專利名稱：一種冬青屬植物雜交育種的方法
一種冬青屬植物雜交育種的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明具體涉及一種冬青屬(Ilex)植物雜交育種的方法，屬于木本植物種苗繁育的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
冬青屬(Ilex)植物,屬冬青科(Aquifoliaceae),約400種,分布于南北美、熱帶和溫帶亞洲，數(shù)種產(chǎn)歐洲和大洋洲，我國約118種，長江以南各省盛產(chǎn)之，有些種類的木材可為雕刻和家具用，有些供庭園觀賞用，有些種類的葉煎汁可為紙漿的糊料。喬木或灌木； 葉互生，少數(shù)對生常綠或脫落，有齒缺或有刺狀鋸齒；花單性異株，有時雜性，為腋生的聚傘花序或傘形花序；花萼裂片、花瓣和雄蕊通常4 ;子房上位，3至多室，每室有下垂的胚珠1-2 顆，生于中軸胎座上；果為一球形、漿果狀由核果。
輻射誘變在植物選育種中顯現(xiàn)出良好的前景，我國已在水稻、玉米、小麥、花生等作物上獲得成功。隨著對輻射誘變規(guī)律的進一步了解和輻射源的不斷拓寬，輻射育種的實際應(yīng)用有著很大的發(fā)展，目前已在22種植物上育成243個突變品種。
冬青屬植物野外自然雜交品種較為豐富，目前據(jù)不完全統(tǒng)計，國內(nèi)冬青屬雜交品種有300種。雖然國內(nèi)冬青屬植物雜交品種數(shù)目居多，但由于冬青屬植物種有100余個，分布比較聚集，種間授粉率比較高，因此國內(nèi)冬青屬雜交品種的親本來源比較混亂，這給植物品種的定名以及產(chǎn)業(yè)化推廣起到很多限制作用。而國外冬青屬植物雜交品種僅有200余個，但由于均是園藝雜交 品種，因此親本來源清晰。我國冬青屬植物種的數(shù)量占世界的四分之一以上，種源豐富，因此，亟需一種快捷有效地雜交方法為中國豐富的冬青屬種源開發(fā)園藝品種。
傳統(tǒng)的冬青屬植物雜交方法，需套袋、沙藏等繁瑣的程序。不僅育種周期長，工作量也比較大，且受到花粉的污染概率也比較大。本發(fā)明提供了一種冬青屬植物雜交育種的方法，其操作簡單快捷，大大提高了授粉成功率，縮短了育種時間，從而能夠有效解決開發(fā)冬青屬植物園藝新品種的需求。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是為了縮短冬青屬植物雜交育種的周期。
為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種冬青屬植物雜交育種的方法，包括如下步驟
(I)授粉結(jié)合扦插育苗進行授粉。分別選取冬青屬植物雌株和雄株的當年生頂稍作為插穗，選擇合適的扦插池進行扦插，扦插池大小約4m2，扦插密度5cmX5cm，分別扦插兩個品種400株，扦插時間7月上旬，處理方法1000mg/L IBA浸泡插穗基部50s。扦插后 60d，在插穗葉面噴施低濃度鉀肥(350mg/LKH2P04)，同時制作硫酸紙為面板的方盒罩住整個扦插池。
(2)種子采收待果實成熟后，即紅果皮開使變軟時，將帶紅果皮種子采摘。
(3)果皮處理晾曬一周后，通過揉搓的方法去除果皮，獲得凈種子。
(4)輻射處理將步驟(3)中得到的雜交種子，進行30Gy劑量鈷60輻射處理；
(5)試管培養(yǎng)將步驟(4)中所得輻射誘變過的種子，進行消毒處理后接入試管培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)以打破種子休眠，培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基并添加赤霉素濃度為3mg/L。另外， 培養(yǎng)基中均含有瓊脂6. 5g/L、蔗糖30g/L，且pH值為6. O。培養(yǎng)時間60_90d，培養(yǎng)溫度為 20-26°C，光照時間為10-16h/d，光照強度為1600-2000LX ;消毒過程為用清水沖洗干凈， 用毛刷蘸少許洗衣粉將其表面刷洗干凈，再用自來水漂洗3-5次，然后用“安利”洗液震蕩漂洗30min,接著用自來水流水沖洗30min,于無菌操作臺上用75%乙醇消毒50_60s,無菌水沖洗I次，立即倒入84消毒液原液消毒5min，用無菌水洗滌3次，每次lmin，隨后倒入 O. 1%的升萊消毒5min,最后用無菌水洗漆4次,每次振蕩3_5min。
(6)試管苗的馴化煉苗將步驟(5)所得冬青屬雜交種無菌苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開， 露天培養(yǎng)2-3d，然后移入采用多菌靈(稀釋濃度2g/L)消毒的基質(zhì)中，組培苗上方使用帶孔 PVC膜覆蓋保濕，馴化容器采用50孔穴盤，放在通風陰涼處培養(yǎng)25-30天，培養(yǎng)到第15d將 PVC膜移除，換用折光率75%的遮陽網(wǎng)；所述基質(zhì)成分為體積比1:1的泥炭土與珍珠巖。
本發(fā)明冬青屬植物雜交育種的方法具有以下優(yōu)點·
1、授粉過程中容易控制花粉的污染
結(jié)合冬青屬植物雌雄異株的特點，通過定點扦插、整體套袋的方法，可輕易獲得任意兩個冬青屬植物種源的雜交Fl代。同時，避免了傳統(tǒng)方法中的單株單花套袋的繁瑣工作，大大節(jié)省了工作量。
2、輻射誘變處理提高了選育新品種的幾率
雜交過程中添加了鈷60輻射誘變處理，是一種誘變育種與雜交育種的結(jié)合。在獲得雜交親本性狀的同時，進行了基因誘變，大大提高了選育出變異性狀的幾率。
3、組織培養(yǎng)中激素處理可縮短種子出苗時間
按照傳統(tǒng)播種方法，冬青屬種子需沙藏一年，經(jīng)過兩冬一夏，才可發(fā)芽出苗。本發(fā)明通過結(jié)合組織培養(yǎng)的方法，利用赤霉素處理打破了種子休眠?？煽s短I年的種子出苗時間。
4、采用本發(fā)明的冬青屬植物雜交育種方法，最終可將育苗周期縮短至12個月，種子出苗率30%-38%。大大縮短育種周期。
具體實施方式
方法實施例一
1、2009年7月I日，分別選取藍少女冬青(雌株)和全緣構(gòu)骨(雄株)的當年生頂稍作為插穗，選擇合適的扦插池進行扦插，扦插池大小約4m2，扦插密度5cmX5cm，分別扦插兩個品種400株，處理方法1000mg/L IBA浸泡插穗基部50s。扦插后60d，在插穗葉面噴施低濃度鉀肥(350mg/LKH2P04)，同時制作硫酸紙為面板的方盒罩住整個扦插池。
2、種子采收2009年11月下旬，紅果皮開使變軟時，即果實開始成熟，11月30日， 將帶紅果皮種子采摘。
3、果皮處理晾曬一周后，通過揉搓的方法去除果皮，獲得凈種子1000粒。
4、輻射處理將步驟(3)中得到的雜交種子，進行30Gy劑量鈷60輻射處理；
5、試管培養(yǎng)2009年12月30日，將步驟(4)中所得輻射誘變過的種子，進行消毒處理后接入試管培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)以打破種子休眠，采用玻璃瓶進行試管培養(yǎng)，每瓶接入 10粒，共接入100瓶。培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基并添加赤霉素濃度為3mg/L。另外，培養(yǎng)基中均含有瓊脂6. 5g/L、蔗糖30g/L，且pH值為6. O。培養(yǎng)時間60_90d，培養(yǎng)溫度為20-26°C，光照時間為10-16h/d，光照強度為1600-2000LX ;消毒過程為用清水沖洗干凈，用毛刷蘸少許洗衣粉將其表面刷洗干凈，再用自來水漂洗3-5次，然后用“安利”洗液震蕩漂洗30min，接著用自來水流水沖洗30min,于無菌操作臺上用75%乙醇消毒50_60s,無菌水沖洗I次,立即倒入84消毒液原液消毒5min，用無菌水洗滌3次，每次lmin，隨后倒入O.1 %的升汞消毒 5min,最后用無菌水洗漆4次，每次振蕩3_5min。
6、試管苗的馴化煉苗試管培養(yǎng)90d后，統(tǒng)計雜交種子發(fā)芽率為31. 60%，即獲得 316株無菌苗。將所得冬青屬雜交種無菌苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，露天培養(yǎng)2-3d，然后移入采用多菌靈(稀釋濃度2g/L)消毒的基質(zhì)中，組培苗上方使用帶孔PVC膜覆蓋保濕，馴化容器采用50孔穴盤，放在通風陰涼處培養(yǎng)25-30天，培養(yǎng)到第15d將PVC膜移除，換用折光率 75%的遮陽網(wǎng)；基質(zhì)成分為體積比1:1的泥炭土與珍珠巖。至2010年6月30日，統(tǒng)計出苗成活率為30. 40%，S卩1000粒雜交種子中共有304株幼苗。
方法實施例二
1、2010年7月I日，分別選取大別山冬青(雌株，1. dabieshan)和歐洲冬青(雄株，1. Nellie)的當年生頂稍作為插穗，選擇合適的扦插池進行扦插，扦插池大小約4m2，扦插密度5cmX 5cm，分別扦插兩個品種400株，處理方法1000mg/L IBA浸泡插穗基部50s。扦插后60d，在插穗葉面噴施低濃度鉀肥(350mg/LKH2P04)，同時制作硫酸紙為面板的方盒罩住整個扦插池。
2、種子采收2010年11月下旬，紅果皮開使變軟時，即果實開始成熟，11月30日， 將帶紅 果皮種子采摘。
3、果皮處理晾曬一周后，通過揉搓的方法去除果皮，獲得凈種子1000粒。
4、輻射處理將步驟(3)中得到的雜交種子，進行30Gy劑量鈷60輻射處理；
5、試管培養(yǎng)2010年12月30日，將步驟⑷中所得輻射誘變過的種子，進行消毒處理后接入試管培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)以打破種子休眠，采用玻璃瓶進行試管培養(yǎng)，每瓶接入 10粒，共接入100瓶。培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基并添加赤霉素濃度為3mg/L。另外，培養(yǎng)基中均含有瓊脂6. 5g/L、蔗糖30g/L，且pH值為6. O。培養(yǎng)時間60_90d，培養(yǎng)溫度為20-26°C，光照時間為10-16h/d，光照強度為1600-2000LX ;消毒過程為用清水沖洗干凈，用毛刷蘸少許洗衣粉將其表面刷洗干凈，再用自來水漂洗3-5次，然后用“安利”洗液震蕩漂洗30min，接著用自來水流水沖洗30min,于無菌操作臺上用75%乙醇消毒50_60s,無菌水沖洗I次,立即倒入84消毒液原液消毒5min，用無菌水洗滌3次，每次lmin，隨后倒入O.1 %的升汞消毒 5min,最后用無菌水洗漆4次，每次振蕩3_5min。
6、試管苗的馴化煉苗試管培養(yǎng)90d后，統(tǒng)計雜交種子發(fā)芽率為38. 80%，即獲得 388株無菌苗。將所得冬青屬雜交種無菌苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，露天培養(yǎng)2-3d，然后移入采用多菌靈(稀釋濃度2g/L)消毒的基質(zhì)中，組培苗上方使用帶孔PVC膜覆蓋保濕，馴化容器采用50孔穴盤，放在通風陰涼處培養(yǎng)25-30天，培養(yǎng)到第15d將PVC膜移除，換用折光率 75%的遮陽網(wǎng)；基質(zhì)成分為體積比1:1的泥炭土與珍珠巖。至2011年6月30日，統(tǒng)計出苗成活率為38. 10%，S卩1000粒雜交種子中共有381株幼苗 。
權(quán)利要求
1.一種冬青屬植物雜交育種的方法，其特征在于包括如下步驟(1)授粉結(jié)合扦插育苗進行授粉。分別選取冬青屬植物雌株和雄株的當年生頂稍作為插穗，選擇合適的扦插池進行扦插，扦插池大小約4m2，扦插密度5cmX5cm，分別扦插兩個品種400株，扦插時間7月上旬，處理方法1000mg/L IBA浸泡插穗基部50s。扦插后60d， 在插穗葉面噴施低濃度鉀肥(350mg/LKH2P04)，同時制作硫酸紙為面板的方盒罩住整個扦插池。(2)種子采收待果實成熟后，即紅果皮開使變軟時，將帶紅果皮種子采摘。(3)果皮處理晾曬一周后，通過揉搓的方法去除果皮，獲得凈種子。(4)輻射處理將步驟(3)中得到的雜交種子，進行30Gy劑量鈷60輻射處理；(5)試管培養(yǎng)將步驟(4)中所得輻射誘變過的種子，進行消毒處理后接入試管培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)以打破種子休眠，培養(yǎng)時間60-90d，培養(yǎng)溫度為20-26°C，光照時間為10_16h/ d，光照強度為1600-2000LX ；(6)試管苗的馴化煉苗將步驟(5)所得冬青屬雜交種無菌苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，露天培養(yǎng)2-3d，然后移入采用多菌靈(稀釋濃度2g/L)消毒的基質(zhì)中，組培苗上方使用帶孔PVC 膜覆蓋保濕，馴化容器采用50孔穴盤，放在通風陰涼處培養(yǎng)25-30天，培養(yǎng)到第15d將PVC 膜移除，換用折光率75%的遮陽網(wǎng)；所述基質(zhì)成分為體積比1:1的泥炭土與珍珠巖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述冬青屬植物雜交育種的方法，其特征在于步驟(5)中所述培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基并添加赤霉素濃度為3mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述冬青屬植物雜交育種的方法，其特征在于步驟(5)中進行消毒過程為用清水沖洗干凈，用毛刷蘸少許洗衣粉將其表面刷洗干凈，再用自來水漂洗3-5 次，然后用“安利”洗液震蕩漂洗30min，接著用自來水流水沖洗30min，于無菌操作臺上用 75%乙醇消毒50-60S，無菌水沖洗I次，立即倒入84消毒液原液消毒5min，用無菌水洗滌3 次，每次Imin,隨后倒入O.1 %的升萊消毒5min,最后用無菌水洗漆4次,每次振蕩3_5min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述冬青屬植物雜交育種的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基中均含有瓊脂6. 5g/L、蔗糖30g/L，且pH值為6. O。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種冬青屬植物雜交育種的方法，該方法包括以下步驟(1)授粉；(2)種子采收；(3)將種子果皮進行處理；(4)將處理后的種子進行鈷輻射誘變處理；(5)將輻射過的種子進行試管培養(yǎng)；(6)將試管苗馴化培養(yǎng)。采用該繁殖方法進行冬青屬植物的育種，方法簡單易行，可將育苗周期縮短至12個月。
文檔編號A01H4/00GK102986525SQ20121058511
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者李乃偉, 陸小清, 李云龍, 王傳永 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所