專利名稱：薄荷檸檬烯合酶基因MhLS的植物過量表達載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領域，涉及薄荷檸檬烯合酶基因MhLS及其植物過量表達載體的具體構建方法和應用。
背景技術：
薄荷屬植物不僅是全世界重要的藥用植物之一，也是僅次于橘類的第二大香料植物。薄荷油是薄荷的主要化學成分，在食品、制藥、香料、化妝品工業(yè)上具有大量用途。單萜是薄荷揮發(fā)油主要成分。單萜是由兩個異戊二烯結構單元組成的ClO類萜類化合物及其衍生物。單萜類化合物在抵抗微生物病原菌、防御昆蟲和植食性動物方面有著重要的作用，在吸引昆蟲傳粉和植物種群競爭中也很重要(Pichersky and Gershenzon,2002)。薄荷揮發(fā)油合成途徑被視為是植物單職合成途徑的典型模式(Jonathan et al.,2000)。揮發(fā)油最主要的成分薄荷腦的形成需要經(jīng)過很多步反應，包括一系列不同類型的生化反應(Kjonaas and Croteau, 1983 ；Kjonaas et al., 1985 ；Croteau andVenkatachalam,1986)。同時，催化每個反應的酶也都已經(jīng)被闡明(Kjonaas et al., 1982,1985 ；CroteauandVenkatachalam,1986 ；Karp et al.，1990 ；Croteau et al.，1991 ；Alonso et al.，1992 ；Rajaonarivony et al.，1992 ；Colby et al.，1993)。檸檬烯是最簡單的環(huán)形單萜，廣泛存在于植物揮發(fā)油中，如薄荷屬、柑橘屬、松科、傘形科植物等(Guenther, 1972)。
在薄荷中,朽1檬烯是薄荷揮發(fā)油合成前提，不論在是薄荷酮化學型薄荷或在香芹酮化學型薄荷。檸檬烯合酶催化GPP環(huán)化為檸檬烯(Kjonas andCroteau, 1983),該反應決定薄荷油合成途徑的整體反應速率(Gershenzon and Croteau,1991)。檸檬烯合酶是最典型的被子植物單萜環(huán)化酶。該酶大小為65 kDa，pI值大約為5.0，最佳反應pH為7.0左右。檸檬烯合酶需要與二價金屬離子(如Mg2+或Mn2+)才能與底物結合并催化反應。此酶可以識別香葉基作為它的底物，還對半胱氨酸殘基、甲硫氨酸殘基、組氨基酸殘基等較為敏感(David et al.，2007)。農(nóng)桿菌介導法是應用最廣泛的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法。將薄荷檸檬烯合酶基因構建植物表達載體，用于農(nóng)桿菌介導法進行植物遺傳轉(zhuǎn)化，可以獲得單萜含量提高的新種質(zhì)。對于薄荷新品種的培育及在生產(chǎn)中的廣泛應用，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供薄荷單萜合成途徑中的關鍵調(diào)控酶-檸檬烯合酶的基因序列，使得可以對薄荷單萜合成途徑進行調(diào)控和改造，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。本發(fā)明同時提供了該基因的植物過量表達載體及其構建方法。所構建的植物表達載體可以用于農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)造新的薄荷品質(zhì)資源，可用于薄荷品種改良。


圖1薄荷MhLS基因的PCR擴增結果
圖2薄荷MhLS基因植物表達載體構建雙酶切過程
圖3重組菌液PCR檢測結果
圖4重組質(zhì)粒酶切驗證具體實施方式
實施例1薄荷檸檬烯合酶基因的克隆
從GenBank中查找檸檬烯合酶基因的cDNA序列，并設計引物序列如下:
上游引物5 ’ -GAAAGAGAGCGGAAGGAAAGATT
下游引物5 ’ -AGAATTACGTACGAACTATGCCTT
以薄荷第一鏈cDNA為模版擴增，得到MhLS基因的全長cDNA序列。
取IOOmg植物組織于液氮中仔細研磨，直至呈粉末狀；快速轉(zhuǎn)移樣品至1.5mlRNase free離心管中，加入Iml的裂解液PL顛倒混勻，在65°C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解；4°C的條件下12，OOOrpm離心10分鐘,小心取上清轉(zhuǎn)入一個新的RNase free過濾柱中；收集下濾液(含有總RNA)于收集管中；在收集管中加入I倍體積70%乙醇，顛倒混勻(此時可能會出現(xiàn)沉淀)；得到的溶液和可能沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管內(nèi))；10，OOOrpm離心45秒，棄掉廢液，將吸附柱重新套回收集管；加入500μ I去蛋白液RE，12，OOOrpm離心45秒，棄掉廢液；加入700 μ I漂洗液Rff, 12，OOOrpm離心60秒，棄掉廢液；加入500 μ I漂洗液RW，12，OOOrpm離心60秒，棄掉廢液；將吸附柱RA放回空收集管中，12，OOOrpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應；取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，在吸附膜的中間部位加50 μ IRNase freewater,室溫放置2分鐘，12, OOOrpm離心I分鐘。在RNase-free的PCR管中加入以下試劑:RNA 2μ g ；01igo dT-Adaptor Primer (100 μ M/μ I) I μ I ;dNTP (IOmM) I μ I ;以 H20DEPC 補足至14 μ I。在PCR上進行:65°C，5min，后置于冰上急冷；在上述混合液中，加入以下反轉(zhuǎn)錄反應液:RNase Inhibitor (40U/ μ I) I μ I ；5 XFirst-Strand Buffer 5 μ I ；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200υ/μ 1)1μ I ； H2ODEPC 4μ I總共為25 μ I。在PCR儀上按以下條件進行cDNA第一條鏈的合成反應:30°C IOmin ；42°C 90min ；72°C 5min。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋用于PCR反應模板。
將cDNA100ng、10XBuffer2.5μ 1、dNTP (IOmM) 0.5 μ 1、MgC12(25mM) 1.5 μ 1、上游引物(10μΜ)1μ 1、下游引物(10μΜ)1μ 1、ExTaq (5U/μ I) 0.1μ I 及 ddWater 共 20 μ I 混合物在PCR儀上進行以下反應94°C 5min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 2min共35個循環(huán)；72°C IOmin ；4°C Imin終止反應。擴增產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠(含I % EB)，在I X TAE電泳緩沖液中，IlOV恒壓電泳30分鐘，檢測目的片段。將檢測到的目的條帶用手術刀片切割下來，并使用瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒進行回收。將回收產(chǎn)物進行PMD19-T Vector (TaKaRaBiotechnology (Dalian) C0.，Ltd.，China)連接，反應體系參照 pMD19_T Vector 說明書。16°C進行連接數(shù)個小時。將5 μ I連接產(chǎn)物加到裝有50 μ I感受態(tài)細胞(DH5 α )的1.5ml離心管中，輕輕敲打混勻，冰浴30min，42°C熱激90sec，迅速置于冰上并冰浴lOmin。加入950 μ I滅菌的液體LB培養(yǎng)基，37°C恒溫培養(yǎng)1.5h。吸取200 μ I菌液混合X_gal (20mg/ml)和IPTG(200mg/ml)涂布含100mg/ml氨芐的LB固體培養(yǎng)基，37°C恒溫倒置培養(yǎng)12_16h。每個平板挑取10個白色克隆，移入裝有Iml滅菌滅菌的液體LB培養(yǎng)基(含有100mg/ml氨芐)的1.5ml離心管中，37°C，240rpm培養(yǎng)6個小時。吸取2 μ I菌液作為PCR檢測模板。對菌液進行特異擴增引物和載體通用引物(Μ13)雙重PCR檢測，將兩次檢測結果均為陽性的菌液送測序，獲得MhLS基因cDNA序列。實施例2植物表達載體pCAMBIA2301-CaMV35S-MhLS的構建以帶有酶切位點的特異引物對，序列如下:上游引物 5 ’ -GCTCTAGAATGGCTCTCAAAGTGTTTAGTG下游引物5 ’ -CGCGGATCCTGCAAAGGGCTCGAATAAGGTTC以含有MhLS cDNA的重組質(zhì)粒PMD-MhLS作為模板進行PCR擴增(條件同實施例1)，分別獲得5’端帶有Xba I酶切位點、3’端帶有BamH I酶切位點的MhLS全長基因片段。將所獲得目的片段轉(zhuǎn)化DH5a，提取陽性克隆菌液的質(zhì)粒DNA。同時用Xba I和BamH I兩種限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒DNA和植物表達載體p2301進行雙酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物-帶有酶切位點的基因片段和線形P2301。利用T4連接酶對帶有酶切位點的基因片段和線形P2301進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，獲得已構建好的MhLS植物表達載體的 重組菌液。將已經(jīng)獲得的攜有表達載體的重組菌液在含有卡那霉素抗性的培養(yǎng)基平板上涂布篩選菌落。隨機挑取8個單克隆，然后用PCR擴增和限制性內(nèi)切酶BamH I和Xba I酶切質(zhì)粒DNA，來檢測是否已經(jīng)成功構建。PCR檢測結果和酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果一致表明已經(jīng)成功構建MhLS植物表達載體。實施例3MhLS植物表達載體的薄荷農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化1.無菌苗的制備采集田間生長中薄荷的頂芽，洗衣粉溶液浸泡15min后，流水沖洗30min。接種前用75% (V/V)酒精消毒30s，再用0.2% (m/V)HgC12溶液浸泡15min，無菌水沖洗3次。吸干表面水份后，剝?nèi)ネ鈱尤~片，切成0.5cm長的莖尖，接種在無菌苗培養(yǎng)培養(yǎng)基中。在室溫250C ±2°C，光照時間8 10h，光照強度1500 20001x條件下，進行培養(yǎng)。如果還需要繼續(xù)培養(yǎng)，可在培養(yǎng)3周后選健康無菌的植株接種于同樣培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)。2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)首先將_70°C凍存的農(nóng)桿菌進行活化:分別挑取攜帶目的基因片段的農(nóng)桿菌菌落接種于含抗生素(卡那霉素抗性)的LB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜，當0D600值在
0.3-0.7時備用。將過夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌在含抗生素(卡那霉素抗性)的LB固體培養(yǎng)基上劃單菌落，28°C培養(yǎng)靜置。挑取單菌落在同樣條件下的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，待菌液進入對數(shù)生長期時(0D600值在0.4左右為宜)用于浸染外植體。3.供體預培養(yǎng)將之前培養(yǎng)好的無菌苗，取2 4節(jié)莖段按莖節(jié)切段，將長度在0.5cm-l.0cm的節(jié)間莖段平鋪在供體預培養(yǎng)培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA)中暗培養(yǎng)3天，以備農(nóng)桿菌侵染實驗。4.農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)利用之前培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液侵染準備的植物供體，侵染時間一般為15min，侵染結束后用滅菌濾紙將多余的農(nóng)桿菌菌液吸干，莖段擺放在共培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基)上暗培養(yǎng)3天，使T-DNA區(qū)更有效地整合到薄荷基因組中。5.再生植株的獲得
共培養(yǎng)結束后，將莖段轉(zhuǎn)到誘導不定芽再生培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基+3.0mg/LTDZ+0.2mg/L IAA+25% 椰乳 + 卡那霉素 50mg/L+500mg/L 頭孢霉素)上，在室溫 25 °C ±2°C，暗培養(yǎng)40天左右至分化產(chǎn)生不定芽。由于載體中攜帶nPtll為選擇標記基因，所以誘導不定芽再生培養(yǎng)基中加入了預實驗篩選出的50mg/L卡那霉素，作為抗生素選擇壓，對再生芽進行抗性篩選。
6.不定芽篩選培養(yǎng)
將培養(yǎng)40天莖段上分化出的不定芽切下，繼續(xù)在不定芽篩選培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基+1.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+卡那霉素75mg/L+500mg/L頭孢霉素)上培養(yǎng)，再次篩選抗性植株。有一部分幼苗由于沒有卡那霉素抗性，會變黃，甚至會死亡。而陽性轉(zhuǎn)基因植物由于nPtll的表達,具備一 定得卡那霉素抗性。
權利要求
1.薄荷檸檬烯合酶基因MhLS的植物過量表達載體pCAMBIA2301-CaMV35S-MhLS，該載體包含薄荷檸檬烯合酶基因MhLS的完整編碼序列及卡那霉素篩選標記基因nPtll和植物組成型啟動子CaMV35S。
2.根據(jù)權利要求1所述的植物表達載體，其特征在于MhLS基因序列來源于薄荷(M.haplocalyx Briq.)，GenBank 登錄號為 JX555976。
3.薄荷檸檬烯合酶基因MhLS的遺傳轉(zhuǎn)化體系，其特征在于: 1)將之前培養(yǎng)好的無菌苗，取2 4節(jié)莖段按莖節(jié)切段，將長度在0.5cm-l.0cm的節(jié)間莖段平鋪在供體預培養(yǎng)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3天； 2)侵染時間為15min； 3)誘導不定芽再生的條件為基本培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)+3.0mg/LTDZ+0.2mg/LIAA+25%椰乳+卡那霉素50mg/L+500mg/L頭孢霉素，在室溫25 °C ±2°C，暗培養(yǎng)40天左右至分化產(chǎn)生不定芽； 4)不定芽篩選培養(yǎng)基組成為:基本培養(yǎng)基+1.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+卡那霉素75mg/L+500mg/L 頭孢霉素。
4.權利要求1所述，薄荷檸檬烯合酶基因MhLS的植物過量表達載體在提高植物單萜含量的轉(zhuǎn)基因植物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領域，公開了一種提高薄荷揮發(fā)油主要成分含量的載體pCAMBIA2301-CaMV35S-MhLS。該載體是含有薄荷檸檬烯合酶(limonene synthase)基因MhLS的植物過量表達載體。本發(fā)明首次從國產(chǎn)薄荷品種738中克隆得到MhLS基因全長編碼序列，利用農(nóng)桿菌介導法遺傳轉(zhuǎn)化薄荷，通過該基因在薄荷揮發(fā)油合成途徑中的過量表達，促進薄荷醇和薄荷酮的合成，提高薄荷揮發(fā)油中主要成分的含量。由本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)化獲得的薄荷新品質(zhì)，其后代薄荷油中單萜成分的含量提高，對薄荷品種的遺傳改良中具有很大的應用潛力。
文檔編號A01H4/00GK103173484SQ201210551280
公開日2013年6月26日 申請日期2012年12月19日 優(yōu)先權日2012年12月19日
發(fā)明者李維林, 王海棠, 梁呈元, 于盱 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所