88 4 9837.510626.4
559866.7 6863.34222.4 8234 7
569912.1 7724.17970.9
NGM -1.7 O-1.0 O
CK O -4.22.3 O 表2、轉(zhuǎn)基因玉米植株的CrylAh蛋白表達(dá)量測定平均結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，包括將桃蛀螟害蟲與CrylA蛋白接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述CrylA蛋白為CrylAb蛋白或CrylAh蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述CrylAb蛋白存在于產(chǎn)生所述CrylAb蛋白的植物細(xì)胞中，所述桃蛀螟害蟲通過攝食所述植物細(xì)胞與所述CrylAb蛋白接觸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述CrylAb蛋白存在于產(chǎn)生所述CrylAb蛋白的轉(zhuǎn)基因植物中，所述桃蛀螟害蟲通過攝食所述轉(zhuǎn)基因植物的組織與所述CrylAb蛋白接觸，接觸后所述桃蛀螟害蟲生長受到抑制并最終導(dǎo)致死亡，以實(shí)現(xiàn)對桃蛀螟危害植物的控制。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述CrylAh蛋白存在于產(chǎn)生所述CrylAh蛋白的植物細(xì)胞中，所述桃蛀螟害蟲通過攝食所述植物細(xì)胞與所述CrylAh蛋白接觸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述CrylAh蛋白存在于產(chǎn)生所述CrylAh蛋白的轉(zhuǎn)基因植物中，所述桃蛀螟害蟲通過攝食所述轉(zhuǎn)基因植物的組織與所述CrylAh蛋白接觸，接觸后所述桃蛀螟害蟲生長受到抑制并最終導(dǎo)致死亡，以實(shí)現(xiàn)對桃蛀螟危害植物的控制。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物可以處于任意生育期。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物的組織可以為葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述對桃蛀螟危害植物的控制不因種植地點(diǎn)的改變而改變。
10.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述對桃蛀螟危害植物的控制不因種植時(shí)間的改變而改變。
11.根據(jù)權(quán)利要求3至10任一項(xiàng)所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述植物可以來自玉米、高粱、粟、向日葵、蓖麻、姜、棉花、桃、柿、核桃、板栗、無花果或松樹。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至11任一項(xiàng)所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述CrylA蛋白的多核苷酸的植物。
13.根據(jù)權(quán)利要求I至12任一項(xiàng)所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述CrylA蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述CrylA蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求3至14任一項(xiàng)所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述植物還可以產(chǎn)生至少一種不同于所述CrylA蛋白的第二種核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α _淀粉酶或過氧化物酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸可以編碼CrylIe蛋白、CrylFa蛋白、Vip3A蛋白或CrylBa蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸包括SEQ ID N0:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種控制桃蛀螟害蟲的方法，包括將桃蛀螟害蟲與Cry1A蛋白接觸。本發(fā)明通過植物體內(nèi)產(chǎn)生能夠殺死桃蛀螟的Cry1A蛋白來控制桃蛀螟害蟲；與現(xiàn)有技術(shù)使用的農(nóng)業(yè)防治方法、化學(xué)防治方法和生物防治方法相比，本發(fā)明對植物進(jìn)行全生育期、全植株的保護(hù)以防治桃蛀螟害蟲的侵害，且無污染、無殘留，效果穩(wěn)定、徹底，簡單、方便、經(jīng)濟(jì)。
文檔編號A01P7/04GK102972426SQ20121051121
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者李勝兵, 康越景, 程鵬, 牛瑞琪, 劉敬, 宋肖倩, 劉麗, 張進(jìn)峰, 田康樂, 劉彥曉 申請人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心