細(xì)胞凍存液及細(xì)胞凍存方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種細(xì)胞凍存液及細(xì)胞凍存方法。該細(xì)胞凍存液按體積百分?jǐn)?shù)包括90~95%的全細(xì)胞培養(yǎng)液及5~10%二甲基亞砜，其中，所述全細(xì)胞培養(yǎng)液包括體積比為9:1的細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清。這種細(xì)胞凍存液中的全細(xì)胞培養(yǎng)液為細(xì)胞生命代謝提供必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，二甲基亞砜作為防凍劑，通過合理配比全細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞培養(yǎng)基與胎牛血清的量及全細(xì)胞培養(yǎng)液與防凍劑的量，使得胎牛血清含量較低的全細(xì)胞培養(yǎng)液能夠?yàn)榧?xì)胞生命代謝提供必須的、足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而合適的防凍劑的量能夠防止或減少冷凍冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷作用，提高細(xì)胞的存活率，且該細(xì)胞凍存液不含易造成污染的血清，污染風(fēng)險(xiǎn)較低。
【專利說(shuō)明】細(xì)胞凍存液及細(xì)胞凍存方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞凍存技術(shù)，特別是涉及一種細(xì)胞凍存液及細(xì)胞凍存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞凍存及復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中的重要技術(shù)之一，細(xì)胞凍存是保存培養(yǎng)細(xì)胞的一種方法。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。
[0003]細(xì)胞凍存液是細(xì)胞凍存時(shí)必須使用的一種溶液，其作用是將需要凍存的細(xì)胞懸浮于凍存液，供給細(xì)胞生命代謝所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)可以防止或減少冷凍冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷作用。為了為細(xì)胞提供足夠的營(yíng)養(yǎng)，保持細(xì)胞的存活率，現(xiàn)有的細(xì)胞凍存液一般加入較多的血清作為細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，血清占細(xì)胞凍存液的體積一般從20%~90%不等，不僅價(jià)格昂貴，還易導(dǎo)致污染風(fēng)險(xiǎn)較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于此，有必要提供一種提高細(xì)胞存活率，且污染風(fēng)險(xiǎn)較低的細(xì)胞凍存液。
[0005]進(jìn)一步，提供一種細(xì)胞凍存方法。
[0006]一種細(xì)胞凍存液，按體積百分?jǐn)?shù)包括以下組分:
[0007]全細(xì)胞培養(yǎng)液 90~95% ；
[0008]二甲基亞砜5~10%;
[0009]其中，所述全細(xì)胞培養(yǎng)液包括體積比為9:1的細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清。
[0010]在其中一個(gè)實(shí)施例中，按體積百分?jǐn)?shù)包括以下組分:
[0011]全細(xì)胞培養(yǎng)液 90%;
[0012]二甲基亞砜10%;
[0013]其中，所述全細(xì)胞培養(yǎng)液包括體積比為9:1的細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清。
[0014]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括下述組分:
[0015]無(wú)水氯化鈣265.00mg/L ；硝酸鐵0.10mg/L ;氯化鉀400.00mg/L ；無(wú)水硫酸鎂97.67mg/L ;氯化鈉 6400.00mg/L ;無(wú)水磷酸二氫鈉 109.00mg/L ;丁二酸 75.00mg/L ;丁二酸鈉 100.00mg/L ；L-鹽酸精氨酸 84.00mg/L ；L-鹽酸胱氨酸 63.00mg/L ;甘氨酸 30.00mg/L ；L-鹽酸組氨酸42.00mg/L ;L_異亮氨酸105.00mg/L ;L_亮氨酸105.00mg/L ;L_鹽酸賴氨酸146.00mg/L ；L-甲硫氨酸 30.00mg/L ；L-苯丙氨酸 66.00mg/L ；L-絲氨酸 42.00mg/L ；L-蘇氨酸 95.00mg/L ；L-色氨酸 16.0Omg/L ；L-酪氨酸 72.0Omg/L ；L-纟顏氨酸 94.0Omg/L ；D-泛酸鈣4.0Omg/L ;酒石酸膽堿7.20mg/L ;葉酸mg/L ;肌醇7.20mg/L ;煙酰胺4.0Omg/L ;核黃素0.40mg/L ;鹽酸硫胺4.00mg/L ;鹽酸吡卩多辛4.00mg/L ;葡萄糖1000.00mg/L ;丙酮酸鈉110.00mg/L 及酚紅 9.30mg/L。
[0016]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括下述組分:
[0017]氯化鈣116.6mg/L ;硫酸銅0.0013mg/L ;九水合硝酸鐵0.05mg/L ;七水合硫酸亞鐵0.417mg/L ;氯化鉀311.8mg/L ;氯化鎂28.64mg/L ;無(wú)水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6999.6mg/L ;無(wú)水磷酸二氫鈉54.35mg/L ;無(wú)水磷酸氫二鈉71.02mg/L ;七水合硫酸鋅0.432mg/L ；L-鹽酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ；甘氨酸18.75mg/L ；L-鹽酸組氨酸31.48mg/L ；L-異亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-鹽酸賴氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸35.48mg/L ；L-絲氨酸26.25mg/L ；L-蘇氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸 4.45mg/L ；L-門冬酰胺 7.5mg/L ；L-門冬氨酸6.65mg/L ;L-鹽酸半胱氨酸 17.56mg/L ;L_ 谷氨酸 7.35mg/L ;L_ 脯氨酸 17.25mg/L ;L_ 色氨酸9.02mg/L ；L-酪氨酸mg/L ；L-繳氨酸52.85mg/L ;無(wú)水葡萄糖3151mg/L ;次黃嘌呤2mg/L ;亞油酸 0.042mg/L ;硫辛酸 0.105mg/L ;酚紅 8.lmg/L ;1，4- 丁二胺二鹽酸鹽 0.08Img/L ;丙酮酸鈉55mg/L ;維生素H0.0035mg/L ；D-泛酸韓2.24mg/L ;氯化膽堿8.98mg/L ;葉酸
2.65mg/L ;肌醇12.6mgL ;煙酰胺2.02mg/L ;鹽酸批卩多醒2mg/L ;鹽酸批卩多醇0.03mgL ;核黃素 0.219mg/L ;鹽酸硫胺 2.17mg/L ;胸苷 0.365mg/L 及維生素 B120.68mg/L。
[0018]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括下述組分:
[0019]四水硝酸|丐100mg/L ;氯化鉀400mg/L ;無(wú)水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6000mg/L ；無(wú)水磷酸氫二鈉800mg/L ；L-鹽酸精氨酸200mg/L ；L-門冬酰胺50mg/L ；L-門冬氨酸20mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽65.15mg/L ；L-谷氨酸20mg/L ；L-谷氨酰胺300mg/L ;甘氨酸10mg/L ；L-鹽酸組氨酸15mg/L ；L-輕脯氨酸20mg/L ；L-異亮氨酸50mg/L ；L-鹽酸賴氨酸40mg/L ；L-甲硫氨酸15mg/L ；L-苯丙氨酸15mg/L ；L-脯氨酸20mg/L ；L-絲氨酸30mg/L ；L-蘇氨酸20mg/L ；L-色氨酸5mg/L ；L-酪氨酸20mg/L ；L-繳氨酸20mg/L ;無(wú)水葡萄糖2000mg/mL ;還原型谷胱甘肽lmg/L ;苯酹紅5mg/L ；D-生物素0.2mg/L ;泛酸韓0.25mg/L ;氯化膽堿3mg/L ;葉酸lmg/L ;肌醇35mg/L ;煙酰胺lmg/L ;對(duì)氨基苯甲酸lmg/L ;維生素B6lmg/L ;維生素B20.2mg/L ;維生素 B1 lmg/L 及維生素 B120.005mg/L。
[0020]一種細(xì)胞凍存方 法，包括如下步驟:
[0021]將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌，并將所述洗滌后的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用上述細(xì)胞凍存液進(jìn)行懸浮，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用所述細(xì)胞凍存液進(jìn)行稀釋，得到濃度為0.5飛X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與所述細(xì)胞凍存液的混合液；
[0022]將所述濃度為0.5飛X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與所述細(xì)胞凍存液的混合液分裝于ImL的無(wú)菌凍存管中；
[0023]將所述裝有濃度為0.5飛X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與所述細(xì)胞凍存液的混合液的無(wú)菌凍存管放置于程序降溫盒中降溫至_80°C，并于_80°C下放置24小時(shí)~96小時(shí)，然后將所述無(wú)菌凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
[0024]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，所述將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌的步驟為:將所述貼壁細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，除去培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS緩沖液進(jìn)行洗滌，然后除去所述PBS緩沖液。
[0025]在其中一個(gè)實(shí)施例中，將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌的步驟之后還包括細(xì)胞消化的步驟，所述細(xì)胞消化的步驟為:向所述貼壁細(xì)胞的表面加入0.5^2mL濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)消化2飛分鐘，再加入3~5mL所述細(xì)胞凍存液的全細(xì)胞培養(yǎng)液，以終止所述胰蛋白酶的消化作用，然后將所述貼壁細(xì)胞吹散，并將所述貼壁細(xì)胞與所述全細(xì)胞培養(yǎng)液的混合液于500轉(zhuǎn)/分鐘~1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到細(xì)胞沉淀。[0026]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述胰蛋白酶溶液中含有濃度為0.38%的乙二胺四乙酸。
[0027]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，所述將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌的步驟具體為:將所述懸浮細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，將含有對(duì)數(shù)期的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液于500轉(zhuǎn)/分鐘~1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到細(xì)胞沉淀，加入PBS緩沖液，再于500轉(zhuǎn)/分鐘~1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到洗滌后的細(xì)胞沉淀。
[0028]上述細(xì)胞凍存液中的全細(xì)胞培養(yǎng)液為細(xì)胞生命代謝提供必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，二甲基亞砜作為防凍劑，通過合理配比全細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞培養(yǎng)基與胎牛血清的量及全細(xì)胞培養(yǎng)液與防凍劑的量，使得胎牛血清含量較低的全細(xì)胞培養(yǎng)液能夠?yàn)榧?xì)胞生命代謝提供必須的、足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而合適的防凍劑的量能夠防止或減少冷凍冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷作用，提高細(xì)胞的存活率，且該細(xì)胞凍存液不含易造成污染的血清，污染風(fēng)險(xiǎn)較低。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0029]圖1為一實(shí)施方式的細(xì)胞凍存方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說(shuō)明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來(lái)實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。
[0031]一實(shí)施方式的細(xì)胞凍存液，按體積百分?jǐn)?shù)包括以下組分:全細(xì)胞培養(yǎng)液90、5%及二甲基亞砜5~10%。
[0032]全細(xì)胞培養(yǎng)液包括細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清的體積比為9:1。
[0033]全細(xì)胞培養(yǎng)液為細(xì)胞生命代謝提供必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。二甲基亞砜作為防凍劑，能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，利于細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶造成的細(xì)胞損傷。
[0034]上述細(xì)胞凍存液通過合理配比營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)全細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞培養(yǎng)液與胎牛血清的量及全細(xì)胞培養(yǎng)液及防凍劑二甲基亞砜的量，能夠?yàn)榧?xì)胞提供必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并能夠減少由于冰晶造成的細(xì)胞損傷，從而能夠提高細(xì)胞的存活率。并且，由于該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不含有昂貴的血清，污染風(fēng)險(xiǎn)較低，同時(shí)成本較低，有利于降低凍存成本。
[0035]優(yōu)選地，全細(xì)胞培養(yǎng)液的體積百分?jǐn)?shù)為90%，二甲基亞砜的體積百分?jǐn)?shù)為10%。
[0036]優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基包括以下組分:
[0037]氯化鈣116.6mg/L ;硫酸銅0.0013mg/L ;九水合硝酸鐵0.05mg/L ;七水合硫酸亞鐵0.417mg/L ;氯化鉀311.8mg/L ;氯化鎂28.64mg/L ;無(wú)水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6999.6mg/L ;無(wú)水磷酸二氫鈉54.35mg/L ;無(wú)水磷酸氫二鈉71.02mg/L ;七水合硫酸鋅
0.432mg/L ；L-鹽酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ；甘氨酸18.75mg/L ；L-鹽酸組氨酸31.48mg/L ；L-異亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-鹽酸賴氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸35.48mg/L ；L-絲氨酸26.25mg/L ；L-蘇氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸 4.45mg/L ；L-門冬酰胺 7.5mg/L ；L-門冬氨酸
6.65mg/L ;L-鹽酸半胱氨酸 17.56mg/L ;L_ 谷氨酸 7.35mg/L ;L_ 脯氨酸 17.25mg/L ;L_ 色氨酸9.02mg/L ；L-酪氨酸mg/L ；L-繳氨酸52.85mg/L ;無(wú)水葡萄糖3151mg/L ;次黃嘌呤2mg/L ;亞油酸 0.042mg/L ;硫辛酸 0.105mg/L ;酚紅 8.lmg/L ;1，4- 丁二胺二鹽酸鹽 0.08Img/L ;丙酮酸鈉55mg/L ;維生素H0.0035mg/L ；D-泛酸韓2.24mg/L ;氯化膽堿8.98mg/L ;葉酸
2.65mg/L ;肌醇12.6mg/L ;煙酰胺2.02mg/L ;鹽酸批卩多醒2mg/L ;鹽酸批卩多醇0.03mgL ;核黃素 0.219mg/L ;鹽酸硫胺 2.17mg/L ;胸苷 0.365mg/L 及維生素 B120.68mg/L。
[0038]在其他實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包括以下組分:氯化鈣116.6mg/L;硫酸銅0.0013mg/L ;九水合硝酸鐵0.05mg/L ;七水合硫酸亞鐵0.417mg/L ;氯化鉀311.8mg/L ;氯化鎂28.64mg/L ;無(wú)水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6999.6mg/L ;無(wú)水磷酸二氫鈉54.35mg/L ;無(wú)水磷酸氫二鈉71.02mg/L ;七水合硫酸鋅0.432mg/L ；L-鹽酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ;甘氨酸18.75mg/L ；L-鹽酸組氨酸31.48mg/L ；L-異亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-鹽酸賴氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸 35.48mg/L ；L-絲氨酸 26.25mg/L ；L-蘇氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸4.45mg/L ；L-門冬酰胺7.5mg/L ；L-門冬氨酸6.65mg/L ；L-鹽酸半胱氨酸17.56mg/L ；L-谷氨酸 7.35mg/L ；L-脯氨酸 17.25mg/L ；L-色氨酸 9.02mg/L ；L-酪氨酸 mg/L ；L-繳氨酸52.85mg/L ;無(wú)水葡萄糖3151mg/L ;次黃嘌呤2mg/L ;亞油酸0.042mg/L ;硫辛酸0.105mg/L ;酚紅 8.lmg/L ；1, 4-丁二胺二鹽酸鹽 0.08lmg/L ;丙酮酸鈉 55mg/L ;維生素 H0.0035mg/L ；D-泛酸鈣 2.24mg/L ;氯化膽堿 8.98mg/L ;葉酸 2.65mg/L ;肌醇 12.6mg/L ;煙酰胺 2.02mg/L ;鹽酸吡B多醒2mg/L ;鹽酸吡B多醇0.03mg/L ;核黃素0.219mg/L ;鹽酸硫胺2.17mg/L ;胸苷0.365mg/L 及維生素 B120.68mg/L。
[0039]在另外的實(shí)施方 式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包括以下組分:
[0040]四水硝酸鈣100mg/L ;氯化鉀400mg/L ;無(wú)水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6000mg/L ；無(wú)水磷酸氫二鈉800mg/L ；L-鹽酸精氨酸200mg/L ；L-門冬酰胺50mg/L ；L-門冬氨酸20mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽65.15mg/L ；L-谷氨酸20mg/L ；L-谷氨酰胺300mg/L ;甘氨酸10mg/L ；L-鹽酸組氨酸15mg/L ；L-輕脯氨酸20mg/L ；L-異亮氨酸50mg/L ；L-鹽酸賴氨酸40mg/L ；L-甲硫氨酸15mg/L ；L-苯丙氨酸15mg/L ；L-脯氨酸20mg/L ；L-絲氨酸30mg/L ；L-蘇氨酸20mg/L ；L-色氨酸5mg/L ；L-酪氨酸20mg/L ；L-繳氨酸20mg/L ;無(wú)水葡萄糖2000mg/mL ;還原型谷胱甘肽lmg/L ;苯酹紅5mg/L ；D-生物素0.2mg/L ;泛酸韓0.25mg/L ;氯化膽堿3mg/L ;葉酸lmg/L ;肌醇35mg/L ;煙酰胺lmg/L ;對(duì)氨基苯甲酸lmg/L ;維生素B6lmg/L ;維生素B20.2mg/L ;維生素 B1 lmg/L 及維生素 B120.005mg/L。
[0041]上述細(xì)胞凍存液的全細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞培養(yǎng)基分別采用上述三種不同的配方時(shí)，上述細(xì)胞凍存液能夠適用于293細(xì)胞、Hela細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、CHO細(xì)胞、Raji細(xì)胞、Daudi細(xì)胞、HL60細(xì)胞、K562細(xì)胞等多種細(xì)胞，適用性廣泛。
[0042]請(qǐng)參閱圖1，一種細(xì)胞凍存方法，包括如下步驟:
[0043]步驟SllO:將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌，并將洗滌后的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用上述細(xì)胞凍存液進(jìn)行懸浮，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用上述細(xì)胞凍存液進(jìn)行稀釋，得到濃度為0.5飛X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與細(xì)胞凍存液的混合液。
[0044]欲凍存的細(xì)胞應(yīng)為生長(zhǎng)良好的狀態(tài)，因此取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞凍存。在細(xì)胞凍存前，先用PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗，以除去細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0045]當(dāng)欲凍存的細(xì)胞為懸浮細(xì)胞時(shí)，將懸浮細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，將含有對(duì)數(shù)期的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液于500轉(zhuǎn)/分鐘~1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到細(xì)胞沉淀，然后加入PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再于500轉(zhuǎn)/分鐘~1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到洗滌后的細(xì)胞沉淀。將洗滌后的細(xì)胞沉淀用上述細(xì)胞凍存液進(jìn)行懸浮，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用上述細(xì)胞凍存液進(jìn)行稀釋，得到濃度為0.5飛X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與細(xì)胞凍存液的混合液。
[0046]當(dāng)欲凍存的細(xì)胞為貼壁細(xì)胞時(shí)，將該貼壁細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，用移液槍或移液管吸掉培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液，向培養(yǎng)皿中加入PBS緩沖液，輕輕晃動(dòng)進(jìn)行洗滌，然后用移液槍或移液管除去PBS緩沖液。
[0047]洗滌后，貼壁細(xì)胞仍然貼附于培養(yǎng)皿上，需要進(jìn)行細(xì)胞消化，以使培養(yǎng)皿上的貼壁細(xì)胞分散。細(xì)胞消化的步驟具體為:向貼壁細(xì)胞的表面加入0.5^2mL濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)消化2飛分鐘，再加入3~5mL上述細(xì)胞凍存液的全細(xì)胞培養(yǎng)液，以終止胰蛋白酶的消化作用，然后將貼壁細(xì)胞吹散，并將貼壁細(xì)胞與全細(xì)胞培養(yǎng)液的混合液于500轉(zhuǎn)/分鐘~1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到細(xì)胞沉淀。將該細(xì)胞沉淀用上述細(xì)胞凍存液進(jìn)行懸浮，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用上述細(xì)胞凍存液進(jìn)行稀釋，得到濃度為0.5飛X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與細(xì)胞凍存液的混合液。
[0048]濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液為將一定量的胰蛋白酶溶解于PBS緩沖液中，其中，胰蛋白酶的質(zhì)量與PBS緩沖液的體積的比值為0.25g: 100mL。
[0049]消化過度則對(duì)細(xì)胞的活性損傷較大，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰蛋白酶流失；消化不足則細(xì)胞難于從培養(yǎng)皿上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。因此消化的時(shí)間優(yōu)選為2~5分鐘。消化時(shí)間為至顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓即可。
[0050]優(yōu)選地，當(dāng)貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)皿上貼壁太緊時(shí)，為了便于將貼壁細(xì)胞分散，胰蛋白酶溶液中含有濃度為0.38%的乙二胺四乙酸(EDTA)。乙二胺四乙酸的質(zhì)量與胰蛋白酶溶液中的PBS緩沖液的體積之比為0.038g: 100mL。
[0051]細(xì)胞濃度過密或過稀都會(huì)降低細(xì)胞的存活率，用上述細(xì)胞凍存液進(jìn)行稀釋，使細(xì)胞的濃度0.5-5X 1O6個(gè)/毫升，以保證細(xì)胞的存活率。
[0052]步驟S120:將濃度為0.5-5X 1O6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與細(xì)胞凍存液的混合液分裝于ImL的無(wú)菌凍存管中。
[0053]將濃度為0.5-5X 1O6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與細(xì)胞凍存液的混合液分裝入多個(gè)ImL的無(wú)菌凍存管中分別進(jìn)行凍存，當(dāng)需要進(jìn)行復(fù)蘇使用時(shí)，根據(jù)需要取出一個(gè)或多個(gè)凍存了細(xì)胞的無(wú)菌凍存管，不會(huì)造成對(duì)其他凍存了細(xì)胞的無(wú)菌凍存管的污染。
[0054]步驟S130:將裝有濃度為0.5-5X 1O6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與上述細(xì)胞凍存液的混合液的多個(gè)無(wú)菌凍存管放置于程序降溫盒中降溫至_80°C，并于_80°C下放置24小時(shí)~96小時(shí)，然后將多個(gè)無(wú)菌凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
[0055]裝有濃度為0.5-5X 1O6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與上述細(xì)胞凍存液的混合液的無(wú)菌凍存管放置于程序降溫盒中勻速降溫，有利于提高細(xì)胞的存活率。
[0056]裝有濃度為0.5-5X 1O6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與上述細(xì)胞凍存液的混合液的無(wú)菌凍存管于程序降溫盒中降溫至-80°C后，于-80°C下放置24小時(shí)~96小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至液氣中保存。
[0057]在進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，首先從液氮中取出所需的數(shù)量的無(wú)菌凍存管，將無(wú)菌凍存管立即放入37°C水浴中，搖動(dòng)使凍存細(xì)胞在f 2分鐘內(nèi)融化；然后于500-1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心3~10分鐘，棄上清；加入1ml上述全細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將該細(xì)胞與全細(xì)胞培養(yǎng)液的懸浮液加入8~12ml上述全細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37°C下靜置培養(yǎng)16~24小時(shí)。
[0058]培養(yǎng)16~24小時(shí)后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞復(fù)蘇后的狀態(tài)，更換全細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，2~3天后傳代培養(yǎng)。
[0059]當(dāng)細(xì)胞為貼壁細(xì)胞時(shí)，于顯微鏡下觀察，80%以上的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后再更換全細(xì)胞
培養(yǎng)液。
[0060]上述細(xì)胞凍存方法使用包括體積分?jǐn)?shù)為90-95%全細(xì)胞培養(yǎng)液和體積分?jǐn)?shù)為5~10%的二甲基亞楓的細(xì)胞凍存液進(jìn)行凍存細(xì)胞，有利于提高細(xì)胞的存活率，并降低污染風(fēng)險(xiǎn)。
[0061]并且全細(xì)胞培養(yǎng)液包括體積比為9:1的細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清，胎牛血清在細(xì)胞凍存液中的體積分?jǐn)?shù)僅為擴(kuò)9.5%，含量較低，使用血清含量較低的細(xì)胞凍存液，凍存成本低。
[0062]以下為具體實(shí)施例。
[0063]實(shí)施例1
[0064]1、將293細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，在無(wú)菌環(huán)境下，用電動(dòng)移液管吸掉培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液中，向培養(yǎng)皿中加入IOmL PBS緩沖液，輕輕晃動(dòng)進(jìn)行洗滌，然后用電動(dòng)移液管除去PBS緩沖液；
[0065]2、在無(wú)菌環(huán)境下，向培養(yǎng)皿中的293細(xì)胞的表面均勻加入0.5mL濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)消化2分鐘，向培養(yǎng)皿內(nèi)加入3mL全細(xì)胞培養(yǎng)液，終止胰蛋白酶的消化作用，然后用電動(dòng)移液管將293細(xì)胞從培養(yǎng)皿上吹散下來(lái)使293細(xì)胞懸浮于上述全細(xì)胞培養(yǎng)液中；其中，上述全細(xì)胞培養(yǎng)液包括體積比為9:1的細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)基包括下述組分:
[0066]無(wú)水氯化鈣265.00mg/L ；硝酸鐵0.10mg/L ;氯化鉀400.0Omg/L ；無(wú)水硫酸鎂97.67mg/L ;氯化鈉 6400.0Omg/L ;無(wú)水磷酸二氫鈉 109.0Omg/L ;丁二酸 75.0Omg/L ;丁二酸鈉 100.00mg/L ；L-鹽酸精氨酸 84.00mg/L ；L-鹽酸胱氨酸 63.00mg/L ;甘氨酸 30.00mg/L ；L-鹽酸組氨酸42.00mg/L ；L-異亮氨酸105.00mg/L ；L-亮氨酸105.00mg/L ；L-鹽酸賴氨酸146.00mg/L ；L-甲硫氨酸 30.00mg/L ；L-苯丙氨酸 66.00mg/L ；L-絲氨酸 42.0Omg/L ；L-蘇氨酸 95.0Omg/L ；L-色氨酸 16.0Omg/L ；L-酪氨酸 72.0Omg/L ；L-纟顏氨酸 94.0Omg/L ；D-泛酸鈣4.0Omg/L ;酒石酸膽堿7.20mg/L ;葉酸mg/L ;肌醇7.20mg/L ;煙酰胺4.0Omg/L ;核黃素0.40mg/L ;鹽酸硫胺4.0Omg/L ;鹽酸吡卩多辛4.0Omg/L ;葡萄糖1000.0Omg/L ;丙酮酸鈉110.0Omg/L 及酚紅 9.30mg/L ；
[0067]3、將293細(xì)胞與全細(xì)胞培養(yǎng)液的懸浮液轉(zhuǎn)移至15ml無(wú)菌離心管中，于500轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，棄去上清液得到293細(xì)胞沉淀，將該293細(xì)胞沉淀用細(xì)胞凍存液進(jìn)行懸浮，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用上述細(xì)胞凍存液進(jìn)行稀釋，得到濃度為0.5 X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的293細(xì)胞與細(xì)胞凍存液的混合液；其中，上述細(xì)胞凍存液按體積百分?jǐn)?shù)包括90%的上述全細(xì)胞培養(yǎng)液及10%的二甲基亞砜；[0068]4、將濃度為0.5 X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的293細(xì)胞與細(xì)胞凍存液的混合液分裝于ImL的無(wú)菌凍存管中；
[0069]5、將裝有濃度為0.5X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的293細(xì)胞與上述細(xì)胞凍存液的混合液的多個(gè)無(wú)菌凍存管放置于程序降溫盒(Nalgene，貨號(hào):5100_0001C)中，于_80°C下放置24小時(shí)，然后將多個(gè)無(wú)菌凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
[0070]凍存一個(gè)月后，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，首先從液氮中取出I支無(wú)菌凍存管，將該無(wú)菌凍存管立即放入37°C水浴中，搖動(dòng)使凍存細(xì)胞在I分鐘內(nèi)融化；然后于500轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，棄上清；加入1ml上述全細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將該細(xì)胞與全細(xì)胞培養(yǎng)液的懸浮液加入8ml上述全細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37°C下靜置培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞的存活率，存活率為90%。
[0071]實(shí)施例2
[0072]1、將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，在無(wú)菌環(huán)境下，用電動(dòng)移液管吸掉培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液中，向培養(yǎng)皿中加入15mL PBS緩沖液，輕輕晃動(dòng)進(jìn)行洗滌，然后用電動(dòng)移液管除去PBS緩沖液；
[0073]2、在無(wú)菌環(huán)境下，向培養(yǎng)皿中的MCF-7細(xì)胞的表面均勻加入2mL濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)消化5分鐘，向培養(yǎng)皿內(nèi)加入5mL全細(xì)胞培養(yǎng)液，終止胰蛋白酶的消化作用，然后用電動(dòng)移液管將MCF-7細(xì)胞從培養(yǎng)皿上吹散下來(lái)使MCF-7細(xì)胞懸浮于上述全細(xì)胞培養(yǎng)液中；其中，上述全細(xì)胞培養(yǎng)液包括體積比為9:1的細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)基包括下述組分:
[0074]氯化鈣116.6mg/L ;硫酸 銅0.0013mg/L ;九水合硝酸鐵0.05mg/L ;七水合硫酸亞鐵0.417mg/L ;氯化鉀311.8mg/L ;氯化鎂28.64mg/L ;無(wú)水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6999.6mg/L ;無(wú)水磷酸二氫鈉54.35mg/L ;無(wú)水磷酸氫二鈉71.02mg/L ;七水合硫酸鋅0.432mg/L ；L-鹽酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ；甘氨酸18.75mg/L ；L-鹽酸組氨酸31.48mg/L ；L-異亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-鹽酸賴氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸35.48mg/L ；L-絲氨酸26.25mg/L ；L-蘇氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸 4.45mg/L ；L-門冬酰胺 7.5mg/L ；L-門冬氨酸6.65mg/L ；L-鹽酸半胱氨酸 17.56mg/L ；L-谷氨酸 7.35mg/L ；L-脯氨酸 17.25mg/L ；L-色氨酸9.02mg/L ；L-酪氨酸mg/L ；L-繳氨酸52.85mg/L ;無(wú)水葡萄糖3151mg/L ;次黃嘌呤2mg/L ;亞油酸 0.042mg/L ;硫辛酸 0.105mg/L ;酚紅 8.lmg/L ;1，4- 丁二胺二鹽酸鹽 0.08Img/L ;丙酮酸鈉55mg/L ;維生素H0.0035mg/L ；D-泛酸韓2.24mg/L ;氯化膽堿8.98mg/L ;葉酸2.65mg/L ;肌醇12.6mg/L ;煙酰胺2.02mg/L ;鹽酸批卩多醒2mg/L ;鹽酸批卩多醇0.03mgL ;核黃素 0.219mg/L ;鹽酸硫胺 2.17mg/L ;胸苷 0.365mg/L 及維生素 B120.68mg/L ；
[0075]3、將MCF-7細(xì)胞與全細(xì)胞培養(yǎng)液的懸浮液轉(zhuǎn)移至15ml無(wú)菌離心管中，于1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心3分鐘，棄去上清液得到MCF-7細(xì)胞沉淀，將該MCF-7細(xì)胞沉淀用細(xì)胞凍存液進(jìn)行懸浮，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用上述細(xì)胞凍存液進(jìn)行稀釋，得到濃度為5 X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的MCF-7細(xì)胞與細(xì)胞凍存液的混合液；其中，上述細(xì)胞凍存液按體積百分?jǐn)?shù)包括95%的上述全細(xì)胞培養(yǎng)液及5%的二甲基亞砜；
[0076]4、將濃度為5 X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的MCF-7細(xì)胞與細(xì)胞凍存液的混合液分裝于ImL的無(wú)菌凍存管中；[0077]5、將裝有濃度為5X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的MCF-7細(xì)胞與上述細(xì)胞凍存液的混合液的多個(gè)無(wú)菌凍存管放置于程序降溫盒(Nalgene，貨號(hào):5100_0001C)中，于_80°C下放置96小時(shí)，然后將多個(gè)無(wú)菌凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
[0078]凍存3個(gè)月后，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，首先從液氮中取出I支無(wú)菌凍存管，將該無(wú)菌凍存管立即放入37°C水浴中，搖動(dòng)使凍存細(xì)胞在1.5分鐘內(nèi)融化；然后于1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心3分鐘，棄上清；加入1ml上述全細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將該細(xì)胞與全細(xì)胞培養(yǎng)液的懸浮液加入12ml上述全細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37°C下靜置培養(yǎng)16小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞的存活率，存活率為85%。
[0079]實(shí)施例3
[0080]1、將HL60細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，將含有對(duì)數(shù)期的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液于800轉(zhuǎn)/分鐘下離心6min，棄去上清得到HL60細(xì)胞沉淀，然后加入12mL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再于800轉(zhuǎn)/分鐘下離心6min,棄去上清得到洗漆后的HL60細(xì)胞沉淀；
[0081]2、將洗滌后的HL60細(xì)胞沉淀用細(xì)胞凍存液進(jìn)行懸浮，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用上述細(xì)胞凍存液進(jìn)行稀釋，得到濃度為2X1O6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的HL60細(xì)胞與細(xì)胞凍存液的混合液；其中，上述細(xì)胞凍存液按體積百分?jǐn)?shù)包括90%的全細(xì)胞培養(yǎng)液及10%的二甲基亞砜，該全細(xì)胞培養(yǎng)液包括體積比為9:1的細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)基包括下述組分:
[0082]四水硝酸鈣100mg/L ;氯化鉀400mg/L ;無(wú)水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6000mg/L ；無(wú)水磷酸氫二鈉800mg/L ；L-鹽酸精氨酸200mg/L ；L-門冬酰胺50mg/L ；L-門冬氨酸20mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽65.15mg/L ；L-谷氨酸20mg/L ；L-谷氨酰胺300mg/L ;甘氨酸10mg/L ；L-鹽酸組氨酸15mg/L ；L-輕脯氨酸20mg/L ；L-異亮氨酸50mg/L ；L-鹽酸賴氨酸40mg/L ；L-甲硫氨酸15mg/L ；L-苯丙氨酸15mg/L ；L-脯氨酸20mg/L ；L-絲氨酸30mg/L ；L-蘇氨酸20mg/L ；L-色氨酸5mg/L ；L-酪氨酸20mg/L ；L-繳氨酸20mg/L ;無(wú)水葡萄糖2000mg/mL ;還原型谷胱甘肽lmg/L ;苯酹紅5mg/L ；D-生物素0.2mg/L ;泛酸韓0.25mg/L ;氯化膽堿3mg/L ;葉酸lmg/L ;肌醇35mg/L ;煙酰胺lmg/L ;對(duì)氨基苯甲酸lmg/L ;維生素B6lmg/L ;維生素B20.2mg/L ;維生素 B1 lmg/L 及維生素 B120.005mgL ；
[0083]3、將濃度為2 X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的HL60細(xì)胞與細(xì)胞凍存液的混合液分裝于ImL的無(wú)菌凍存管中；
[0084]4、將裝有濃度為2 X IO6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的HL60細(xì)胞與上述細(xì)胞凍存液的混合液的多個(gè)無(wú)菌凍存管放置于程序降溫盒(Nalgene，貨號(hào):5100_0001C)中，于_80°C下放置48小時(shí)，然后將多個(gè)無(wú)菌凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
[0085]凍存6個(gè)月后，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，首先從液氮中取出I支無(wú)菌凍存管，將該無(wú)菌凍存管立即放入37°C水浴中，搖動(dòng)使凍存細(xì)胞在2分鐘內(nèi)融化；然后于800轉(zhuǎn)/分鐘下離心5分鐘，棄上清；加入1ml上述全細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將該細(xì)胞與全細(xì)胞培養(yǎng)液的懸浮液加入IOml上述全細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37°C下靜置培養(yǎng)20小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞的存活率，存活率為88%。
[0086]以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞凍存液，其特征在于，按體積百分?jǐn)?shù)包括以下組分: 全細(xì)胞培養(yǎng)液 90~95% ； 二甲基亞砜5~10%; 其中，所述全細(xì)胞培養(yǎng)液包括體積比為9:1的細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞凍存液，其特征在于，按體積百分?jǐn)?shù)包括以下組分: 全細(xì)胞培養(yǎng)液 90% ； 甲基亞諷10% ； 其中，所述全細(xì)胞培養(yǎng)液包括體積比為9:1的細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞凍存液，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括下述組分: 無(wú)水氯化鈣265.00mg/L ;硝酸鐵0.10mg/L ;氯化鉀400.00mg/L ;無(wú)水硫酸鎂97.67mg/L ;氯化鈉 6400.00mg/L ;無(wú)水磷酸二氫鈉 109.00mg/L ; 丁二酸 75.00mg/L ; 丁二酸鈉100.00mg/L ;L-鹽酸精氨酸 84.00mg/L ;L_ 鹽酸胱氨酸 63.00mg/L ;甘氨酸 30.00mg/L ；L-鹽酸組氨酸42.00mg/L ;L_異亮氨酸105.00mg/L ;L_亮氨酸105.00mg/L ;L_鹽酸賴氨酸146.00mg/L ；L-甲硫氨酸 30.00mg/L ；L-苯丙氨酸 66.00mg/L ；L-絲氨酸 42.00mg/L ；L-蘇氨酸 95.00mg/L ；L-色氨酸 16.0Omg/L ；L-酪氨酸 72.0Omg/L ；L-纟顏氨酸 94.0Omg/L ；D-泛酸鈣4.0Omg/L ;酒石酸膽堿7.20mg/L ;葉酸mg/L ;肌醇7.20mg/L ;煙酰胺4.0Omg/L ;核黃素0.40mg/L ;鹽酸硫胺4.00mg/L ;鹽酸吡卩多辛4.00mg/L ;葡萄糖1000.00mg/L ;丙酮酸鈉110.00mg/L 及酚紅 9.30mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞凍存液，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括下述組分: 氯化鈣116.6mg/L ；硫酸銅0.0013mg/L ;九水合硝酸鐵0.05mg/L ;七水合硫酸亞鐵0.417mg/L ;氯化鉀311.8mg/L ;氯化鎂28.64mg/L ；無(wú)水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6999.6mg/L ;無(wú)水磷酸二氫鈉54.35mg/L ;無(wú)水磷酸氫二鈉71.02mg/L ;七水合硫酸鋅0.432mg/L ；L-鹽酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ；甘氨酸18.75mg/L ；L-鹽酸組氨酸31.48mg/L ；L-異亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-鹽酸賴氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸35.48mg/L ；L-絲氨酸26.25mg/L ；L-蘇氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸 4.45mg/L ；L-門冬酰胺 7.5mg/L ；L-門冬氨酸6.65mg/L ;L-鹽酸半胱氨酸 17.56mg/L ;L_ 谷氨酸 7.35mg/L ;L_ 脯氨酸 17.25mg/L ;L_ 色氨酸9.02mg/L ；L-酪氨酸mg/L ；L-繳氨酸52.85mg/L ;無(wú)水葡萄糖3151mg/L ;次黃嘌呤2mg/L ;亞油酸 0.042mg/L ;硫辛酸 0.105mg/L ;酚紅 8.lmg/L ;1，4- 丁二胺二鹽酸鹽 0.08Img/L ;丙酮酸鈉55mg/L ;維生素H0.0035mg/L ；D-泛酸韓2.24mg/L ;氯化膽堿8.98mg/L ;葉酸2.65mg/L ;肌醇12.6mg/L ;煙酰胺2.02mg/L ;鹽酸批卩多醒2mg/L ;鹽酸批卩多醇0.03mgL ;核黃素 0.219mg/L ;鹽酸硫胺 2.17mg/L ;胸苷 0.365mg/L 及維生素 B120.68mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞凍存液，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括下述組分: 四水硝酸1丐100mg/L ;氯化鉀400mg/L ;無(wú)水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6000mg/L ;無(wú)水磷酸氫二鈉800mg/L ；L-鹽酸精氨酸200mg/L ；L-門冬酰胺50mg/L ；L-門冬氨酸20mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽65.15mg/L ;L_谷氨酸20mg/L ;L_谷氨酰胺300mg/L ;甘氨酸10mg/L ;L-鹽酸組氨酸15mg/L ；L-羥脯氨酸20mg/L ；L-異亮氨酸50mg/L ；L-鹽酸賴氨酸40mg/L ；L-甲硫氨酸15mg/L ；L-苯丙氨酸15mg/L ；L-脯氨酸20mg/L ；L-絲氨酸30mg/L ；L-蘇氨酸20mg/L ;L-色氨酸5mg/L ;L-酪氨酸20mg/L ;L-繳氨酸20mg/L ;無(wú)水葡萄糖2000mg/mL ;還原型谷胱甘肽lmg/L ;苯酹紅5mg/L ；D-生物素0.2mg/L ;泛酸鈣0.25mg/L ;氯化膽堿3mg/L ;葉酸lmg/L ;肌醇35mg/L ;煙酰胺lmg/L ;對(duì)氨基苯甲酸lmg/L ;維生素B6lmg/L ;維生素B20.2mg/L ;維生素BJmg/L及維生素B120.005mg/L。
6.一種細(xì)胞凍存方法，其特征在于，包括如下步驟: 將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌，并將所述洗滌后的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用如權(quán)利要求f 5任一項(xiàng)所述的細(xì)胞凍存液進(jìn)行懸浮，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用所述細(xì)胞凍存液進(jìn)行稀釋，得到濃度為0.5-5×1O6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與所述細(xì)胞凍存液的混合液； 將所述濃度為0.5-5× 1O6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與所述細(xì)胞凍存液的混合液分裝于ImL的無(wú)菌凍存管中； 將所述裝有濃度為0.5-5× 1O6個(gè)/毫升的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞與所述細(xì)胞凍存液的混合液的無(wú)菌凍存管放置于程序降溫盒中降溫至_80°C，并于_80°C下放置24小時(shí)~96小時(shí)，然后將所述無(wú)菌凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞凍存方法，其特征在于，所述細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，所述將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌的步驟為:將所述貼壁細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，除去培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS緩沖液進(jìn)行洗滌，然后除去所述PBS緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞凍存方法，其特征在于，將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌的步驟之后還包括細(xì)胞消化的步驟，所述細(xì)胞消化的步驟為:向所述貼壁細(xì)胞的表面加入0.5^2mL濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)消化2-5分鐘，再加入3-5mL所述細(xì)胞凍存液的全細(xì)胞培養(yǎng)液，以終止所述胰蛋白酶的消化作用，然后將所述貼壁細(xì)胞吹散，并將所述貼壁細(xì)胞與所述全細(xì)胞培養(yǎng)液的混合液于500轉(zhuǎn)/分鐘~1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心3分鐘~10分鐘,棄去上清得到細(xì)胞沉淀。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞凍存方法，其特征在于，所述胰蛋白酶溶液中含有濃度為0.38%的乙二胺四乙酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞凍存方法，其特征在于，所述細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，所述將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌的步驟具體為:將所述懸浮細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，將含有對(duì)數(shù)期的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液于500轉(zhuǎn)/分鐘~1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到細(xì)胞沉淀，加入PBS緩沖液，再于500轉(zhuǎn)/分鐘~1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到洗滌后的細(xì)胞沉淀。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK103891709SQ201210568487
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月24日
【發(fā)明者】萬(wàn)曉春, 陳鳳蓮, 趙琦, 李紅昌 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院