專(zhuān)利名稱(chēng)：一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液及利用其冷凍保存細(xì)鱗鮭精液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚(yú)類(lèi)精液超低溫冷凍保存的抗凍液及利用其冷凍保存細(xì)鱗鮭精液的方法。
背景技術(shù)：
豐富的種質(zhì)資源是魚(yú)類(lèi)遺傳育種、商業(yè)養(yǎng)殖品種開(kāi)發(fā)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，但由于漁業(yè)資源的過(guò)度捕撈、無(wú)序利用及人工放流等，造成了某些魚(yú)類(lèi)資源的衰退和珍惜種類(lèi)瀕臨滅絕，如不及時(shí)采取保護(hù)措施，將會(huì)造成絕大部分魚(yú)類(lèi)的原、良種遺傳資源的喪失。細(xì)鱗鮭(Brachymystax Ienok)屬鮭形目(Salmoniformes)、鮭科(Salmonidae)、隸屬于細(xì)鱗鮭屬(Brachymystax)。漸危等級(jí)易危，國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。細(xì)鱗鮭營(yíng)養(yǎng)豐富，肉質(zhì)細(xì)嫩，肉味鮮美，易于馴化，深受廣大消費(fèi)者青睞，隨著近些年來(lái)市場(chǎng)對(duì)細(xì)鱗鮭的需求量不斷增加，細(xì)鱗鮭的商業(yè)化養(yǎng)殖與育種事業(yè)得到了大力發(fā)展，但在進(jìn)行選育工作中種質(zhì)資源的保護(hù)往往被忽視了，進(jìn)而導(dǎo)致商業(yè)養(yǎng)殖過(guò)程中近交種質(zhì)退化愈演愈烈，遺傳多樣性降低，品質(zhì)下降，生長(zhǎng)性能低下，大部分養(yǎng)殖品種對(duì)病害和環(huán)境脅迫的防御能力降低，病害頻發(fā)，因而給養(yǎng)殖企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自從上個(gè)世紀(jì)50年代，英國(guó)學(xué)者Blaxter首次成功對(duì)魚(yú)類(lèi)精巢進(jìn)行冷凍以來(lái)，國(guó)外許多學(xué)者對(duì)魚(yú)類(lèi)精子的長(zhǎng)期冷凍保存也進(jìn)行了相關(guān)研究和探索，在魚(yú)類(lèi)中，精子冷凍保存技術(shù)是一種對(duì)瀕危種類(lèi)基因庫(kù)進(jìn)行有效保護(hù)的重要方法；同時(shí)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中還具有重要生產(chǎn)價(jià)值，如對(duì)一些重要的商業(yè)養(yǎng)殖種類(lèi)的經(jīng)濟(jì)保護(hù)，以及保護(hù)養(yǎng)殖品系免受突發(fā)疾病、自然災(zāi)害、或水域污染等，而且凍精也易于在不同苗種場(chǎng)之間運(yùn)輸，利用其對(duì)不同品種或品系以及不同地理種群間的魚(yú)類(lèi)進(jìn)行雜交，進(jìn)而利用雜交優(yōu)勢(shì)。目前現(xiàn)有的魚(yú)類(lèi)抗凍液配方具有種的特異性，且抗凍液中化學(xué)成分多從而導(dǎo)致毒性大，不適合于細(xì)鱗鮭精液的超低溫冷凍保存，因而如能開(kāi)發(fā)出適合細(xì)鱗鮭的抗凍液配方，進(jìn)而通過(guò)超低溫冷凍保存技術(shù)構(gòu)建該魚(yú)的冷凍精子庫(kù)，將為細(xì)鱗鮭的種質(zhì)保存與遺傳多樣性保護(hù)作出巨大貢獻(xiàn)，從而為該魚(yú)的人工繁育與雜交優(yōu)勢(shì)利用不間斷的提供技術(shù)保障
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為解決現(xiàn)有的魚(yú)類(lèi)抗凍液具有種的特異性且毒性大，不適合于細(xì)鱗鮭精液的超低溫冷凍保存，凍精解凍后受精率低的技術(shù)問(wèn)題，而提供一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液及其冷凍保存方法。本發(fā)明的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液由二甲基亞砜和稀釋液組成，稀釋液由胎牛血清和葡萄糖按質(zhì)量比為100 :(1. Γ1.6)混合而成，二甲基亞砜和稀釋液的體積比為(2 4) 17o用上述細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液冷凍保存細(xì)鱗鮭精液的方法按如下步驟進(jìn)行
一、新鮮精液的采集將細(xì)鱗鮭雄性親本進(jìn)行麻醉，麻醉后用干燥的無(wú)菌紗布將細(xì)鱗鮭雄性親本體表和生殖孔擦拭干凈；然后擠壓腹部使精液流出，采集至器皿中，激活精子后將精子活動(dòng)率超過(guò)80%的新鮮精液置于溫度為(T4°C的條件下保溫待用；二、精液抗凍混合液的制備按二甲基亞砜和稀釋液的體積比為(2 4) :17，按稀釋液中胎牛血清和葡萄糖質(zhì)量比為100 :(1. Γ1.6)，分別稱(chēng)取二甲基亞砜、胎牛血清和葡萄糖，然后將二甲基亞砜分成三等份，先取第一份二甲基亞砜與胎牛血清混合，在溫度為3飛。C的條件下保溫8 12min，再按照二甲基亞砜和稀釋液的總體積與步驟一的新鮮精液的體積之比為(2 4) :1，將步驟一的新鮮精液加入，充分混合后在溫度為3飛。C的條件下保溫8 12min，然后再加入第二份二甲基亞砜，充分混合后在溫度為3飛。C的條件下保溫Γ3πι η,再加入第三份二甲基亞砜，充分混合后在溫度為3飛。C的條件下保溫，最后加入葡萄糖，得到精液抗凍混合液；·三、精液抗凍混合液的分裝將步驟二得到的精液抗凍混合液分裝于冷存管中，然后在溫度為3飛。C的條件下保溫；四、精液抗凍混合液冷凍首先將液氮導(dǎo)入帶蓋泡沫箱中，液氮液面距離箱口iri6cm,使步驟三的冷存管在液氮表面6 IOcm處停留2 5min，然后在距液氮面f 3cm處停留I 3min,最后直接放入液氣中保存；五、精液抗凍混合液冷凍后的解凍將步驟四后的冷存管放在溫度為25 30°C的水浴中，搖動(dòng)冷存管至冷存管中精液抗凍混合液溶解45°/Γ55%，然后取出放置室溫下至完全解凍。本發(fā)明的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液以二甲基亞砜作為抗凍劑，以胎牛血清和葡萄糖作為稀釋液，組成簡(jiǎn)單，化學(xué)物質(zhì)少，毒性小，且本發(fā)明的冷凍方法將抗凍劑分成三等份，先將其中一份與稀釋液混合后，再與精液混合，然后再分兩次將第二份和第三份抗凍劑加入其中并混合，冷凍后的細(xì)鱗鮭精液解凍后受精率達(dá)80%以上，相比使用現(xiàn)有的魚(yú)類(lèi)抗凍液冷凍保存細(xì)鱗鮭精液解凍后受精率提高了 30°/Γ50%，冷凍效果好，適用于細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存。


圖1是試驗(yàn)組和對(duì)照組解凍后的細(xì)鱗鮭精液受精率和抗凍劑二甲基亞砜添加量關(guān)系的對(duì)比曲線圖；其中a為對(duì)照組解凍后的細(xì)鱗鮭精液受精率和抗凍劑二甲基亞砜添加量關(guān)系曲線，b為試驗(yàn)組解凍后的細(xì)鱗鮭精液受精率和抗凍劑二甲基亞砜添加量關(guān)系曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的技術(shù)方案不局限于以下具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液由二甲基亞砜和稀釋液組成，稀釋液由胎牛血清和葡萄糖按質(zhì)量比為100 :(1. Γ1. 6)混合而成，二甲基亞砜和稀釋液的體積比為(2 4) :17。本實(shí)施方式的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液以二甲基亞砜作為抗凍劑，以胎牛血清和葡萄糖作為稀釋液，組成簡(jiǎn)單，化學(xué)物質(zhì)少，毒性小，適用于細(xì)鱗鮭精液的超低溫冷凍保存。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是葡萄糖為液態(tài)葡萄糖或固態(tài)葡萄糖，其它步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一或二不同的是稀釋液由胎牛血清和葡萄糖按質(zhì)量比為100 :1. 5混合而成，其它步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式
一或二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三之一不同的是二甲基亞砜和稀釋液的體積比為3 :17，其它步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至三之一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式的一種用細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液冷凍保存細(xì)鱗鮭精液的方法按如下步驟進(jìn)行一、新鮮精液的采集將細(xì)鱗鮭雄性親本進(jìn)行麻醉，麻醉后用干燥的無(wú)菌紗布將細(xì) 鱗鮭雄性親本體表和生殖孔擦拭干凈；然后擠壓腹部使精液流出，采集至器皿中，激活精子后將精子活動(dòng)率超過(guò)80%的新鮮精液置于溫度為(T4°C的條件下保溫待用；二、精液抗凍混合液的制備按二甲基亞砜和稀釋液的體積比為(2 4) :17，按稀釋液中胎牛血清和葡萄糖質(zhì)量比為100 :(1. Γ1.6)，分別稱(chēng)取二甲基亞砜、胎牛血清和葡萄糖，然后將二甲基亞砜分成三等份，先取第一份二甲基亞砜與胎牛血清混合，在溫度為3飛。C的條件下保溫8 12min，再按照二甲基亞砜和稀釋液的總體積與步驟一的新鮮精液的體積之比為(2 4) :1，將步驟一的新鮮精液加入，充分混合后在溫度為3飛。C的條件下保溫8 12min，然后再加入第二份二甲基亞砜，充分混合后在溫度為3飛。C的條件下保溫Γ3πι η,再加入第三份二甲基亞砜，充分混合后在溫度為3飛。C的條件下保溫，最后加入葡萄糖，得到精液抗凍混合液；三、精液抗凍混合液的分裝將步驟二得到的精液抗凍混合液分裝于冷存管中，然后在溫度為3飛。C的條件下保溫；四、精液抗凍混合液冷凍首先將液氮導(dǎo)入帶蓋泡沫箱中，液氮液面距離箱口iri6cm,使步驟三的冷存管在液氮表面6 IOcm處停留2 5min，然后在距液氮面f 3cm處停留I 3min,最后直接放入液氣中保存；五、精液抗凍混合液冷凍后的解凍將步驟四后的冷存管放在溫度為25 30°C的水浴中，搖動(dòng)冷存管至冷存管中精液抗凍混合液溶解45°/Γ55%，然后取出放置室溫下至完全解凍。本實(shí)施方式的冷凍方法將抗凍劑分成三等份，先將其中一份與稀釋液混合后，再與精液混合，然后再分兩次將第二份和第三份抗凍劑加入其中并混合，冷凍后的細(xì)鱗鮭精液解凍后受精率達(dá)80%以上，相比使用現(xiàn)有的魚(yú)類(lèi)抗凍液冷凍保存細(xì)鱗鮭精液解凍后受精率提高了 309Γ50%，冷凍效果好，適用于細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五不同的是步驟二中稀釋液由胎牛血清和葡萄糖按質(zhì)量比為100 :1. 5混合而成，其它步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式
五相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五或六之一不同的是步驟二中二甲基亞砜和稀釋液的體積比為3 :17，其它步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式
五或六相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五至七之一的是步驟二中二甲基亞砜和稀釋液的總體積與新鮮精液的體積之比為3 :1，其它步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式
五至七之一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五至八之一不同的是步驟三中的冷存管為麥管，其它步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式
五至八之一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五至九之一不同的是步驟五中冷存管為O. 5ml的麥管時(shí)，搖動(dòng)麥管15 20s，其它步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式
五至九之一相同。用以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果試驗(yàn)一、選擇體重和健康狀況相同的十尾細(xì)鱗鮭雄性親本隨即分成兩組，試驗(yàn)組作如下處理一、新鮮精液的采集用濃度為O. 05%的苯氧乙醇對(duì)細(xì)鱗鮭雄性親本進(jìn)行麻醉，然后用干燥的無(wú)菌紗布將細(xì)鱗鮭雄性親本體表和生殖孔擦拭干凈，擠壓腹部使精液流出，采 集IOml新鮮精液至器皿中，激活精子后取精子活動(dòng)率超過(guò)80 %的新鮮精液6ml置于溫度為4°C的條件下保溫待用；二、精液抗凍混合液的制備向7. 65ml的胎牛血清中加入O. 45ml的二甲基亞砜，混合后在溫度為4°C的條件下保溫lOmin，然后加入步驟一處理后的新鮮精液3ml，混合后在溫度為4°C的條件下保溫lOmin，再加入O. 45ml的二甲基亞砜，混合后在溫度為4°C的條件下保溫2min，再加入O. 45ml的二甲基亞砜，混合后在溫度為4°C的條件下保溫，最后加入O. 115克葡萄糖，得到精液抗凍混合液；三、精液抗凍混合液的分裝將步驟二得到的精液抗凍混合液分裝于，O. 5ml的麥管中，然后在溫度為4°C的條件下保溫；四、精液抗凍混合液冷凍首先將液氮導(dǎo)入帶蓋泡沫箱中，液氮液面距離箱口15cm,使步驟三的麥管在液氮表面8cm處停留4min,然后在距液氮面2cm處停留2min,最后直接放入液氣中保存；五、精液抗凍混合液冷凍后的解凍將步驟四后的麥管放在溫度為28°C的水浴中，搖動(dòng)麥管至麥管中精液抗凍混合液溶解50%，然后取出放置室溫下至完全解凍。對(duì)照組作如下處理用現(xiàn)有的魚(yú)類(lèi)精液抗凍液超低溫冷凍保存細(xì)鱗鮭精液的方法按以下步驟進(jìn)行一、精液抗凍混合液的制備與分裝取含有氯化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%，含有氯化鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 05%的稀釋液7. 65ml與O. 45ml 二甲基亞砜充分混合，混合后在溫度為4°C的條件下保溫lOmin，然后加入試驗(yàn)組步驟一處理后的新鮮精液3ml，混合后在溫度為4°C的條件下保溫lOmin，再加入O. 45ml的二甲基亞砜，混合后在溫度為4°C的條件下保溫2min，再加入O. 45ml的二甲基亞砜，混合后在溫度為4°C的條件下保溫，得到精液抗凍混合液，將精液抗凍混合液分裝于O. 5ml的麥管中，然后在溫度為4°C的條件下保溫；二、精液抗凍混合液冷凍首先將液氮導(dǎo)入帶蓋泡沫箱中，液氮液面距離箱口約15cm,使步驟一的麥管在液氮表面8cm處停留4min,然后在距液氮面2cm處停留2min,最后直接放入液氣中保存；四、精液抗凍混合液冷凍后的解凍將步驟二后的麥管放在溫度為28°C的水浴中，搖動(dòng)麥管至麥管中精液抗凍混合液溶解50%，然后取出放置室溫下至完全解凍。取上述試驗(yàn)組和對(duì)照組解凍后的細(xì)鱗鮭精液進(jìn)行人工授精試驗(yàn)，試驗(yàn)得出試驗(yàn)組和對(duì)照組解凍后的細(xì)鱗鮭精液受精率和添加的抗凍劑二甲基亞砜添加量的對(duì)比關(guān)系曲線圖，如圖1所示，從圖中可以看出對(duì)照組解凍后的細(xì)鱗鮭精液受精率最高達(dá)42%，而試驗(yàn)組解凍后的細(xì)鱗鮭精液受精率達(dá)80%，受精率提高了 38%，同時(shí)由圖1得出，抗凍劑二甲基亞砜添的最佳添加量為抗凍液體積的15%，由此可以得出本發(fā)明的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液及其冷凍保存 方法，冷凍效果好，且抗凍液組成簡(jiǎn)單，毒性小，適用于細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液，其特征在于一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液由二甲基亞砜和稀釋液組成，稀釋液由胎牛血清和葡萄糖按質(zhì)量比為100 (l.r1.6)混合而成，二甲基亞砜和稀釋液的體積比為(2 4) :17。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液，其特征在于葡萄糖為液態(tài)葡萄糖或固態(tài)葡萄糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液，其特征在于稀釋液由胎牛血清和葡萄糖按質(zhì)量比為100 :1. 5混合而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液，其特征在于二甲基亞諷和稀釋液的體積比為3 :17。
5.用權(quán)利要求1所述的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液冷凍保存細(xì)鱗鮭精液的方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行 一、新鮮精液的采集將細(xì)鱗鮭雄性親本進(jìn)行麻醉，麻醉后用干燥的無(wú)菌紗布將細(xì)鱗鮭雄性親本體表和生殖孔擦拭干凈；然后擠壓腹部使精液流出，采集至器皿中，激活精子后將精子活動(dòng)率超過(guò)80%的新鮮精液置于溫度為0 4°C的條件下保溫待用； 二、精液抗凍混合液的制備按二甲基亞砜和稀釋液的體積比為(2 4):17，按稀釋液中胎牛血清和葡萄糖質(zhì)量比為100 :(1. Γ1.6)，分別稱(chēng)取二甲基亞砜、胎牛血清和葡萄糖，然后將二甲基亞砜分成三等份，先取第一份二甲基亞砜與胎牛血清混合，在溫度為3飛。C的條件下保溫8 12min，再按照二甲基亞砜和稀釋液的總體積與步驟一的新鮮精液的體積之比為(2 4) :1，將步驟一的新鮮精液加入，充分混合后在溫度為3飛。C的條件下保溫8 12min，然后再加入第二份二甲基亞砜，充分混合后在溫度為3飛。C的條件下保溫f3min，再加入第三份二甲基亞砜，充分混合后在溫度為3飛。C的條件下保溫，最后加入葡萄糖，得到精液抗凍混合液； 三、精液抗凍混合液的分裝將步驟二得到的精液抗凍混合液分裝于冷存管中，然后在溫度為3飛。C的條件下保溫； 四、精液抗凍混合液冷凍首先將液氮導(dǎo)入帶蓋泡沫箱中，液氮液面距離箱口iri6cm,使步驟三的冷存管在液氮表面6 IOcm處停留2 5min，然后在距液氮面f 3cm處停留I 3min,最后直接放入液氣中保存； 五、精液抗凍混合液冷凍后的解凍將步驟四后的冷存管放在溫度為25 3(TC的水浴中，搖動(dòng)冷存管至冷存管中精液抗凍混合液溶解45%飛5%，然后取出放置室溫下至完全解凍。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存方法，其特征在于步驟二中稀釋液由胎牛血清和葡萄糖按質(zhì)量比為100 :1. 5混合而成。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存方法，其特征在于步驟二中二甲基亞砜和稀釋液的體積比為3 :17。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存方法，其特征在于步驟二中二甲基亞砜和稀釋液的總體積與新鮮精液的體積之比為3:1。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存方法，其特征在于步驟三中的冷存管為麥管。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存方法，其特征在于步驟五中冷存管為O. 5ml的麥管時(shí)，搖動(dòng)麥管15 20s。
全文摘要
一種細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存的抗凍液及利用其冷凍保存細(xì)鱗鮭精液的方法，它涉及一種魚(yú)類(lèi)精液超低溫冷凍保存的抗凍液及利用其冷凍保存細(xì)鱗鮭精液的方法，本發(fā)明是為解決現(xiàn)有的魚(yú)類(lèi)抗凍液具有種的特異性且毒性大，不適合于細(xì)鱗鮭精液的超低溫冷凍保存，凍精解凍后受精率低的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的抗凍液及其保存方法如下以二甲基亞砜作為抗凍劑，以胎牛血清和葡萄糖作為稀釋液，與精液混合后用液氮進(jìn)行超低溫冷凍保存，抗凍液組成簡(jiǎn)單，化學(xué)物質(zhì)少，毒性小，使冷凍后的細(xì)鱗鮭精液解凍后受精率達(dá)80%以上，相比使用現(xiàn)有的魚(yú)類(lèi)抗凍液冷凍保存細(xì)鱗鮭精液解凍后受精率提高了30%~50%，冷凍效果好，適用于細(xì)鱗鮭精液超低溫冷凍保存。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102986652SQ201210570268
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者徐革鋒, 牟振波, 劉洋 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所