專利名稱：一種重組雞γ干擾素重組載體構(gòu)建及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域中的基因克隆、重組載體構(gòu)建、重組質(zhì)粒表達(dá)及純化等技術(shù)，特別是重組雞Y干擾素的重組載體構(gòu)建及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
近年來，人們對動物的病毒性疫病主要采用針對性的疫苗接種的方法進(jìn)行預(yù)防，但隨著病毒的變異和傳統(tǒng)劑量疫苗的接種，造成動物溫和型病毒性 疫病的發(fā)生率愈來愈高。近來爆發(fā)的禽流感、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊炎、非典型性新城疫等病毒病給禽類養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為危害禽類養(yǎng)殖業(yè)最為嚴(yán)重的一類疾病，這也給防治病毒性動物疫病也帶來了新的挑戰(zhàn)。干擾素(Interfeixm)是一類由病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的具有干擾病毒在感染和非感染組織中復(fù)制的一類小分子蛋白。干擾素分為I型和II型兩大類，其中I型干擾素(IFNci和IFN0 )的主要作用為干擾病毒在體內(nèi)復(fù)制，保護(hù)非感染組織免受病毒侵?jǐn)_能力。II型干擾素(IFNy)不僅能夠抑制病毒的復(fù)制，而且具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力，能夠活化B細(xì)胞，增強(qiáng)抗體的免疫保護(hù)力；刺激T細(xì)胞生產(chǎn)相關(guān)的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫進(jìn)程；誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和趨化能力。其對機(jī)體的保護(hù)和對病毒的防治效果均優(yōu)于I型干擾素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用基因重組技術(shù)實現(xiàn)雞Y干擾素的體外表達(dá)，并通過改良目的基因片段，生產(chǎn)工藝等，以適應(yīng)雞Y干擾素的大規(guī)模生產(chǎn)，并顯著提高產(chǎn)品性能。本發(fā)明所提供的重組雞Y干擾素目的基因是通過以下步驟獲得的收集經(jīng)ConA誘導(dǎo)培養(yǎng)的雞全血淋巴細(xì)胞,按Trizol Reagent說明書的操作方法進(jìn)行總 RNA 的提取。利用 Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen)試劑盒對提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。雞Y干擾素，cDNA序列為I CTAAATCTTGTTCAACTTCAAGATGATATAGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACTCAAGTI LNLVQLQDDIDKLKADFNSS61 CATTCAGATGTAGCTGACGGTGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAG21HSDVADGGPI IVEKLKNffTE121 AGAAATGAGAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACTTGGAAATGCTTGAA41RNEKRIILSQIVSMYLEMLE181 AACACTGACAAGTCAAAGCCGCACATCAAACACATATCTGAGGAGCTCTATACTCTGAAA61NTDKSKPHIKHISEELYTLK241 AACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCCCCCG81NNLPDGVKKVKDIMDLAKPP301 ATGAACGACTTGAGAATCCAGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTACAGAAG
101MNDLRIQRKAANELFSILQK36I CTGGTGGATCCTCCGAGTTTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCAGAGGAGATGCAATTGC121LVDPPSFKRKRSQSQRRCNC以上序列為雞Y干擾素的核苷酸序列和氨基酸序列，其中第1、3、5、7、9、11、13行為核苷酸序列，第2、4、6、8、10、12、14行為氨基酸序列。根據(jù)雞IFN-Y基因序列,應(yīng)用Primer Premier5. O軟件設(shè)計引物,使目的片段起始于雞IFN- Y cDNA基因的起始密碼子ATG前6個堿基，終止于雞IFN- Y基因的終止密碼子TAA，包含雞IFN-Y基因的一個完整開放閱讀框。本發(fā)明所提供的重組雞Y干擾素的生產(chǎn)方法是將純化后的目的片段與PMD18-T載體16°C連接30min，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，以獲得克隆載體。 本發(fā)明對陽性克隆載體的篩選是通過PCR及EcoR I和Sal I酶切鑒定實現(xiàn)的。具體操作為取少量重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定，并用EcoR I和Sal I進(jìn)行酶切鑒定(單酶切條帶3193bp,雙酶切條帶541bp, 2652bp)。陽性的重組質(zhì)粒送由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。用分析軟件DNAStar將測定結(jié)果與已知序列進(jìn)行比對分析，并將陽性質(zhì)粒命名為pMD18_IFN_ Y。本發(fā)明陽性表達(dá)載體的構(gòu)建是通過以下步驟實現(xiàn)的用EcoR I和Sal I雙酶切陽性重組質(zhì)粒pMD18_IFN_ Y，將目的基因切下，凝膠回收備用。同樣將原核表達(dá)載體pET-32a(+)用EcoR I和Sal I雙酶切，將酶切后的pET-32a(+)凝膠回收備用。將回收的IFN-Y片段與酶切后回收的pET_32a(+)質(zhì)粒使用T4連接酶進(jìn)行連接，16°C連接過夜。并將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化至E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含30 μ g/mL卡那霉素)，37°C培養(yǎng)過夜。常規(guī)方法提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定(單酶切條帶6428bp，雙酶切條帶541bp，5887bp)，陽性重組質(zhì)粒命名為pET32a-IFN- Y，即工程菌株。本發(fā)明所述表達(dá)為誘導(dǎo)表達(dá)，即使用IPTG，42°C誘導(dǎo)6h。本申請同時對上述雞Y干擾素進(jìn)行部分序列突變以得到改良的雞Y干擾素片段，具體的將原氨基酸序列的第105-107位氨基酸由RIQ突變?yōu)镈NL，經(jīng)過改良的雞、干擾素序列如下所示 I CTAAATCTTGTTCAACTTCAAGATGATATAGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACTCAAGTI LNLVQLQDDIDKLKADFNSS6I CATTCAGATGTAGCTGACGGTGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAG21HSDVADGGPI IVEKLKNffTEI2I AGAAATGAGAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACTTGGAAATGCTTGAA41RNEKRIILSQIVSMYLEMLE181 AACACTGACAAGTCAAAGCCGCACATCAAACACATATCTGAGGAGCTCTATACTCTGAAA61NTDKSKPHIKHISEELYTLK24I AACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCCCCCG81NNLPDGVKKVKDIMDLAKPP
301 ATGAACGACTTGGACAACCTGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTACAGAAG
101MNDLDNLRKAANELFSILQK
36I CTGGTGGATCCTCCGAGTTTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCAGAGGAGATGCAATTGC121LVDPPSFKRKRSQSQRRCNC以上序列為雞Y干擾素的核苷酸序列和氨基酸序列，其中第1、3、5、7、9、11、13行為核苷酸序列，第2、4、6、8、10、12、14行為氨基酸序列。并通過合成上述序列按照上述類似方法構(gòu)建表達(dá)所述改良的雞Y干擾素的工程菌。
具體實施例方式實施例I 一種重組雞Y干擾素的重組載體構(gòu)建及其生產(chǎn)方法I收集經(jīng)ConA誘導(dǎo)培養(yǎng)的雞全血淋巴細(xì)胞,按Trizol Reagent說明書的操作方法進(jìn)行總RNA的提取。2利用 Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen)試劑盒對提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,具體操作如下。RT 反應(yīng)體系5XRT buffer,4 μ I ；dNTPs,2u I ；RNase Inhibitor, I μ I ；Oligo (dT) 20，I μ I 鋒液，11“ I ；Rever TraAce, I μ I ;總計:20 μ I。RT 反應(yīng)條件30°C, IOmin ；42°C,20min ；99°C,5min ；4°C,5min03根據(jù)雞IFN-γ基因序列，應(yīng)用Primer Premier5. O軟件設(shè)計引物F:5，一AAGAAGATGACT TGG CAGAC—3，R:5’ 一TTAGCAATT GCATCT CCT TTGA—3’目的片段共501bp，起始于雞IFN- y cDNA基因的起始密碼子ATG前6個堿基，終止于雞IFN-Y基因的終止密碼子TAA，包含了雞IFN-Y基因的一個完整開放閱讀框。引物由上海生工生物工程公司合成。4以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系TaKaRaTaq HS (5U/μ I)，O. 125 μ I ; 10 XPCR Buffer (Mg2+Plus),2. 5 μ I ； dNTP Mixture (各 2. 5mM) , 2 μ I ；Forward Primer(20 μ Μ) , I. 25 μ I ；ReversePrimer (20 μ Μ)，I. 25 μ I ；ddH20,16 μ I ；cDNA 模板，2 μ I ;共計 25 μ I。反應(yīng)條件95°C，2min；95°C, 30sec,61°C, 30sec, 72°C, 30sec, 30cyc ；72°C, IOmin用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。根據(jù)DNA回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。回收后所得DNA置-20 V保存?zhèn)溆谩?將純化后的目的片段與PMD18-T載體16°C連接30min，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。取少量重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定，并用EcoR I和Sal I進(jìn)行酶切鑒定(單酶切條帶3193bp，雙酶切條帶541bp，2652bp)。酶切條件及體系:質(zhì)粒DNA，0. 15 μ g ； 10XBuffer, 2 μ I ;限制性內(nèi)切酶EcoR I，1μ I ;限制性內(nèi)切酶Sal Ι，1μ I ;加水至20 μ I，37°C孵育3h。6將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。用分析軟件DNAStar將測定結(jié)果與已知序列進(jìn)行比對分析，陽性質(zhì)粒命名為pMD18-IFN-y。7用EcoR I和SalI雙酶切陽性重組質(zhì)粒pMD18_IFN_ Y，將目的基因切下，凝膠回收備用。同樣將原核表達(dá)載體pET-32a(+)用EcoR I和Sal I雙酶切，將酶切后的pET-32a(+)凝膠回收備用。將回收的IFN-Y片段與酶切后回收的pET_32a(+)質(zhì)粒使用T4連接酶進(jìn)行連接，16°C連接過夜。并將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化至E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含30 μ g/mL卡那霉素)，37°C培養(yǎng)過夜。常規(guī)方法提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定(單酶切條帶6428bp，雙酶切條帶541bp，5887bp)，陽性重組質(zhì)粒命名為pET32a-IFN- Y，即工程菌株。8重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)取陽性菌株接種于含氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C振動培養(yǎng)，當(dāng)OD6tltl值達(dá)到I左右時，收集部分菌體，另一部分加IPTG使其終濃度為O. 6mmol/L, 42 °C誘導(dǎo)6h后離心，收集菌體。取未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體和誘導(dǎo)后菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。9表達(dá)產(chǎn)物的純化9. I細(xì)胞包涵體的提取將收獲的菌體沉淀溶于250mL濃度為50mmol/L TrisCl緩沖液，加入O. 025g溶菌酶和25mL I % Triton-X-100, 30°C溫浴15min ;然后 冰浴超聲破碎處理,4°C、12000r/min離心IOmin ;收集沉淀,用2mol/L尿素洗漆I次,在4°C、12000 r/min離心IOmin ;收集沉淀，再用lmol/LNaCl、0· 5% Triton-X-100各洗滌I次，使包涵體初步純
化，收集沉淀。9. 2包涵體的純化在沉淀物中加入30mL TNMFX緩沖液(pH值為8. O的20mmol/L TrisClU50mmol/LNaClUmmol/L EDTA 和 O. 1% Triton-100)，超聲處理 30s (5 次，間隔Imin);加入30mL TNMFX緩沖液至250mL，4°C、12000r/min離心IOmin ;收集沉淀，進(jìn)行2 3次以重蒸水洗漆沉淀；4°C、15000r/min離心15min,收集沉淀。9. 3 包涵體的變性用變性液[8mol/L尿素、20mmol/L TrisCl (pH值為 8. O)、2mmol/L β -巰基乙醇]溶解沉淀，直至溶液變得清亮透明為止，表明包涵體已被完全溶解。9. 4變性蛋白的純化利用親和層析法將和Ni柱充分結(jié)合的變性蛋白與柱材料的混合物裝到柱子上，用 IOmL 緩沖液 A[20mmol/L TrisCl (pH 值為 8. 5，4°C )、10mmol/LKCl、5mmol/L β -巰基乙醇、10%甘油、lOmmol/L咪唑]平衡柱子，保持流速為0. 5mL/min。分別用 2mL 緩沖液 B[20mmol/L TrisCl (pH 值為 8. 5，4°C )、lmol/LKCl、5mmol/L β -巰基乙醇、10%甘油]和2mL緩沖液A洗脫柱子，然后用0.5mL緩沖液C[20mmol/L TrisCl (pH值為8. 5，4°C )、100mmol/L KCl、5mmol/L β -巰基乙醇、10%甘油、lOmmol/L 咪唑)連續(xù)洗脫 4次，收集合并此洗滌液體即為純化的目的蛋白。9. 5 蛋白的透析復(fù)性將復(fù)性液[20mmol/L TrisCl (pH 值為 8. 0)、2mmol/L EDTA,50ymol/L CuCl2、lmmol/L GSH、0. lmmol/L GSSG，lmol/L 尿素]加入純化的變性蛋白中，使變性蛋白終濃度為100 μ g/mL，并使復(fù)性液中尿素濃度保持在lmol/L，抽氣后在4°C條件下連續(xù)攪拌20h ;在冰浴條件下不斷攪拌20min,在此期間，不斷加(NH4)2S04沉淀蛋白，使(NH4)2SO4終濃度為55%，再繼續(xù)攪拌40min，充分沉淀蛋白；于4°C、12000r/min離心Ih ;收集沉淀，再用 50mmol/L TrisCl (pH 值為 8. 0)、0· 5mmol/L EDTA 重溶沉淀，于 4°C、13000r/min離心15min ;收集上清液,用50mmol/L TrisCl (pH值為8. 0)透析48h,每6h換液I次，得到復(fù)性蛋白。實施例2經(jīng)改良的雞Y干擾素的重組載體構(gòu)建及其生產(chǎn)方法合成改良后的雞Y干擾素序列，并使用實施例中相同的載體、酶切位點及宿主菌構(gòu)建表達(dá)改良的雞Y干擾素的工程菌，并使用實施例中相同的方法進(jìn)行表達(dá)純化。
實施例3改良前后的雞Y干擾素序列的比較實驗I通過對目的片段改良后，其在大腸桿菌的表達(dá)量明顯提高，對比試驗結(jié)果如下表I所示(均采用20L發(fā)酵體系，溫度、溶氧量等條件一致)
權(quán)利要求
1.重組雞Y干擾素，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO :3或5所示。
2.編碼權(quán)利要求I所述重組雞Y干擾素的核酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的核酸序列，其序列具有SEQID NO :4或6所示的序列。
4.包含權(quán)利要求2或3的核酸序列的重組載體。
5.包含權(quán)利要求4所述重組載體的宿主菌。
6.表達(dá)權(quán)力要求I所述雞Y干擾素的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于收集經(jīng)ConA誘導(dǎo)培養(yǎng)的雞全血淋巴細(xì)胞，提取總RNA，并從中擴(kuò)增的目的片段，將擴(kuò)增得到的目的片段純化后與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，進(jìn)行PCR及EcoR I和Sal I酶切鑒定；單酶切條帶為3193bp，雙酶切條帶為541bp和2652bp，則鑒定為陽性質(zhì)粒，命名為PMD18-IFN- Y ;并將陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序;然后用EcoR I和Sal I雙酶切pMD18_IFN_ Y，回收目的片段，該片段為541bp，含酶切位點及pMD18-T載體的部分序列；并用EcoR I和SalI雙酶切原核表達(dá)載體pET-32a(+)，回收酶切后的pET-32a(+);用T4連接酶連接酶切后回收的目的片段及酶切后的pET-32a(+)，得到重組載體；將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞；按常規(guī)方法提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切鑒定，如單酶切條帶為6428bp，雙酶切條帶為54Ibp和5887bp，則鑒定為陽性重組質(zhì)粒，命名為pET32a-IFN-Y，即構(gòu)建的工程菌。
7.權(quán)利要求6所述的表達(dá)方法，期特征在于擴(kuò)增目的片段使用的引物如下所示 F:5，AAGAAGATGACT TGG CAGAC3， R:5’ TTAGCAATT GCATCT CCT TTGA3’。
8.權(quán)利I所述的重組雞Y干擾素或權(quán)利要求2-3任一項所示的核酸序列在制備提高蛋雞免疫力的制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域中的基因克隆、重組載體構(gòu)建、重組質(zhì)粒表達(dá)及純化等技術(shù)，特別是重組雞γ干擾素及其改良片段的重組載體構(gòu)建及其生產(chǎn)方法。主要包括利用RT-PCR技術(shù)獲得包含雞γ干擾素或期改良片段的完整開放閱讀框的目的基因，并構(gòu)建了含有該目的基因的表達(dá)載體，同時建立了目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化的工藝。本發(fā)明使得雞γ干擾素在大腸桿菌中高效表達(dá)，為雞γ干擾素的生產(chǎn)提供快捷、高效、安全、低成本的生產(chǎn)方式，適用于大規(guī)模的生產(chǎn)。按本發(fā)明生產(chǎn)地重組雞γ干擾素可廣泛應(yīng)用于禽類的免疫增強(qiáng)及疫病的防治。
文檔編號A23K1/16GK102964443SQ20121053659
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者趙風(fēng)立, 尹建華, 呂振華, 侯娟娟 申請人:黑龍江省匯豐動物保健品有限公司, 青島科亞華動物藥業(yè)有限公司, 黑龍江省百洲生物工程有限公司