專利名稱：以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法，屬于植物組織與細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
光葉薔薇(Rosawichuriana Crep.)屬于薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)攀援灌木，是現(xiàn)代月季原始親本之一。主要分布在我國的浙江、廣東、廣西、福建、臺灣等省及日本、朝鮮等國。現(xiàn)已培育出很多園藝品種，并廣泛栽培。目前，尚未見到光葉薔薇及其雜交種的體細胞再生途徑研究的系統(tǒng)報道，制約了研究者對月季優(yōu)良性狀的深入研究和應(yīng)用。Lloyd等(1988)在僅含有BA和NAA的培養(yǎng)基 上直接從光葉薔薇的葉上誘導(dǎo)出不定芽，但未報道誘導(dǎo)率。郭艷超等(2008)通過類原球莖途徑以光葉薔薇的葉片為外植體得到了類原球莖，但未報道得到再生植株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法，以光葉薔薇頂生幼嫩小葉為材料，通過體器官發(fā)生途徑，建立光葉薔薇再生體系的方法，同時本發(fā)明方法所獲得的胚性愈傷組織，可作為光葉薔薇遺傳轉(zhuǎn)化的材料。本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)一種以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟
(O將光葉薔薇的健壯幼嫩枝條滅菌后切成單芽莖段，接種于下列培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基 +1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖，ρΗ=5· 8 6. 0，于 24 士 2°C,光照強度為1500 20001χ，光照時間為16h/d的條件下，繼代培養(yǎng)2 4周，得到光葉薔薇的無菌苗；
(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，將其接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+5. O 9. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=5. 8 6. 0，并將葉背朝向培養(yǎng)基，在24 士 2°C的黑暗條件下，培養(yǎng)至誘導(dǎo)出胚性愈傷組織；
(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到下列增殖分化培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+3. O 6. Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=5. 8 6. 0，先在24 士 2°C的黑暗條件下培養(yǎng)10 11天，然后在24 士 2°C、光照強度為1500 20001x、光照時間為16h/d的條件下，培養(yǎng)至分化出不定芽；
(4)切下步驟(3)得到的不定芽，接種到下列成苗培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+0.1 1. 0mg/L 6-芐基腺嘌呤+0. 01 0. lmg/L α -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 8 6. 0，在溫度為24 士 2°C、光照強度為1500 20001x、光照時間為16h/d的條件下，培養(yǎng)至不定芽再生出植株；
(5)將步驟(4)得到的植株接種到下列生根培養(yǎng)基上1/2MS基本培養(yǎng)基+0.Olmg/La-萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 8 6. 0，在溫度為24 士 2°C、光照強度為1500 20001x、光照時間為16h/d的條件下，進行生根培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出完整的植株。所述步驟(I)的莖段滅菌是先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min,然后用1%升萊消毒8min,再以無菌水洗4 5次。作為優(yōu)選方案，所述步驟(2)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的a -萘乙酸為5. Omg/L
作為優(yōu)選方案，所述步驟(3)的增殖分化培養(yǎng)基中N-苯基-N’ -1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)為 5. Omg/L ο作為優(yōu)選方案，所述步驟(3)的黑暗培養(yǎng)天數(shù)為10天。作為優(yōu)選方案，所述步驟(4)的成苗培養(yǎng)基中6-芐基腺嘌呤為O. lmg/L、a -萘乙酸為 O. 05mg/L。 所述的植物激素定義及簡稱如下植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)包括a -萘乙酸(NAA)，植物細胞分裂素包括N-苯基-N’ -1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)。所述植物凝膠為市購產(chǎn)品，作為培養(yǎng)基的凝固劑，其作用類似于瓊脂。本發(fā)明以光葉薔薇葉片為外植體，通過器官發(fā)生途徑進行光葉薔薇植株再生，以光葉薔薇頂生幼嫩小葉為外植體，直接誘導(dǎo)胚性愈傷組織，繼而分化不定芽得到完整的再生植株；這些胚性愈傷組織為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化提供了良好的受體；同時，該再生體系也是光葉薔薇遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體并為研究轉(zhuǎn)基因月季新品種奠定了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。本發(fā)明具備的優(yōu)點和效果是
(1)本發(fā)明所采用的外植體來源不受季節(jié)限制，可以周年進行光葉薔薇的組織和細胞培養(yǎng)；
(2)本發(fā)明得到的胚性愈傷組織，可以作為遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體，為光葉薔薇遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供受體；
(3)本發(fā)明建立的再生體系可以解決光葉薔薇繁殖上的難題，以更好的保護和利用該資源。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。實驗材料光葉薔薇采自云南省昆明市云南農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所雨樹村野生資源圃，為通過光葉薔薇培育出的園藝雜交品種‘Rosa wichuraina ‘Basye’ s Thornless’，二倍體，該種引種于美國A&M大學(xué)。該材料具有一年一次開花，花白色，五瓣花，莖干無皮刺，匍匐，抗白粉病等性狀特點，是研究薔薇屬植株性狀發(fā)育的理想模式材料，并已在月季花發(fā)育研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。實施例1
(1)將上述光葉薔薇的健壯幼嫩枝條先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min,然后在超凈工作臺上用1%升汞消毒8min，再以無菌水洗5次后，切成單芽莖段，接種于下列培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH=6.0，于25°C、光照強度為15001x、光照時間為16h/d的條件下，進行繼代培養(yǎng)2周，得到光葉薔薇的無菌苗；
(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，自小葉柄處將其切成帶有小葉柄的單葉，將其接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+5. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=6. 0，并將葉背朝向培養(yǎng)基，在溫度為24°C的黑暗條件下，培養(yǎng)誘導(dǎo)胚性愈傷組織，培養(yǎng)25天后小葉柄處形成胚性愈傷；
(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到增殖分化培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+5.Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=6. O,先在溫度為24°C的黑暗條件下培養(yǎng)10天，然后在溫度24°C、光照強度為20001x、光照時間為16h/d的條件下，進行分化培養(yǎng)25天，得到I 2cm的不定芽；
(4)將步驟(3)得到的不定芽從外植體上切下接種到成苗培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+0. lmg/L 6-芐基腺嘌呤 +0. 05mg/L α -萘乙酸 +30. Og/L 蔗糖 +6. 5g/L 瓊脂粉，ρΗ=6· O,在溫度為24°C、光照強度為20001x、光照時間為16h/d的的條件下，培養(yǎng)2周，使其再生出2 3cm植株；
(5)將步驟(4)中得到的植株接種到生根培養(yǎng)基上1/2MS基本培養(yǎng)基+0.01mg/La -萘 乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=6. 0，在溫度為24°C、光照強度為20001x、光照時間為16h/d的條件下，進行生根培養(yǎng)2周，得到完整的根系發(fā)育良好的光葉薔薇植株；
(6 )將步驟(5 )的光葉薔薇植株在散射光下煉苗一周，然后移栽到經(jīng)高壓滅菌的泥炭土中室內(nèi)種植，成活后移到室外。
實施例2
(1)將上述光葉薔薇的健壯幼嫩枝條先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min,然后在超凈工作臺上用1%升汞消毒8min，再以無菌水洗4次后，切成單芽莖段，接種于下列培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH=5.8，于22°C、光照強度為18001x、光照時間為16h/d的條件下，進行繼代培養(yǎng)3周，得到光葉薔薇的無菌苗；
(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，將其接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+不同濃度7. 0mg/L的a -萘乙酸+30. 0g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=5. 8，并將葉背朝向培養(yǎng)基，在溫度為26°C的黑暗條件下，培養(yǎng)21天后小葉柄處有胚性愈傷形成；
(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到增殖分化培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+6.Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=5. 8，先在溫度為26°C的黑暗條件下培養(yǎng)11天，然后在溫度為26°C、光照強度為18001x、光照時間為16h/d的條件下，進行分化培養(yǎng)21天，得到不定芽；
(4)將步驟(3)得到的不定芽接種到成苗培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-芐基腺嘌呤+0. O lmg/L α-萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，ρΗ=5· 8，在溫度為26°C、光照強度為15001x、光照時間為16h/d的條件下，培養(yǎng)2周，使其再生出2 3cm植株；
(5)將步驟(4)中得到的植株接種到生根培養(yǎng)基上1/2MS基本培養(yǎng)基+0.01mg/La -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 8，在溫度為26°C、光照強度為15001x、光照時間為16h/d的條件下，進行生根培養(yǎng)，2周后可獲得完整的植株。實施例3
(O將光葉薔薇的健壯幼嫩枝條先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min,然后在超凈工作臺上用1%升汞消毒8min，再以無菌水洗5次后，切成單芽莖段，接種于下列培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH=5. 9，于溫度為24°C、光照強度為20001x光照時間為16h/d的條件下，進行繼代培養(yǎng)4周得到光葉薔薇的無菌苗；
(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，將其接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+9. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=6. O,并將葉背朝向培養(yǎng)基，在溫度為22°C的黑暗條件下，培養(yǎng)24天誘導(dǎo)胚性愈傷組織；
(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到增殖分化培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+4.Omg/L的N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=6. 0，先在溫度22°C的黑暗條件下培養(yǎng)10天，然后在溫度22°C、光照強度為15001x光照時間為16h/d的條件下培養(yǎng)24天后得到不定芽；
(4)將步驟(3)得到的不定芽接種到成苗培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+1.Omg/L 6-芐基腺嘌呤+0. lmg/L α -萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=6. 0，在溫度22°C的光照強 度為18001x光照時間為16h/d的條件下，培養(yǎng)2周，使其再生出2 3cm植株；
(5)將步驟(4)中得到的植株接種到生根培養(yǎng)基上1/2MS基本培養(yǎng)基+0.01mg/La -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 9，在溫度22°C、光照強度為18001x光照時間為16h/d的條件下進行生根培養(yǎng)，2周后即可得到完整的植株。實施例4
(O將光葉薔薇的健壯幼嫩枝條先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min,然后在超凈工作臺上用1%升汞消毒8min，再以無菌水洗5次后，切成單芽莖段，接種于下列培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH=6. O,于26°C光照強度為20001x，光照時間16h/d的條件下，進行繼代培養(yǎng)2周得到光葉薔薇的無菌苗；
(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，將其接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+8. 0mg/L a -萘乙酸+30. 0g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=6. O,并將葉背朝向培養(yǎng)基，在溫度25°C的黑暗條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)胚性愈傷組織；
(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到增殖分化培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+3.Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ) +30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=6. 0，先在溫度25°C的黑暗條件下培養(yǎng)11天，然后在溫度25°C、光照強度為20001x光照時間為16h/d的條件下培養(yǎng)25天可得到不定芽；
(4)將步驟(3)得到的不定芽接種到成苗培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-芐基腺嘌呤+0. 05mg/L a -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，ρΗ=5· 8，在溫度為25°C，光照強度為20001x光照時間為16h/d的條件下培養(yǎng)，使其生長成植株；
(5)將步驟(4)中得到的植株接種到生根培養(yǎng)基上1/2MS基本培養(yǎng)基+0.01mg/La -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 8，在溫度25°C、光照強度為20001x光照時間為16h/d的條件下生根培養(yǎng)，2周后即可得到完整的植株。實施例5
(O將光葉薔薇的健壯幼嫩枝條先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min,然后在超凈工作臺上用1%升汞消毒8min，再以無菌水洗5次后，切成單芽莖段，接種于下列培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH=5.8，于溫度為26°C、光照強度為20001x、光照時間為16h/d的條件下，進行繼代培養(yǎng)4周得到光葉薔薇的無菌苗；
(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，將其接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+9. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=5. 8，并將葉背朝向培養(yǎng)基，在溫度25°C的黑暗條件下，培養(yǎng)23天誘導(dǎo)胚性愈傷組織；
(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到增殖分化培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+3.Omg/L N-苯基-N’-1，2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=5. 9，先在溫度25°C的黑暗條件下培養(yǎng)10天，然后在溫度25°C、光照強度為20001x光照時間為16小時的條件下培養(yǎng)25天，可得到不定芽；
(4)將步驟(3)得到的不定芽接種到成苗培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-芐基 腺嘌呤+0. lmg/L α -萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 9，在溫度25°C、光照強度為20001x光照時間為16h/d的條件下培養(yǎng)，使其生長為植株；
(5)將步驟(4)中得到的植株接種到生根培養(yǎng)基上1/2MS基本培養(yǎng)基+0.01mg/La -萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 8，在溫度25°C、光照強度為20001x光照時間為16小時的條件下進行生根培養(yǎng)，2周即得到完整的植株。
權(quán)利要求
1.一種以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟(O將光葉薔薇的健壯幼嫩枝條滅菌后切成單芽莖段，接種于下列培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基 +1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖，ρΗ=5· 8 6. O，于 24 士 2°C, 光照強度為1500 20001χ，光照時間為16h/d的條件下，繼代培養(yǎng)2-4周，得到光葉薔薇的無菌苗；(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，將其接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+5. O 9. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠， pH=5. 8 6. 0，并將葉背朝向培養(yǎng)基，在24 士 2°C的黑暗條件下，培養(yǎng)至誘導(dǎo)出胚性愈傷組織；(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到下列增殖分化培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基 +3. O 6. Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠， pH=5. 8 6. 0，先在24 士 2°C的黑暗條件下培養(yǎng)10 11天，然后在24 士 2°C、光照強度為 1500 20001x、光照時間為16h/d的條件下，培養(yǎng)至分化出不定芽；(4)切下步驟(3)得到的不定芽，接種到下列成苗培養(yǎng)基上MS基本培養(yǎng)基+0.1 1.Omg/L 6-芐基腺嘌呤+0. 01 O. lmg/L α -萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉， pH=5. 8 6. 0，在溫度為24 士 2°C、光照強度為1500 20001x、光照時間為16h/d的條件下，培養(yǎng)至不定芽再生出植株；(5)將步驟(4)得到的植株接種到下列生根培養(yǎng)基上1/2MS基本培養(yǎng)基+0.Olmg/ L α -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 8 6. 0，在溫度為24 士 2°C、光照強度為1500 20001x、光照時間為16h/d的條件下，進行生根培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出完整的植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法，其特征在于所述步驟(I)的莖段滅菌是先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min，然后用 1%升萊消毒8min,再以無菌水洗4 5次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法，先在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)出無菌苗，再在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)愈傷組織，又在增殖分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)分化出不定芽，在成苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)再生出植株，最后在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到完整的植株。本發(fā)明的方法具有外植體來源廣泛、取材方便等優(yōu)點。所得到的胚性愈傷組織可以作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體，可用于光葉薔薇遺傳轉(zhuǎn)化的研究。本發(fā)明還涉及用于該方法的培養(yǎng)基組成。
文檔編號A01H4/00GK103004600SQ20121056194
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月22日
發(fā)明者呂經(jīng)娟, 唐開學(xué), 李淑斌, 蹇洪英, 晏慧君, 周寧寧, 張顥 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所