用于單子葉植物中的病原體控制的包衣組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于施用至能夠生長(zhǎng)出根和芽的單子葉植物的植物結(jié)構(gòu)的包衣組合物，其中所述包衣組合物包含有機(jī)載體物質(zhì)，以及具有對(duì)抗所述單子葉植物的至少一種或多種病原體的活性的一種或多種生物試劑。
【專利說(shuō)明】用于單子葉植物中的病原體控制的包衣組合物
[0001]本發(fā)明涉及包衣組合物，其包括有機(jī)組分和生物試劑，用于施用至能夠生長(zhǎng)出根和芽的單子葉植物的植物結(jié)構(gòu)，例如種子；包衣組合物在單子葉植物結(jié)構(gòu)(例如種子)上的應(yīng)用；制備這樣的包衣組合物的方法；和用這樣的包衣組合物包衣的單子葉植物結(jié)構(gòu)，例如種子。具體而言，本發(fā)明涉及單子葉植物結(jié)構(gòu)包衣組合物，其包含有機(jī)載體物質(zhì)和生物試劑，所述生物試劑選自對(duì)侵?jǐn)_單子葉植物的植物結(jié)構(gòu)(例如種子和鱗莖)的一種或多種植物病原體的具有活性的化學(xué)和生物試劑，所述植物病原體選自細(xì)菌性、真菌性和節(jié)肢動(dòng)物病原體。
[0002]每年都記錄到單子葉作物的重大損失，且該重大損失為由于病原體的植物侵?jǐn)_的結(jié)果，所述病原體，例如細(xì)菌、真菌和節(jié)肢動(dòng)物，能夠侵?jǐn)_不同發(fā)育階段例如種子階段的植物。盡管人們已經(jīng)設(shè)計(jì)出多種防御性措施來(lái)對(duì)抗這樣的侵?jǐn)_，但由病原體侵?jǐn)_導(dǎo)致的農(nóng)業(yè)損失仍然很高。這樣的防御性措施包括使用合成化學(xué)品；使用在植物中基因工程；和使用以包衣、噴霧劑、和洗滌劑的形式施用至單子葉種子的活生物試劑。 [0003]化學(xué)試劑形式的農(nóng)藥例如殺真菌劑、殺菌劑和殺節(jié)肢動(dòng)物劑，通常為殺昆蟲(chóng)劑和/或殺螨劑的形式，可以以土壤浸液、液體種子處理等的形式施用至單子葉作物。這樣的類型的化學(xué)處理傾向于不加選擇的，并且可不利地影響有益的細(xì)菌、真菌和節(jié)肢動(dòng)物以及這樣的處理所靶向的植物病原體。
[0004]例如，在將常規(guī)的農(nóng)藥用作為種子處理時(shí)，直接用農(nóng)藥將種子包衣或在存在無(wú)機(jī)載體的情況下將農(nóng)藥施用至種子。這樣的種子處理通常以液體的形式施用或作為濕的漿料施用并隨后將種子干燥。這樣的處理的主要目標(biāo)是提供針對(duì)攻擊種子的病原體，例如節(jié)肢動(dòng)物和/或種傳微生物和/或土傳微生物的保護(hù)。通常使用的高水平的化學(xué)品向環(huán)境引入化學(xué)負(fù)擔(dān)，其可能會(huì)導(dǎo)致生態(tài)學(xué)問(wèn)題。
[0005]在常規(guī)的種子包衣步驟中施用為化學(xué)試劑的生物試劑的一個(gè)問(wèn)題是化學(xué)試劑通常作為漿料施用，并且，這可能產(chǎn)生包衣的不均勻施用，由此，種子沒(méi)有被完全包衣或一定百分比的種子(高至20%，取決于種子的類型和包衣步驟)沒(méi)有得到實(shí)質(zhì)性地包衣。此外，種子包衣可能不均勻，并且，這導(dǎo)致種子包衣的物理學(xué)弱點(diǎn)，且包衣可能剝落。
[0006]當(dāng)使用選自可以常規(guī)地施用至植物結(jié)構(gòu)的有益的活細(xì)菌和真菌物種的生物試劑(例如作為孢子連同顆粒組合物的形式或隨后可以被干燥的液體組合物的形式的無(wú)機(jī)載體)時(shí)，產(chǎn)生的另一個(gè)問(wèn)題是施用的生物試劑迅速地喪失生存力。無(wú)意于受理論的限制，認(rèn)為當(dāng)種子或儲(chǔ)藏器官被干燥時(shí)，微生物環(huán)境改變且可觀察到施用的活生物試劑的生存力急劇下降，且?guī)缀跖c施用的組合物干燥同時(shí)發(fā)生。生物試劑的生存力的喪失通常與真菌或細(xì)菌孢子的分裂有關(guān)，這使得它們不能生存。
[0007]現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用有機(jī)載體物質(zhì)連同生物試劑，相對(duì)于常規(guī)地施用至單子葉種子的生物試劑的生存力，所述生物試劑在單子葉種子上的生存力得到改善。此外，植物結(jié)構(gòu)的包衣較不易于剝落。
[0008]本發(fā)明的目的是提供改善的包衣，其包含用于單子葉植物結(jié)構(gòu)(例如種子)的生物試劑。此外，本發(fā)明的目的是提供與常規(guī)的種子包衣相比較，使用較少的化學(xué)添加劑和/或較少量的化學(xué)添加劑的用于保護(hù)種子和/或幼小的植株免受病原體侵害的種子包衣。
[0009]本發(fā)明的這些目的和其他目的將通過(guò)以下說(shuō)明和實(shí)施例變得明顯。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明，提供了單子葉植物結(jié)構(gòu)包衣組合物，其中所述包衣組合物包含至少一種顆粒形式的有機(jī)載體物質(zhì)和具有對(duì)抗單子葉植物的一種或多種病原體的活性的一種或多種生物試劑，其中所述載體物質(zhì)選自具有> 50°攝氏度的熔點(diǎn)的蠟。
[0011]農(nóng)民的農(nóng)作物通常被發(fā)往很多不同的市場(chǎng)，例如源自谷物的食物，例如面包、早餐谷物、淀粉制備、釀造，和用于馴養(yǎng)牲畜(例如雞和牛)的飼料的生產(chǎn)中。對(duì)于本發(fā)明的目的，根據(jù)上下文，多?；蛞涣！胺N子”或一?！胺N子”被解釋為復(fù)數(shù)或單數(shù)。對(duì)于單數(shù)和復(fù)數(shù)的“種子”的引用可以互換使用，并且指可以向其施用本發(fā)明的組合物的種子，通常為有生存力的種子。本文中提供的單子葉種子指能夠萌發(fā)為至少對(duì)于單子葉植物種子而言典型的常規(guī)萌發(fā)水平的種子。單子葉種子包括可以用于種植單子葉植物的那些，所述單子葉植物例如稻屬種{Oryza spp.)的品種例如Crjza sativa (稻)、小麥屬種tJriticum spp.)的品種例如7: aes ti vum (小麥:春小麥和冬小麥品種)、黑麥屬種{Secale spp.)的品種例如cereale (黑麥)、燕麥屬種(Avena spp.)的品種例如sativa (燕麥)、玉米屬種{Zea spp.)的品種例如Zea mays (玉米[玉蜀黍])、高粱屬種{Sorghum spp.)的品種例如bicolour (高粱)、大麥屬種Qlordeum spp.)的品種例如//orofew?vuIgare (大麥)，和單子葉植物的雜交種，例如z Tri ticosecale (黑小麥:小麥和黑麥之間的雜交種)。
[0012]有機(jī)載體物質(zhì)選自可以被施用至單子葉種子的有機(jī)物質(zhì)，優(yōu)選地作為干粉末施用，其中所述粉末顆粒具有預(yù)先確定的體積平均直徑，或所述粉末顆粒以液體的形式存在，例如作為油質(zhì)的配制物或作為含水配制物。
[0013]通常，在本發(fā)明中有用的有機(jī)載體物質(zhì)以顆粒形式存在于本發(fā)明的組合物中，且所述組合物具有如本文所定義的一定大小的體積平均直徑。為了獲得適用于本發(fā)明的體積平均直徑的有機(jī)物質(zhì)的顆粒，可以在粗磨機(jī)中將例如1-5公斤的塊或板的形式的有機(jī)物質(zhì)打碎或粗磨成小的毫米大小的片(例如近似直徑為的大小,例如4mm-6mm)。隨后可以使毫米大小的片通過(guò)粉碎工具例如標(biāo)準(zhǔn)磨例如Apex粉碎磨，并研磨或粉碎成具有在IOOMm - 500Mm范圍內(nèi)的近似直徑，例如在250Mm - 300Mm范圍內(nèi)的近似直徑的顆粒。隨后可以將微米大小的經(jīng)粉碎的顆粒經(jīng)過(guò)微粉化裝置，例如AFG微粉化空氣磨，以獲得在本發(fā)明中有用的期望的VMD范圍例如15Mm - 20μπι的顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，用于獲得小顆粒的此類步驟是本領(lǐng)域中公知的。優(yōu)選地，本發(fā)明的干粉末組合物包含具有> 5μπι的體積平均直徑，例如 8 μ m、9 μ m、10 μ m、11 μ m、12 μ m、13 μ m、14 μ m、15 μ m,高至 40 μ m,或其中的任何數(shù)值的體積平均直徑的復(fù)合顆粒。如本文所述，所述復(fù)合顆粒的體積平均直徑通常為≥1OMm或≥12μm,并且可以處于10 μ m-200 μ m的范圍內(nèi)，并且可以具有處于其間任何位置的數(shù)值，例如≥10 μ m-100 μ m ;或≥10 μ m-40 μ m ;或≥10 μ m-30 μ m,或其間的任何期望的體積平均直徑數(shù)值。優(yōu)選地，本發(fā)明的干粉末組合物包含具有> 8 μ m的體積平均直徑的顆粒，例如 8 μ m、9 μ m、9.7 μ m、10 μ m、11 μ m、12 μ m、13 μ m、14 μ m、15 μ m 等,高至所選的任何體積平均直徑例如高至200 μ m,或其間的任何體積平均直徑例如40 μ m或30 μ m的體積平均直徑的顆粒。具有≥1Oμm的體積平均直徑的本發(fā)明的顆粒被認(rèn)為對(duì)人類的胸部的危害較少，并且不被認(rèn)為是變應(yīng)原的。[0014]在液體配制物中，預(yù)先確定的體積平均直徑的顆粒懸浮于其中的懸浮劑配制物中并且被施用至種子，隨后使用常規(guī)的干燥步驟將其干燥。當(dāng)以干燥粉末的形式將有機(jī)載體物質(zhì)施用至單子葉植物種子時(shí)，有機(jī)粉末物質(zhì)的顆?？梢跃哂斜疚乃龅捏w積平均直徑。所述可以加入到本發(fā)明的干燥粉末的“一種或多種生物試劑”包括用于對(duì)抗病原體例如節(jié)肢動(dòng)物例如昆蟲(chóng)、蜘蛛，或在適當(dāng)?shù)那闆r下，它們的幼蟲(chóng)、卵、或蛹的化學(xué)品；用于對(duì)抗細(xì)菌性病原體的化學(xué)品；和用于對(duì)抗真菌性病原體的化學(xué)品。此外，可以將有益的活生物試劑添加至在本發(fā)明中有用的這樣的干燥粉末，所述活生物試劑能夠靶向單子葉植物的細(xì)菌性病原體和/或靶向單子葉植物的真菌性病原體。所選的有益的活生物試劑的孢子，例如真菌分生孢子，或不形成孢子的真菌的菌絲或菌絲體或與分生孢子相似的結(jié)構(gòu)可以被添加至在本發(fā)明中有用的干燥粉末中。在本發(fā)明中有用的適合的有機(jī)載體物質(zhì)通常由具有> 50°C的熔點(diǎn)的蠟構(gòu)成，更優(yōu)選> 60°C，且最優(yōu)選地由具有> 70°C的熔點(diǎn)的硬蠟構(gòu)成。
[0015]在本發(fā)明中有用的天然蠟包括巴西棕櫚蠟、蜂蠟、白蠟、紫膠蠟、鯨蠟、十六酸蜂花酯、鯨蠟醇十六酸酯、小燭樹(shù)蠟、蓖麻蠟、小冠巴西棕蠟、羊毛蠟、甘蔗蠟、retamo蠟、米糠蠟
等ο
[0016]在本發(fā)明中有用的合成臘包括選自石臘、微晶臘、聚乙烯臘、Fischer-Tropsch臘、取代的酰胺蠟、聚合的α -烯烴等的適合的蠟。
[0017]在本發(fā)明中有用的無(wú)機(jī)臘包括褐煤臘(例如Lumax? Bayer)、地臘(ceresinwax)、地臘(ozocerite)、泥煤臘等。
[0018]適合的有機(jī)載體顆?？梢赃x自蠟，例如巴西棕櫚蠟、蜂蠟、褐煤蠟、白蠟、紫膠蠟、鯨蠟、十六酸蜂花酯、鯨蠟醇十六酸酯、小燭樹(shù)蠟、蓖麻蠟、小冠巴西棕蠟、羊毛蠟、甘蔗蠟、retamo蠟和米糠蠟，或其兩種或多種的混合物。這樣的蠟通常在熔化期間顯示出高的晶格能的焓。優(yōu)選地，所述有機(jī)載體物質(zhì)為巴西棕櫚蠟，其可以以液體的形式施用，通常以懸浮劑的形式施用，或更優(yōu)選地以作為分離顆粒的粉末形式施用。通常，在本發(fā)明中有用的顆粒具有如本文所述的體積平均直徑。
[0019]此外，在本發(fā)明的組合物中有用的有機(jī)載體顆?？梢园渌慕M分，例如選自以下的添加劑:uv阻斷劑例如β-胡蘿卜素或?qū)Π被郊姿?，著色劑例如熒光增白劑和可商?gòu)的著色劑例如食品著色劑，增塑劑例如甘油或豆油，抗微生物劑例如山梨酸鉀、硝酸鹽、亞硝酸鹽、環(huán)氧丙烷等，抗氧化劑例如維生素Ε、丁基化羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)和可存在的其他抗氧化劑，或其混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，對(duì)這些通常包括的添加劑的選擇將根據(jù)最終的目的和注意到的需要而進(jìn)行。
[0020]取決于設(shè)計(jì)，本發(fā)明的液體配制物可以配制為含水配制物或油質(zhì)配制物。含水配制物可以包括表面活性劑，其選自可商購(gòu)的表面活性劑，例如
Libscrt, Stfwet I--? Tween 80, Torpedo U? Wewmans 710, Fortune, Guard, Rhino, Bwpower 等。
[0021]油質(zhì)的配制物，即基于油的配制物，可以包含適用于本發(fā)明的任何油，其可以選自石油油料例如石蠟油，和植物油例如菜籽油、大豆油、葵花油、棕櫚油等。在本發(fā)明中有用的油配制物包含如本文所述的有機(jī)載體顆粒，且它們又可以與流平劑，例如親水性的沉淀的二氧化娃，例如 Sipernat 383 DS、Sipernat 320、EXP 4350 和 Sipernat D-17 等混合。這樣的自由流動(dòng)的試劑可以被分散于油中，例如用于消泡的目的。
[0022]本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，當(dāng)含水配制物或油配制物可以用于施用在本發(fā)明中有用的生物試劑的情況下，在完成包衣后，液體成分應(yīng)從經(jīng)包衣的植物結(jié)構(gòu)去除，例如通過(guò)使用常規(guī)的干燥方法而干燥去除，留下干燥顆粒形式的種子包衣組合物，其中所述種子包衣組合物由如本文所述的有機(jī)載體和至少一種同樣如本文所述的生物試劑構(gòu)成。
[0023]用于本發(fā)明的目的的生物試劑為可用于控制單子葉植物的植物病原體的種群的生物試劑，并且可以選自化學(xué)殺真菌劑、殺節(jié)肢動(dòng)物劑例如殺昆蟲(chóng)劑和殺蝴劑、殺菌劑，還可以選自能夠控制單子葉種子的一種或多種種傳病原體或土傳病原體的種群的活生物試劑。優(yōu)選地，通過(guò)使其不能繁殖的生物試劑或通過(guò)將其殺死而減少在單子葉種子上或緊鄰單子葉種子的土傳病原體的種群。為在單子葉種子上有用的化學(xué)品的在本發(fā)明中有用的生物試劑的實(shí)例包括最常用于儲(chǔ)藏的谷物種子的有效地對(duì)抗節(jié)肢動(dòng)物的那些化學(xué)試劑，所述節(jié)肢動(dòng)物例如米象{Sitophilus oryza);谷象{Sitophilus granaries)；谷蠹{Rhyzopertha dominica);麥蛾 kSitotroga cerealella);大谷盜{Tenebroidesmauritanicus) ； Ilf ^ {OryzaephiIus surinamensis) ；扁谷盜 {Cryptolestespusillus);面象蟲(chóng){Tribolium species);皮蠹(Jrogoderma species);綠豆象，多種豆和5[豆象鼻蟲(chóng)；印度谷螟蟲(chóng)(Plodia in terpunc tel la);和粉斑螟蛾 i^phestia cautella) 0在本發(fā)明中有用的適合的化學(xué)品的實(shí)例可以選自擬除蟲(chóng)菊酯，例如α-氯氰菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、[氰基_(3_苯氧基苯基)-甲基]-3_(2，2- 二溴乙烯基)_2，2- 二甲基-環(huán)丙烷-1-甲酸酯(溴氰菊酯)、和τ-氟胺氰菊酯；有機(jī)磷酸酯例如毒死蜱(二乙氧基-亞硫烷基_(3，5, 6- 二氣吡唳~2~基)氧基-1 {5}-勝)、馬拉硫憐(二乙基-1- 二甲氧基勝基-硫代基-硫烷基丁二酸酯)、蠅毒磷(3-氯-7- 二乙氧基膦基硫代基氧基-4-甲基香豆素)、和司替羅磷([(Ε)-2-氯-1-(2，4，5-三氯苯基)乙烯基]二甲基磷酸酯)；氨基甲酸酯例如阿米曲拉(N-(2，4-二甲基苯基)-N-[(2，4-二甲基苯基)亞氨基甲基]-N-甲基甲脒)；spinosans 例如多殺菌素(Dow Agrichemical,France) ; Y -氨基丁酸(GABA)抑制劑例如氟蟲(chóng)腈(5-氨基-1-[2，6-二氯-4-(三氟甲基)苯基]-4-(三氟甲基亞硫?；?吡唑-3-腈)；新煙堿類例如吡蟲(chóng)啉OV-[1-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-4，5-二氫咪唑-2-基]硝酰胺)；鄰氨基苯甲酰胺類，7-羥基-4’ -甲氧異黃酮類例如7-羥基-3- (4-甲氧基苯基)色酮；精油例如茶樹(shù)油，百里香油(也被稱為百里香酚)、香茅油、和薄荷醇，以及昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑例如甲氧蟲(chóng)酰肼OV-叔丁基τΤ-(3-甲氧基-鄰-甲苯?；?-3，5-二甲基苯甲酰餅)等。
[0024]可以用于本發(fā)明的包衣組合物的在本領(lǐng)域中通常被稱為“生物拮抗劑”的活生物試劑(也被稱為生物防治生物或生物防治劑)的實(shí)例包括假單胞菌屬種iPseudotnoimsspp.)例如用于大麥和燕麥和其他單子葉植物的綠針假單胞菌iP.Chlororaphis)(可獲自BioAgri AB,Uppsala, Sweden)、伯克氏菌屬種iBurkholderia spp.)例如用于大麥、高粱和小麥的Wisconsin型洋蔥伯克氏菌{β.cepaciatype Wisconsin)(作為“Deny”而獲自Stine Microbial Products, Memphis, USA ;和用于玉米的作為“Intercept” 而獲自 SoilTechnologies Corp., Fairfield, USA)的洋蔥伯克氏菌)。
[0025]本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，本發(fā)明的組合物還可以直接添加至其中將種植本文所定義的植物結(jié)構(gòu)的土壤或生長(zhǎng)介質(zhì)。這樣的組合物可以作為粉末添加并與土壤混合或使用常規(guī)的步驟作為液體懸浮劑施用。
[0026]對(duì)于本發(fā)明的目的，土傳病原體是能夠定殖于種子外皮的病原體和/或存活于土壤中并且能夠?qū)巫尤~種子起作用的病原體。這樣的土傳病原體通常為細(xì)菌和/或真菌。攻擊單子葉植物的土傳細(xì)菌和真菌病原體的實(shí)例包括絲核菌屬種{Rhizoctoniaspp.,例如對(duì)玉米；和稻；高粱；小麥；大麥；燕麥；和黑麥具有活性的立枯絲核菌{R.microsclerotia)),曲霉屬種{Aspergillus spp.)例如黃曲霉 C^.fIavus)和黑曲霉 Clniger)(例如對(duì)玉米具有活性)，腥黑粉菌屬種{Tilletia spp.)例如小麥腥黑粉菌{T.tritici)和光腥黑粉菌{T.1aevis)(例如對(duì)小麥具有活性)，指疫霉屬種{ScIerophthoraspp.)例如玉米褐條霜霉病菌{S.rayssiae)和禾生指梗霉(5: graminicola)(例如對(duì)玉米具有活性)，霜指霉屬種(Peronosclerospora spp.)例如玉米霜霉病菌iP.sorghi)和自發(fā)指霜霉(P.spontanea)(例如對(duì)玉米具有活性),腐霉屬種iPythium spp.)(例如對(duì)玉米；稻；高粱；小麥；大麥；燕麥；黑麥具有活性)，鐮刀菌屬種iFusarium spp.)(例如對(duì)玉米；稻；高粱；小麥；大麥；燕麥；黑麥具有活性)，麥角菌屬種{Claviersspp.)例如黑麥麥角菌{C.purpurea)(例如對(duì)黑麥；黑小麥；小麥；和大麥具有活性)、C.africana (例如對(duì)高粱具有活性)、C gigantean (例如對(duì)于米具有活性)，赤霉菌屬種iGibberella spp.)例如燕麥赤霉{G.avenacea)(例如對(duì)玉米具有活性)，莢殼伯克霍爾德氏菌{Burkholderia(例如對(duì)稻具有活性)，褐鞘假單胞菌iPsoudomorms
fuscovaginae)(例如對(duì)稻具有活性)，指疫霉屬種{ScIerophthora 5/7/7.)例如大孢指疫霉(5: macrospora)(例如對(duì)稻具有活性)，旋孢腔菌屬種{Cochliobolus spp.)例如宮部旋孢腔菌(C miyabeanus)(例如對(duì)稻具有活性)，鐮刀菌屬種iFusarium spp.)(針對(duì)稻、燕麥、小麥；玉米具有活性)等。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了蠟的有機(jī)載體顆粒在制備如本文所定義的包含如本文前述所定義的生物試劑的包衣組合物中的應(yīng)用。在本發(fā)明此方面的優(yōu)選方案中，所述包衣組合物為種子包衣組合物。在本發(fā)明的此方面的另一個(gè)優(yōu)選的方案中，所述包衣組合物為儲(chǔ)藏器官包衣組合物，其中所述儲(chǔ)藏器官選自塊莖、塊狀根、球莖、鱗莖、和根莖。所述有機(jī)載體顆粒選自天然蠟、合成蠟和無(wú)機(jī)蠟，其具有> 50°C的熔點(diǎn)，更優(yōu)選> 60°C，且最優(yōu)選地由具有> 70°C的熔點(diǎn)的硬蠟構(gòu)成。在本發(fā)明此方面中有用的適合的蠟可以選自蠟，例如巴西棕櫚蠟、蜂蠟、褐煤蠟、白蠟、紫膠蠟、鯨蠟、十六酸蜂花酯、鯨蠟醇十六酸酯、小燭樹(shù)臘、蓖麻臘、小冠巴西棕臘、羊毛臘、甘鹿臘、retamo臘和米糠臘,或其兩種或多種的混合物。優(yōu)選地，在本發(fā)明此方面中使用的種子包衣包括巴西棕櫚蠟作為有機(jī)載體。優(yōu)選地，在本發(fā)明的此方面中,所述有機(jī)載體顆粒具有> 5Mm的平均體積直徑，例如在> 8 μ m-200 μ m的范圍內(nèi)，如本文所述。
[0028]在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了蠟作為顆粒形式的有機(jī)載體在本發(fā)明所述的單子葉種子包衣組合物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的此方面中，所述有機(jī)載體顆粒選自天然蠟、合成蠟和無(wú)機(jī)蠟，其具有> 50°C的熔點(diǎn)，更優(yōu)選> 60°C，且最優(yōu)選地由具有> 70°C的熔點(diǎn)的硬蠟構(gòu)成。在本發(fā)明此方面中有用的適合的有機(jī)載體顆?？梢赃x自巴西棕櫚蠟、蜂蠟、褐煤蠟、白蠟、紫膠蠟、鯨蠟、十六酸蜂花酯、鯨蠟醇十六酸酯、小燭樹(shù)蠟、蓖麻蠟、小冠巴西棕蠟、羊毛臘、甘鹿臘、retamo臘和米糠臘,或其兩種或多種的混合物。優(yōu)選地，在本發(fā)明此方面中有用的蠟載體顆粒包含巴西棕櫚蠟的有機(jī)載體顆粒。仍優(yōu)選地，在本發(fā)明此方面中有用的有機(jī)載體顆粒具有> 8Mm的平均體積直徑，例如在> 10 μ m-200 μ m的范圍內(nèi)。
[0029]在本發(fā)明的第四個(gè) 方面，提供了制備如本文所述的種子包衣組合物的方法，其包括:
(1)選擇有機(jī)載體物質(zhì)，其中所述載體物質(zhì)選自具有>50°攝氏度的熔點(diǎn)的蠟；
(2)將所述有機(jī)載體物質(zhì)粉碎為期望的平均體積直徑>5μπι的顆粒，例如平均體積直徑在≥8 μ m-200 μ m的范圍內(nèi)的顆粒；和
(3)將生物試劑添加至步驟2)的產(chǎn)品顆粒。
[0030]在本發(fā)明此方面中有用的生物試劑選自化學(xué)試劑，其為殺節(jié)肢動(dòng)物劑例如殺昆蟲(chóng)劑或殺螨劑或其混合物，或化學(xué)殺真菌劑，或真菌物種和/或細(xì)菌物種或其一種或多種的混合物。適合的真菌物種和細(xì)菌物種是已知的，且可以選自用于小麥的木霉屬種{Trichoderma spp.)例如哈茨木霉(Jrichoderma,和用于小麥的桿菌屬種(Bacillus spp.)例如枯草桿菌(Bacillus ,和假單胞菌屬 iPseudomonas')物種，例如用于小麥的突光假單胞菌(P.fIuorescens)和用于大麥和燕麥和其他單子葉植物的綠針假單胞菌 0°.GWororapAi1S)(可獲自 BioAgri AB, Uppsala, Sweden),伯克氏菌屬種iBurkholderia spp.)例如用于大麥、高粱和小麥的Wisconsin型洋蔥伯克氏菌(作為“Deny”可獲自Stine Microbial Products, Memphis, USA ;和用于玉米的作為“ Intercept” 而獲自 Soil Technologies Corp., Fairfield, USA 的洋蔥伯克氏菌)等。
[0031]適合的殺真菌劑為已知用于單子葉種子處理，用于玉米的包括咯菌腈[4-(2, 2- 二氟-1，3-苯并二氧代-4-基)-W-吡咯-3-腈]、精甲霜靈DV-(甲氧基乙?；?-#-(2，6-二甲苯基)-D-丙氨酸甲酯]、嘧菌酯[(覽)-2-{2-[6-(2-氰基苯氧基)嘧P? ~4~基氧基]苯基} -3-甲氧基丙烯酸甲酯]、克菌丹[(3a/P, IaS) ~2~[_ ( 二氯甲基)硫燒基]-3a，4，7，7a-四氫-\?_ 異吲哚-1，3 (2/7) - 二酮]、萎銹靈[5，6- 二氫-2-甲基-1，4-氧硫雜環(huán)己二烯-3-甲酰苯胺]、代森錳[亞乙基雙(二硫代氨基甲酸)錳(聚合的)]、甲霜靈DV-(甲氧基乙?；?-N- (2，6- 二甲苯基)-DL-丙氨酸甲酯]、惡霜靈[2-甲氧基-N- (2-氧代-1，3-噁唑烷-3-基)乙酰-2’，6’ -二甲苯胺]、PCNB [五氯硝基苯]和福美雙[二硫化四甲基秋蘭姆或二硫化雙(二甲基硫代氨基甲酰)];用于稻的包括萎銹靈[5，6-二氫-2-甲基-1，4-氧硫雜環(huán)己二烯-3-甲酰苯胺]、代森錳鋅[亞乙基雙(二硫代氨基甲酸)錳(聚合的)與鋅鹽的復(fù)合物]、甲霜靈[#-(甲氧基乙?；?-#_(2，6-二甲苯基)-DL-丙氨酸甲酯]、和PCNB [五氯硝基苯]和福美雙[二硫化四甲基秋蘭姆或二硫化雙(二甲基硫代氨基甲酰)];用于高粱的包括克菌丹[(3a/?，7a?)-2-[(三氯甲基)硫烷基]_3a，4，7，7a_四氫-1//-異吲哚-1，3(2//)-二酮]、代森錳鋅[亞乙基雙(二硫代氨基甲酸)錳(聚合的)與鋅鹽的復(fù)合物]、甲霜靈[#-(甲氧基乙?；?-#_(2，6-二甲苯基)-DL-丙氨酸甲酯]、惡霜靈[2-甲氧基-#-(2-氧代-1，3-噁唑烷-3-基)乙酰-2’，6’ - 二甲苯胺]、和PCNB [五氯硝基苯];用于小麥的包括克菌丹[(3aR，7aS)-2-[(三氯甲基)硫烷基]_3a，4，7，7a-四氫-1H-異吲哚-1，3(2H)- 二酮]、噻苯達(dá)唑(也被稱為TBZ)[2-(噻唑-4-基)苯并咪唑或2-(1,3-噻唑-4-基)苯并咪唑、甲霜靈[N-(甲氧基乙?；?-N- (2，6- 二甲苯基)-DL-丙氨酸甲酯]、惡霜靈[2-甲氧基-N- (2-氧代-1，3-噁唑烷-3-基)乙酰_2’，6’_ 二甲苯胺]和三唑醇[(1忍，2忍;1忍，257?)-1-(4-氯苯氧基)-3，3-二甲基-1-(設(shè)-1，2，4-三唑-1-基)丁-2-醇];和用于大麥、燕麥和黑麥的包括抑霉唑0^)-1-(0-烯丙氧基-2，4-二氯苯乙基)咪唑或(忍)-1-(2,4-二氯苯基)-2-咪唑-1-基乙基烯丙基醚、代森錳鋅[亞乙基雙(二硫代氨基甲酸)錳(聚合的)與鋅鹽的復(fù)合物]、代森錳[亞乙基雙(二硫代氨基甲酸)錳(聚合的)]、PCNB [五氯硝基苯]、福美雙[二硫化四甲基秋蘭姆或二硫化雙(二甲基硫代氨基甲酰)]、三唑醇(I/P51，2RS] \RS, 2SR) -1- (4-氣苯氧基)-3，3- _2，4- 二P坐-1-基)丁 -2-醇、和苯醚甲環(huán)唑 3-氯-4- [ (2RS, ARS\ 2RS, ASR) ~4~ 甲基-2- (1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)-1, 3- 二氧戍環(huán)-2-基]苯基-4-氯苯基醚。
[0032]適合的殺昆蟲(chóng)劑也為已知用于單子葉作物作為種子處理，例如用于稻和玉米的噻蟲(chóng)嗪[07)-3-(2-氯-1，3-噻唑-5-基甲基)-5-甲基-1，3，5-噁二嗪-4-亞基(硝基)胺];用于玉米和谷類作物(黑麥、小麥、燕麥和黑小麥)的吡蟲(chóng)啉[⑵-1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基咪唑烷-2-亞基胺]、滅蟲(chóng)威[4-甲基硫代-3，5- 二甲苯基甲基氨基甲酸酯]、和硫雙威[{WZ, 12EZ)-?,, 7,9, 13-四甲基-5，11-二氧雜-2，8，14-三硫雜-4，7,9, 12-四氮雜十五烷-3，12-二烯-6，10-二酮]，和用于玉米和谷類(黑麥、燕麥、小麥和黑小麥)的噻蟲(chóng)胺[(E)-1-(2-氯-1，3-噻唑-5-基甲基)-3-甲基-2-硝基胍]，用于小麥的氯氰菊酯[(MS') - α -氰基-3-苯氧基芐基(1忍，3忍;1忍，357?) -3- (2，2- 二氯乙烯基)-2，2- 二甲基環(huán)-丙烷甲酸酯或- α -氰基-3-苯氧基芐基(L/P5.)-順式-反式-3-(2, 2_ 二氯乙烯基)-2，2- 二甲基環(huán)丙烷甲酸酯]。
[0033]在本發(fā)明此方面中，所述有機(jī)載體物質(zhì)可以選自蠟，例如選自本文前述的那些蠟。適合的蠟可以選自蠟，例如巴西棕櫚蠟、蜂蠟、褐煤蠟、白蠟、紫膠蠟、鯨蠟、十六酸蜂花酯、鯨臘醇十六酸酯、小燭樹(shù)臘、蓖麻臘、小冠巴西棕臘、羊毛臘、甘鹿臘、retamo臘和米糠臘或其兩種或多種的混合物。優(yōu)選地，在本發(fā)明此方面中有用的蠟載體顆粒包含巴西棕櫚蠟、小冠巴西棕蠟、和米糠蠟或其兩種或多種的混合物的干燥顆粒。優(yōu)選地，所選擇的載體物質(zhì)為巴西棕櫚蠟。
[0034]在本發(fā)明的另 一個(gè)方面，提供了通過(guò)如本文所述的方法制備的種子包衣組合物。
[0035]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了如本文所述的包衣組合物，其用于單子葉種子。
[0036]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了使用包衣組合物包衣單子葉種子的方法，所述包衣組合物包含有機(jī)載體物質(zhì)和對(duì)一種或多種真菌性病原體、細(xì)菌性病原體和節(jié)肢動(dòng)物病原體的生物拮抗劑，以限制由所述病原體對(duì)所述單子葉種子造成的傷害，所述方法包括將生物拮抗劑添加至有機(jī)載體物質(zhì)，其中所述有機(jī)載體物質(zhì)為干燥顆粒的形式，將所述兩種組分混合在一起，并以干燥顆粒的形式將所得組合物施用至單子葉種子。因此，在本發(fā)明中有用的種子包衣組合物以干燥顆粒的形式施用。自然地，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，所述有機(jī)載體物質(zhì)還可以包含添加的色素、增塑劑，和如本文所述的其他次要組分。在可選方案中，可以如本文所述以液體形式施用種子包衣，并且隨后將種子干燥，在種子上時(shí)留下干燥顆粒形式的包衣組合物。然而，為了易于施用和保持低的生產(chǎn)成本，優(yōu)選以干燥的顆粒形式施用包衣組合物。在本發(fā)明此方面中的有機(jī)載體物質(zhì)可以選自巴西棕櫚蠟、蜂蠟、褐煤蠟、白蠟、紫膠蠟、鯨蠟、十六酸蜂花酯、鯨蠟醇十六酸酯、小燭樹(shù)蠟、蓖麻蠟、小冠巴西棕蠟、羊毛蠟、甘蔗蠟、retamo蠟和米糠蠟或其兩種或多種的混合物。優(yōu)選地，所述有機(jī)載體物質(zhì)為干燥顆粒形式的巴西棕櫚蠟。
[0037]本發(fā)明此方面中的處理組合物包括一種或多種生物試劑，其選自如本文前述的化學(xué)殺節(jié)肢動(dòng)物劑例如殺昆蟲(chóng)劑和殺蝴劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑和活生物試劑。
[0038]以下為說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例。應(yīng)理解所述實(shí)施例不以任何方式解釋為限制本發(fā)明。
[0039]圖1:小麥上的木霉屬孢子負(fù)荷。
[0040]實(shí)施例部分
通過(guò)使用拮抗劑的實(shí)例，哈茨木霉{Trichoderma Aarzia/H/?)、突光假單胞菌和枯草桿菌[可得自英國(guó)國(guó)家菌種保藏中心(UKNCC)],控制小麥{Triticum aes ti vum)的鏈格孢屬種(AltGrrmriei sp.)[可得自英國(guó)國(guó)家菌種保藏中心(UKNCC)]。
[0041]鏈格孢葉枯病 癥狀
最低的葉總是最先顯示出感染的跡象，其逐漸地傳播至較高的葉。所述疾病首先使其外觀呈現(xiàn)不規(guī)則地分散于葉上的小的、橢圓形的、變色的損傷。隨著它們擴(kuò)大并變?yōu)樯詈稚粱疑念伾?，斑點(diǎn)變得不規(guī)則。隨著疾病的發(fā)展，若干斑點(diǎn)變得愈加靠近并且覆蓋大片的葉面積，最終導(dǎo)致整片葉的死亡。有時(shí)在斑點(diǎn)周圍看到淺黃色邊緣區(qū)域。在嚴(yán)重侵襲的情況下，葉鞘、芒、和穎片也被感染。
[0042]在此階段，在潮濕的條件下，所述真菌的黑色粉末狀孢子覆蓋所述損傷。這些孢子通過(guò)風(fēng)傳播，并且導(dǎo)致健康的葉和植物上的疾病。所述疾病在溫暖和濕潤(rùn)的條件下傳播極為迅速。被嚴(yán)重感染的田地顯示出燒焦的外觀。
[0043]常規(guī)的種子處理的缺陷
i)有限的給藥能力-可以施用的農(nóng)藥的量受到實(shí)際將有多少粘在種子上的限制。
[0044]ii)有限的保護(hù)持續(xù)時(shí)間-由于施用至種子的生物試劑(例如化學(xué)試劑)的量相對(duì)較少，隨著植物生長(zhǎng)的生物試劑的稀釋，以及生物試劑的破壞，所述持續(xù)時(shí)間通常較短。
[0045]iii)經(jīng)處理的種子的保存期限有限-由于經(jīng)處理的種子的保存期限可能是有限的，因此生產(chǎn)過(guò)量的經(jīng)處理的種子是不期望的。對(duì)于谷物，多余的經(jīng)處理的種子無(wú)法出售。
[0046]在施用至種子的是休眠的微生物的這種情況下，通過(guò)包含作為用于生物試劑的載體的巴西棕櫚蠟顆粒，所有的這三種限制都可以被克服或顯著降低。在有利的條件下，所述微生物在發(fā)育的種子或幼苗的外部生長(zhǎng)和定殖。生物試劑可有助于減少種子腐爛、幼苗疾病或根腐病。
[0047]進(jìn)行以下測(cè)試以檢驗(yàn)包含巴西棕櫚蠟顆粒的潛在作用。
[0048]階段1-分離培養(yǎng)物 1.培養(yǎng)物保持
使用指定有登記號(hào)的各分離物的繼代培養(yǎng)物保持紀(jì)錄。與所述繼代培養(yǎng)物有關(guān)的所有的平板和載玻片都用登記號(hào)標(biāo)記。
[0049]此外，由各原始培養(yǎng)物制備永久性的乳酚(LP)裝片，并歸檔以用于參照目的。
[0050]在經(jīng)過(guò)活的宿主繼代之前，發(fā)生不多于三代的繼代培養(yǎng)，并重新分離以保持所述生物的適合度。
[0051]在4°C下，將繼代培養(yǎng)物在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)上儲(chǔ)藏以備將來(lái)使用。
[0052]對(duì)各分離物指定登記號(hào)，并用此號(hào)碼標(biāo)記繼代培養(yǎng)物。
[0053]提取DNA用于同一性驗(yàn)證，并在_20°C下儲(chǔ)藏。在_20°C下將純培養(yǎng)物的參照樣品儲(chǔ)藏于甘油上。一旦完 成實(shí)驗(yàn)，重復(fù)培養(yǎng)物的DNA鑒定以確認(rèn)所述生物在工作期間未發(fā)生突變。[0054]2.致病劑的培養(yǎng)物
病原真菌從患病的組織至純培養(yǎng)物的分離是鑒定和描述疾病的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。它是證實(shí)先前未遇到的生物的病原性的必需步驟。
[0055]技術(shù)通常涉及:
a.表面滅菌處理；
b.使用適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施，涂布(可在選擇性培養(yǎng)基上涂布)患病組織的樣品；
c.繼代培養(yǎng)以得到純培養(yǎng)物。
[0056]3.培養(yǎng)物的純化 將人工接種植物的小的消毒的根片在水瓊脂上培養(yǎng)。最常出現(xiàn)的真菌菌落很可能是目標(biāo)病原體。在被感染的植物組織中還可能存在多種腐生生物，并且它們可能與主要病原體一起生長(zhǎng)入培養(yǎng)基中。常規(guī)的表面滅菌由以下組成:使用0.1%的次氯酸鈉(NaOCl或有時(shí)被稱為“NaCIO”)溶液擦拭組織(或?qū)⒔M織浸入)，隨后用無(wú)菌的蒸餾水漂洗。為了獲得病原體的純培養(yǎng)物，使用火焰烤過(guò)的環(huán)或手術(shù)刀從菌落的生長(zhǎng)邊緣獲取小樣品，并且劃線在預(yù)傾倒的PDA平板的表面上。包含的30mg/l的氯霉素(抑制細(xì)菌的抗微生物劑)降低了細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。隨著劃線條斑在瓊脂上發(fā)展，分離真菌孢子，直到獲得單獨(dú)的孢子，將由所述孢子生長(zhǎng)出單獨(dú)的菌落。
[0057]重復(fù)此步驟直至獲得純培養(yǎng)物。
[0058]4.單獨(dú)孢子的分離
單獨(dú)孢子的分離對(duì)于研究病原變異性是重要的。將孢子的接種物置于包含10 ml無(wú)菌水的管中。將此孢子懸浮液延著薄的自來(lái)水瓊脂培養(yǎng)基的表面上的標(biāo)記線進(jìn)行劃線，并在22°C下溫育。在24小時(shí)溫育后，使用立體顯微鏡選擇萌發(fā)的孢子，并每次將一個(gè)孢子轉(zhuǎn)移至另一個(gè)瓊脂平板。
[0059]5.用于微觀檢驗(yàn)和參照的載玻片制備
病原體的鑒定:可以將組織切片或表面刮擦并隨后在水/乳酚中裝片。將宏觀見(jiàn)到的真菌結(jié)構(gòu)可以與待檢驗(yàn)和鑒定的宿主組織分離。鑒定取決于孢子形成，并因此被感染的物質(zhì)將在檢驗(yàn)之前在潮濕的環(huán)境中溫育過(guò)夜，以促進(jìn)孢子形成。將棉染藍(lán)染色添加至乳酚，以突出真菌結(jié)構(gòu)。將樣品置于載玻片上的一滴satin中，并且通過(guò)經(jīng)過(guò)小火幾秒而溫和加熱，之后在乳酚中裝片。
[0060]為了容易鑒定，可以使用以下方法將整個(gè)封裝切片清透和染色。
[0061]通過(guò)在管中的乳酚中將其加熱直至清透(多至20分鐘)而不沸騰，使得葉盤清透。通過(guò)在載玻片上在乳酚中的0.5%棉染藍(lán)中加熱5-10分鐘而染色。在乳酚中徹底漂洗，并在乳酚中裝片。
[0062]6.生長(zhǎng)和培養(yǎng)基
在一系列溫度:13.5°C、18°C和22.5°C下評(píng)價(jià)繼代培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和萌發(fā)。檢驗(yàn)一系列的培養(yǎng)基的適合性。盡管PDA通常適于大多數(shù)的真菌物種，但已發(fā)現(xiàn)使用低營(yíng)養(yǎng)瓊脂例如自來(lái)水瓊脂降低增殖性生長(zhǎng)(prolific growth),并且可以促進(jìn)孢子形成。因此,在評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中包括PDA、自來(lái)水瓊脂、和來(lái)自文獻(xiàn)的選擇性培養(yǎng)基Czapek’ s Dox瓊脂(Dawson (1962)Saboutaudia 1.214-219)。
[0063]使用經(jīng)火焰烤的木塞穿孔器從活躍生長(zhǎng)的培養(yǎng)物的邊緣切下5_直徑的盤。將其顛倒置于預(yù)先傾倒的培養(yǎng)基平板的中心。對(duì)于每個(gè)培養(yǎng)基類型和溫度制備5個(gè)重復(fù)(總計(jì)45個(gè)平板)。對(duì)各溫育器中的平板施以完全的隨機(jī)化。對(duì)平板進(jìn)行觀察，直至一個(gè)培養(yǎng)物成功地完全覆蓋任一種培養(yǎng)基中的平板。此時(shí)進(jìn)行以下測(cè)量:真菌菌落直徑、顏色和邊緣。此外，記錄孢子形成的水平。
[0064]使用經(jīng)火焰烤的木塞穿孔器從各平板切下五個(gè)5mm的盤，并懸浮于20ml的蒸餾水(+0.05% Tween 20?)中。隨后將樣品超聲2分鐘，以釋放孢子，并隨后漩渦以有助于均一的孢子懸浮液的形成。使用標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)數(shù)方法，使用改善的Neubauer血球計(jì)評(píng)價(jià)樣品的孢子濃度。
[0065]計(jì)算各培養(yǎng)基類型的平均值，并且應(yīng)用ANOVA以檢驗(yàn)結(jié)果的顯著差異。
[0066]階段2 -體外研究:
1.篩選微生物和巴西棕櫚蠟以測(cè)定相互作用
為了解釋觀察到的作用，對(duì)比巴西棕櫚蠟，篩選微生物、病原體和拮抗劑，以鑒定任何僅載體的作用。這將使得能夠測(cè)定處理效果以及由于使用拮抗劑以及巴西棕櫚蠟顆粒的應(yīng)用而導(dǎo)致發(fā)生的任何協(xié)同作用。
[0067]a.基于上述實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)，使用合適的培養(yǎng)基的平板。使用高壓滅菌器將經(jīng)空氣研磨的巴西棕櫚蠟滅菌，并隨后使用雙刀片磨研磨，產(chǎn)生具有近似VMD的顆粒。隨后將經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基冷卻至50°C (熔融階段)。隨后將巴西棕櫚蠟引入培養(yǎng)基。測(cè)試兩種濃度的巴西棕櫚蠟:lg/l和10g/l。使 用經(jīng)火焰烤的木塞穿孔器從活躍生長(zhǎng)的培養(yǎng)物的邊緣切下5_直徑的盤。將其顛倒置于預(yù)先傾倒的培養(yǎng)基/巴西棕櫚蠟平板的中心。對(duì)于每個(gè)濃度制備5個(gè)重復(fù)，并在生長(zhǎng)/孢子形成 的最優(yōu)溫度(如先前的實(shí)驗(yàn)中所測(cè)定)溫育。使用獲自上述生長(zhǎng)和培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，將生長(zhǎng)速率和特性與對(duì)照相比較。
[0068]使用ANOVA分析差異。
[0069]b.將病原體的盤和拮抗劑與不同的巴西棕櫚蠟處理劑一起粉化，并且置于適合的培養(yǎng)基上。為能夠進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)，要求巴西棕櫚蠟顆粒不含微生物。對(duì)經(jīng)處理的生物和未經(jīng)處理的生物的生長(zhǎng)進(jìn)行比較。
[0070]2.研究針對(duì)病原體的拮抗作用
1.拮抗劑對(duì)于鏈格孢屬種菌絲體的生存力的作用(體外測(cè)試I)
在PDA或預(yù)先確定的培養(yǎng)基上，在雙培養(yǎng)物測(cè)試中測(cè)試對(duì)抗病原真菌的所有拮抗性分離物。將鏈格孢屬種和待測(cè)試的拮抗劑分離物的瓊脂栓在9cm瓊脂平板上以7cm間隔排列。在13.5°C、18°C和22.58°C下溫育7天之后，評(píng)價(jià)抑制區(qū)域和重疊區(qū)域。當(dāng)拮抗劑在鏈格孢屬種的菌絲體上生長(zhǎng)的情況下，通過(guò)顯微鏡(IOOx)研究?jī)烧咧g的菌絲相互作用區(qū)域。將對(duì)于鏈格孢屬種的菌絲體沒(méi)有通過(guò)顯微鏡可見(jiàn)的作用的真菌菌株排除出進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。此外，在第一次接觸后5天，通過(guò)將菌絲體盤轉(zhuǎn)移至水瓊脂平板上測(cè)試相互作用區(qū)域中鏈格孢屬種的生存力。當(dāng)通過(guò)顯微鏡(IOOx)觀察到典型的菌絲生長(zhǎng)時(shí)，將鏈格孢屬種的菌絲體評(píng)價(jià)為有生存力。將各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)使用3個(gè)樣品。
[0071]i1.拮抗劑對(duì)于體外產(chǎn)生的鏈格孢屬種的菌核的萌發(fā)的作用(體外測(cè)試II)
將均一大小的鏈格孢屬種的菌核置于真菌拮抗劑的6天齡的培養(yǎng)物上(PDA，200C )。在20°C下溫育14、28和35天之后，將每個(gè)重復(fù)(每個(gè)拮抗劑三個(gè)重復(fù))的8個(gè)菌核自瓊脂平板轉(zhuǎn)移至水瓊脂。在光學(xué)顯微鏡下(IOOx)對(duì)由這些菌核的菌絲體生長(zhǎng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。[0072]3.病原性的確認(rèn)
實(shí)施Koch法則的步驟(Koch 1890，設(shè)計(jì)用于建立致病微生物和疾病之間的致病關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn))。
[0073]a)描述由患病的作物植物表現(xiàn)的癥狀。
[0074]b)分離可疑的病原體一相同的培養(yǎng)物應(yīng)由具有相似癥狀的植物分離。
[0075]c)獲得純培養(yǎng)物并使用其接種健康的植物物質(zhì)。
[0076]d)觀察由接種的植物表現(xiàn)的癥狀一癥狀應(yīng)與初始地在作物植物中觀察到的那些癥狀相同。
[0077]e)自新患病的物質(zhì)再次分離病原體。培養(yǎng)物應(yīng)與初始的純化的培養(yǎng)物相同。
[0078]1.間接施用-植物
使用健康的植物-可以使用由純瓊脂培養(yǎng)物或由燒瓶中生長(zhǎng)的培養(yǎng)物制備的孢子懸浮液直接地對(duì)土壤進(jìn)行接種。可以在萌芽后添加真菌孢子或細(xì)菌懸浮液，使得根系統(tǒng)被懸浮液浸透。隨后觀察植物7天并記錄癥狀。實(shí)施Koch法則以確認(rèn)癥狀與接種的病原體有關(guān)。
[0079]i1.直接施用-種子
用于制備孢子懸浮液的 接種物在包含無(wú)菌種子的水瓊脂上生長(zhǎng)。從菌落刮出真菌孢子和菌絲或細(xì)菌孢子和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)物并轉(zhuǎn)移至無(wú)菌水。隨后將此孢子懸浮液施用至種子并混合以確保均一的分布。隨后將種子:
?置于潮濕的濾紙上并在最優(yōu)生長(zhǎng)溫度下溫育5天。
[0080].播種在熱滅菌的盆栽堆肥中，并在最優(yōu)生長(zhǎng)溫度下在種子箱中溫育7天。
[0081]記錄兩組實(shí)驗(yàn)的癥狀表現(xiàn)和萌發(fā)，并實(shí)施Koch法則。
[0082]4.巴西棕櫚蠟/拮抗劑協(xié)同定位分析
使用孢子分離器制備孢子的干燥粉末配制物。使用除濕器和二氧化硅小球?qū)⑴渲莆锏暮拷档椭恋陀?%。使用Neubauer血球計(jì)和標(biāo)準(zhǔn)化的計(jì)數(shù)方法測(cè)定孢子濃度。
[0083]在Boyes微粉化方法中的空氣研磨中的步驟(用于具有約25Mm和75Mm的VMD的巴西棕櫚蠟顆粒)
1.首先，根據(jù)制造商的說(shuō)明，在KT Handling Ltd 04型粗磨機(jī)(序列號(hào)729/C)中將2kg巴西棕櫚臘塊粗磨成約4-6mm的片。
[0084]2.隨后，使粗磨的片經(jīng)過(guò)Apex Construction Ltd 314.2型號(hào)粉碎磨(序列號(hào)A21306)并且將大小進(jìn)一步減小至250-300um的范圍。
[0085]3.隨后，根據(jù)制造商的說(shuō)明，使粉碎的顆粒經(jīng)過(guò)Hosokawa Micron Ltd Alpine100AFG噴射磨(序列號(hào)168092)，將磨設(shè)定在適合的速度(對(duì)于具有15Mm的VMD的顆粒，速度為8000rpm或?qū)τ诰哂?5Mm的VMD的顆粒，速度為2500rpm)，以及0.03巴的正系統(tǒng)壓力。
[0086]4.將研磨空氣保持在6巴，將系統(tǒng)沖洗空氣流和分級(jí)輪間隙沖洗空氣均設(shè)定為最小0.5巴且不高于0.75巴，清潔空氣過(guò)濾器將記錄不多于5巴的δ，以獲得所需的具有15um或75Mm的VMD的最終粒度。
[0087]在三個(gè)負(fù)荷(見(jiàn)下文)下將Entostat與小麥種子組合。
[0088]對(duì)分別具有15Mm和75Mm的VMD的兩種大小的巴西棕櫚蠟顆粒，以兩種不同比例(1:3,2:2)與孢子配制物組合進(jìn)行檢驗(yàn)。使用電子顯微照相術(shù)分析巴西棕櫚蠟/孢子混合物的樣品，以確定協(xié)同定位作用。記錄觀察到的任何變化。
[0089]此外，將提及的兩種大小的巴西棕櫚蠟均與菌絲體的均質(zhì)化樣品混合，并如上所述進(jìn)行檢驗(yàn)。
[0090]5.巴西棕櫚蠟顆粒負(fù)荷
通過(guò)使用顯微照相術(shù)(定性)和熒光分析(定量)估算粘附到種子的巴西棕櫚蠟顆粒。使用分別具有15Mm和75Mm的VMD的兩種大小的巴西棕櫚蠟顆粒(含1% glo-brite)。四種組合:兩種比例的巴西棕櫚蠟/孢子配制物，以及一種菌絲體和賦形劑對(duì)照(僅巴西棕櫚蠟)，產(chǎn)生總計(jì)八種處理。將處理施用至IOg種子并重復(fù)三次。由各次重復(fù)獲取三個(gè)子樣品，并將平均值用于分析。
[0091]對(duì)于熒光分析，將三個(gè)Ig樣品各自添加至5ml乙醇，并超聲處理以有助于巴西棕櫚臘顆粒自種子的釋放。使用Perkin Elmer L55突光計(jì)(Perkin Elmer, Ma, USA)分析樣品。使用ANOVA進(jìn)行處理之間的差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0092]作物物種之間的種子大小和結(jié)構(gòu)顯著地不同，且這影響施用比率和方法。通過(guò)將種子和巴西棕櫚蠟配制物在置于Wheaton輥上的圓筒中翻轉(zhuǎn)5分鐘而獲得均質(zhì)的混合物，所述圓筒通過(guò)包含具有角度的內(nèi)部輪葉而適于產(chǎn)生側(cè)向混合/翻轉(zhuǎn)。
[0093]階段3-體內(nèi):
將鏈格孢屬種以及最成功的拮抗劑模型用于一系列的體內(nèi)試驗(yàn)?；驹O(shè)計(jì)是溫度為主區(qū)因素(13.5°C、18°C和22.5°C )且巴西棕櫚蠟/拮抗劑比例(3種處理:2x孢子，Ix菌絲體)為子區(qū)因素的裂區(qū)試驗(yàn)。使用上述方法制備各處理的4個(gè)均質(zhì)混合物，并且這些表示重復(fù)次數(shù)。
[0094]處理:
1)施用比率1- 7.5 X IO6分生孢子kg—1
2)施用比率2- 7.5 X IO8分生孢子kg—1
3)施用3-菌絲體
4)對(duì)照1-賦形劑對(duì)照(僅巴西棕櫚蠟)
5)對(duì)照2-無(wú)處理
混合物(真正的重復(fù)):A、B、C、D 各混合物的子樣品:ct、β、Y 根據(jù)隨機(jī)的區(qū)組設(shè)計(jì)安排混合物和處理。
[0095]盆栽研究
各溫度(生長(zhǎng)室)包含60個(gè)植物盆栽。
[0096]根據(jù)供應(yīng)商的建議播種經(jīng)處理的種子。在用IOml鏈格孢屬種孢子懸浮液接種之前，將土壤/堆肥(1:1 John Innes 2號(hào)和泥炭堆肥)熱滅菌，并在播種前充分混合。
[0097]將植物置于生長(zhǎng)室中21天的時(shí)間，并在萌芽后每48小時(shí)觀察癥狀表現(xiàn)。通過(guò)毛細(xì)作用墊施水，每天兩次。
[0098]在21天后，將植物自其盆中移出，并進(jìn)行以下評(píng)價(jià)測(cè)量:
?%萌發(fā)
?%萌芽前立枯病?%萌芽后立枯病 ?根重 ?芽重。
[0099]此外，基于損傷等級(jí)評(píng)價(jià)癥狀表現(xiàn)。
[0100]對(duì)每種處理，使用AN0VA，比較由子樣品α、β、y獲得的測(cè)量的平均值。
[0101]自顯示癥狀的5個(gè)植物獲得樣品并實(shí)施Koch法則以確認(rèn)致病生物(通過(guò)與主培養(yǎng)物的參考載玻片進(jìn)行比較)。
[0102]重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。[0103]第二實(shí)施例
使用咯菌腈，通過(guò)種子處理的方式控制小麥上的禾生腐霉菌(Pythium graminicola)[英國(guó)國(guó)家菌種保藏中心(UKNCC)]。
[0104]實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-如上述實(shí)施例1中的盆栽研究
使用銅平底鍋熔化巴西棕櫚蠟。在冷卻過(guò)程中，添加巴西棕櫚蠟質(zhì)量的1%的咯菌腈。在如上所述，允許此混合物固化，隨后，通過(guò)空氣磨刨削和加工，不同之處在于將速度設(shè)定在6000 rpm,以制備具有25Mm的VMD的顆粒。
[0105]用于盆栽研究的處理_
對(duì)照1-賦形劑對(duì)照(僅巴西棕櫚蠟)
對(duì)照2 -無(wú)處理
處理1-每kg種子IOg 1%咯菌腈巴西棕櫚蠟 處理2 -每kg種子3.2g 1%咯菌腈巴西棕櫚蠟 評(píng)價(jià)和分析與先前的盆栽研究相同。
[0106]第三實(shí)施例 涉及:
使用噻蟲(chóng)嗪，通過(guò)種子處理的方式控制在小麥上掠食的小麥金針蟲(chóng)種iAgriotesmancus spp.,鞘翅目:叩甲科)，或小麥線蟲(chóng)(St頭蟲(chóng)的幼蟲(chóng)形式)。
[0107]早季線蟲(chóng)損害由被挖空的種子組成，其中，幼蟲(chóng)已在萌發(fā)期間進(jìn)入。幼苗植物也可能受到鉆入在土壤線下的植物的幼蟲(chóng)的損傷或被其殺死。偶爾地，線蟲(chóng)鉆入較大的植物的莖，并掘入幾英寸，但損害不顯著。
[0108]實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-如上述盆栽研究
使用銅平底鍋熔化巴西棕櫚蠟。在冷卻過(guò)程中，添加巴西棕櫚蠟質(zhì)量的1%的噻蟲(chóng)嗪。在如上所述，允許此混合物固化，隨后，通過(guò)磨刨削和加工(速度設(shè)定在6000 rpm)，以制備具有25Mm的VMD的顆粒。
[0109]用于盆栽研究的處理_
對(duì)照1-賦形劑對(duì)照(僅巴西棕櫚蠟)
對(duì)照2 -無(wú)處理
處理1-每kg種子4.2g 1%噻蟲(chóng)嗪巴西棕櫚蠟 處理2 -每kg種子1.3g 1%噻蟲(chóng)嗪巴西棕櫚蠟
在使用盆栽土填充之前，將空盆用尼龍網(wǎng)篩物質(zhì)內(nèi)襯。建立線框，并且將尼龍網(wǎng)篩在框上打結(jié)，以提供籠形的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，其設(shè)計(jì)使得昆蟲(chóng)不能逃離處理的區(qū)域。[0110]使種子萌發(fā)三天，隨后將5只第三齡的幼蟲(chóng)添加至各盆的土壤表面，隨后將篩籠重新密封。
[0111]觀察進(jìn)行21天。
[0112]評(píng)價(jià)植物的:
?%萌發(fā) ?損害 ?根重 ?芽重。
[0113]按照實(shí)施例1中詳述的步驟，以檢驗(yàn)哈茨木霉[英國(guó)國(guó)家菌種保藏中心(UKNCC)]、熒光假單胞菌[UKNCC]和枯草桿菌[UKNCC]對(duì)稻的真菌性病原體鐮刀菌屬種的拮抗作用。
[0114]按照實(shí)施例1中詳述的步驟，以檢驗(yàn)哈茨木霉[英國(guó)國(guó)家菌種保藏中心(UKNCC)]、熒光假單胞菌[UKNCC]和枯草桿菌[UKNCC]對(duì)高粱的真菌性病原體禾生炭疽菌{ColIetotrichum graminicola)白勺手吉抗作用。
[0115]按照實(shí)施例2中詳述的步驟，以檢驗(yàn)甲霜靈對(duì)稻的真菌性病原體腐霉屬種的作用。
[0116]按照實(shí)施例2中詳述的步驟，以檢驗(yàn)咪鮮胺對(duì)高粱的真菌性病原體絲核菌屬種的作用。
`[0117]按照實(shí)施例3中詳述的步驟，以檢驗(yàn)噻蟲(chóng)嗪對(duì)高粱的害蟲(chóng)，蠐螬(長(zhǎng)毛食葉然金龜，Phyllophaga crini te)的作用。
[0118]按照實(shí)施例3中詳述的步驟，以檢驗(yàn)吡蟲(chóng)啉/ β -氟氯氰菊酯對(duì)稻的害蟲(chóng)，稻種搖蚊(林間環(huán)足搖蚊，sylvestris)的作用。
[0119]使用包含木霉屬種和巴西棕櫚蠟顆粒的種子包衣抑制小麥中真菌性疾病的致病劑
木霉屬種(子囊菌門(Ascomycota))作為生物防治劑在抗植物病原體的防御中的潛能是已知的。
[0120]木霉菌絲能夠穿透其他真菌的菌絲并且自其中抽取營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致對(duì)宿主的抑制并最終導(dǎo)致其死亡。木霉顯示出快速的菌絲體生長(zhǎng)并且能夠與其他真菌競(jìng)逐養(yǎng)分。
[0121]有多種作為作物保護(hù)產(chǎn)品銷售的可商購(gòu)的木霉配制物。這些配制物通常作為可濕的粉末配制物供應(yīng)并且作為浸液(drench)施用至種植區(qū)域。此施用形式的缺陷在于必須處理整個(gè)種植區(qū)域，而需要所述處理的是緊緊圍繞種子或植物的區(qū)域。遞送至此區(qū)域的分生孢子的數(shù)量越大，它們能夠給予的控制水平越高。因此，在木霉的應(yīng)用中，能夠?qū)⒆懔康姆稚咦舆f送至要求的區(qū)域的靶向施用系統(tǒng)提供優(yōu)于常規(guī)施用的明顯優(yōu)勢(shì)。
[0122]實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo):為評(píng)價(jià)Entostat作為種子包衣技術(shù)用于遞送有益的微生物的潛在應(yīng)用
方法
在Boyes微粉化方法中的空氣研磨中的步驟(用于具有約IOMm的VMD的巴西棕櫚蠟顆粒)。
[0123]1.首先，根據(jù)制造商的說(shuō)明，在KT Handling Ltd 04型粗磨機(jī)(序列號(hào)729/C)中將2kg巴西棕櫚蠟塊粗磨成約4-6mm的片。[0124]2.隨后，使粗磨的片經(jīng)過(guò)Apex Construction Ltd 314.2型號(hào)粉碎磨(序列號(hào)A21306)并且將大小進(jìn)一步減小至250-300um的范圍。
[0125]3.隨后，根據(jù)制造商的說(shuō)明，使粉碎的顆粒經(jīng)過(guò)Hosokawa Micron Ltd Alpine100AFG噴射磨(序列號(hào)168092)，將磨設(shè)定在12500rpm的速度，和0.03巴的正系統(tǒng)壓力。
[0126]4.將研磨空氣保持在6巴，將系統(tǒng)沖洗空氣流和分級(jí)輪間隙沖洗空氣均設(shè)定為最小0.5巴且不多于0.75巴，清潔空氣過(guò)濾器將記錄不多于5巴的δ，以獲得具有9.7Mfli的VMD的最終粒度。
[0127]在三個(gè)負(fù)荷(見(jiàn)下文)下將Entostat與小麥種子組合。
[0128]1.基線數(shù)據(jù):種子包衣技術(shù) 1.1種子包衣。使用具有9.7Mm的VMD的巴西棕櫚蠟顆粒，將具有95%的萌發(fā)百分比的哈茨木霉(包含7.75xl09菌落形成單位g'Sylvan Bio, Loches, France)施用至小麥(品種:Hereward, Herbiseeds, Twyford, UK)。基于獲自文獻(xiàn)的信息,將目標(biāo)負(fù)荷設(shè)定為每粒種子IO5個(gè)分生孢子。
[0129]以不同的比例將巴西棕櫚蠟顆粒與干燥的分生孢子粉混合，并將0.01g (0.2質(zhì)量％)直接施用至干種子，每個(gè)濃度5g種子。對(duì)于每個(gè)濃度，將10粒種子的四個(gè)批次用于評(píng)價(jià)分生孢子負(fù)荷。
[0130]使用的分生孢子與巴西棕櫚蠟的比例為:
100%分生抱子、50%分生抱子、25%分生抱子和9%分生抱子，在各情況下剩余部分由巴西棕櫚蠟顆粒構(gòu)成。
[0131]1.2 計(jì)數(shù)。通過(guò)使用血球計(jì)(Improved Neubauer, Hawksley, Lancing, UK)進(jìn)行直接計(jì)數(shù)以測(cè)定種子的分生孢子負(fù)荷。
[0132]茲#數(shù):懸浮液的制備。
[0133]通常在水載體中配制繁殖體，但具有疏水細(xì)胞壁的那些(例如木霉)不易懸浮于水中。為了使疏水的繁殖體均一地懸浮于水中，需要超聲處理和/或使用機(jī)械懸浮方法。使用微型杵進(jìn)行繁殖體的機(jī)械懸浮提供了分生孢子在水中的良好懸浮液，而沒(méi)有導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞的損害。表面活性劑也可有助于繁殖體的懸浮(0.05%的TWeen20)。為了使疏水的分生孢子懸浮，將收獲的分生孢子置于1.5ml微量離心管中，將~0.5ml無(wú)菌水添加至所述管，將微型杵插入管中，并將分生孢子物質(zhì)輕輕地用微型杵手動(dòng)攪拌(防止分生孢子逸入空氣中)。微型件與電動(dòng)機(jī)(例如Kontes, Argos球團(tuán)研磨棒電動(dòng)機(jī))連接并且將懸浮液劇烈攪拌，同時(shí)將所述研磨棒上下移動(dòng)和左右移動(dòng)約30秒。由于血球計(jì)方法不能分辨有生存力的和無(wú)生存力的繁殖體，因此需要確定孢子生存力，由此可以在有生存力的繁殖體的基礎(chǔ)上準(zhǔn)備劑量。
[0134]對(duì)每個(gè)處理，在4個(gè)批次的種子上進(jìn)行種子洗滌和木霉負(fù)荷的計(jì)數(shù)。通過(guò)置入Eppendorf管中的Iml無(wú)菌0.05% Tween20 (或替代物-相似的非離子表面活性劑/分散劑)中，并且漩渦30秒以自種子表面除去分生孢子，從而將接種物從種子洗去。隨后將樣品超聲處理兩分鐘以破壞任何分生孢子簇。將獲得的計(jì)數(shù)用于計(jì)算由各種處理包衣的種子的平均分生孢子負(fù)荷。將使用100%分生孢子粉獲得的結(jié)果用作基準(zhǔn)，且將與其作比較的分生孢子/巴西棕櫚蠟組合粉末作為對(duì)負(fù)荷的效率的測(cè)定。
[0135]通過(guò)在木霉特異性培養(yǎng)基(TSM)上的稀釋鋪板實(shí)現(xiàn)對(duì)分生孢子生存力的確認(rèn)(參見(jiàn)下文)。設(shè)定稀釋系列，并自所述系列接種平板，一式兩份。7天后進(jìn)行菌落形成單位(CFU)計(jì)數(shù)，允許對(duì)種子上的接種物水平進(jìn)行定量。此外，將新鮮的未使用的分生孢子鋪板，以提供種子施用之前和之后的對(duì)照。
[0136]還測(cè)量萌發(fā)百分比。通過(guò)將ΙΟΟμΙ中的約IO6個(gè)分生孢子鋪展在9cm皮式培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上而獲得令人滿意的分生孢子密度。在25°C下將分生孢子在黑暗中溫育5天，并且，隨后使用乳酚將待觀察的區(qū)域固定。使用倒置的復(fù)式顯微鏡的相差顯微術(shù)使得能夠?qū)Ψ稚咦舆M(jìn)行充分檢驗(yàn)。
[0137]如果芽管的長(zhǎng)度為所研究的繁殖體的直徑的兩倍，則認(rèn)為分生孢子是有生存力的。在任意選擇的視野中或在平行的橫斷面中，對(duì)使用目鏡測(cè)微計(jì)限定的萌發(fā)的和未萌發(fā)的分生孢子的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。最少計(jì)數(shù)300個(gè)分生孢子以提供準(zhǔn)確的估計(jì)。期望測(cè)定在一式兩份的培養(yǎng)物上和相同平板上不同的位置處的繁殖體的生存力。
[0138]這允許對(duì)種子包衣技術(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)以對(duì)于每種包衣方法，在種子上獲得相似水平的木霉負(fù)荷。
[0139]1.3種子萌發(fā)。在9cm皮式培養(yǎng)皿中，將來(lái)自每種處理的一個(gè)批次的種子(5粒種子)置于種子測(cè)試紙(Whatman 181)上。將培養(yǎng)皿用Parafilm密封并在20°C下保持7_10天，并測(cè)定萌發(fā)率。使用未處理的種子重復(fù)此步驟。
[0140]制備木霉選擇培養(yǎng)基(改良自Williams, Clarkson等,2003),如下所述:
對(duì)于1000ml
基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分:
0.2g MgSO43.0g 葡萄糖
0.9g K2HPO40.15g 玫瑰紅
0.15g KCl20g 瓊脂
1.0g NH4NO3950ml 蒸餾水 基礎(chǔ)培養(yǎng)基加工
在IL Erlenmeyer燒瓶中將液體成分與除瓊脂以外的全部固體成分混合。添加20g瓊脂并攪拌或震蕩。用棉絮塞住并用金屬箔覆蓋。高壓蒸汽滅菌。
[0141]滅菌培養(yǎng)基(每升)
0.25g結(jié)晶的氯霉素1.2ml霜霉威(Previcur)
0.2g五氯硝基苯50ml無(wú)菌蒸懼水
0.2g克菌丹 種子重量
用作種子批次的均勻性的測(cè)量。對(duì)8個(gè)重復(fù)的25粒種子進(jìn)行稱量，并且記錄變異系數(shù)(CV)。此系數(shù)應(yīng)不超過(guò)5的值。如果其超過(guò)5，則重復(fù)所述步驟，且將所有16個(gè)樣品的平均值用于計(jì)算每克的種子數(shù)。
【權(quán)利要求】
1.單子葉植物結(jié)構(gòu)包衣組合物,其中所述包衣組合物包含至少一種顆粒形式的有機(jī)載體物質(zhì)和具有對(duì)抗單子葉植物的至少一種或多種病原體的活性的一種或多種生物試劑，其中所述載體物質(zhì)選自具有>50°攝氏度的熔點(diǎn)的蠟。
2.如權(quán)利要求1所述的包衣組合物，其中所述植物結(jié)構(gòu)為單子葉植物的種子的植物結(jié)構(gòu)。
3.如權(quán)利要求1所述的包衣組合物，其中所述蠟的顆粒具有>5Mffl的體積平均直徑。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的包衣組合物，其中所述顆粒具有在8-200Mm的范圍內(nèi)的體積平均直徑。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的包衣組合物，其中所述生物試劑選自化學(xué)試劑和活生物試劑；或其兩種或多種的混合物。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的包衣組合物，其中所述生物試劑選自化學(xué)殺真菌齊Li，殺節(jié)肢動(dòng)物劑包括殺昆蟲(chóng)劑和殺蝴劑，殺細(xì)菌劑；或其兩種或多種的混合物。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的包衣組合物，其中所述生物試劑選自殺真菌劑、殺昆蟲(chóng)劑和殺螨劑。
8.如權(quán)利要求7所述的包衣組合物，其中所述殺真菌劑選自克菌丹[(3a/P, IaS) _2_ [( 二氣甲基)硫烷基]_3a, 4, 7, 7a~ 四氧 ~\H~ 異 Π 引噪-1，3 (2Η) - _.酮]、萎銹靈[5，6-二氫-2-甲基-1，4-氧硫雜環(huán)己二烯-3-甲酰苯胺]、代森錳[亞乙基雙(二硫代氨基甲酸)錳(聚合的)]、甲霜靈[Ν_(甲氧基乙?；?-Ν-(2，6-二甲苯基)-DL-丙氨酸甲酯]、惡霜靈[2-甲氧基-N-(2-氧代-1，3-噁唑烷-3-基)乙酰-2’，6’-二甲苯胺]、PCNB [五氯硝基苯]和福美雙[二硫化四甲基秋蘭姆或二硫化雙(二甲基硫代氨基甲酰)];代森錳鋅[亞乙基雙(二硫代氨基甲酸)錳(聚合的)與鋅鹽的復(fù)合物];噻苯達(dá)唑(也被稱為TBZ) [2-(噻唑-4-基)苯并咪唑或2-(1,3-噻唑-4-基)苯并咪唑；和用于大麥、燕麥和黑麥的抑霉唑0^)-1-(0-烯丙氧基-2，4-二氯苯乙基)咪唑或(忍)-1-(2，4-二氯苯基)-2-咪唑-1-基乙基烯丙基醚、三唑醇(I/P51，2RS] \RS, 2SR) -1- (4-氣苯氧基)-3，3- _2，4- 二P坐-1-基)丁 -2-醇、和苯醚甲環(huán)唑 3-氯-4- [ (2RS, ARS\ 2RS, ASR) ~4~ 甲基-2- (1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)-1，3- 二氧戊環(huán)-2-基]苯基-4-氯苯基醚；或其兩種或多種的混合物。
9.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的包衣組合物，其中所述殺昆蟲(chóng)劑選自噻蟲(chóng)嗪[(57)-3-(2-氯-1,3-噻唑-5-基甲基)-5-甲基-1,3，5-噁二嗪-4-亞基(硝基)胺]、吡蟲(chóng)啉[⑶-1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基咪唑烷-2-亞基胺]、滅蟲(chóng)威[4-甲基硫基-3，5-二甲苯基甲基氨基甲酸酯]，和硫雙威[(3力Z，12￡Z)-3, 7,9, 13-四甲基-5，11-二氧雜-2，8，14-三硫雜-4，7，9，12-四氮雜十五烷-3，12- 二烯-6，10- 二酮]，和噻蟲(chóng)胺[(￡')-1-(2-氯-1，3-噻唑-5-基甲基)-3-甲基-2-硝基胍];或其兩種或多種的混合物。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的包衣組合物，其中所述有機(jī)載體物質(zhì)選自具有>50°C的熔化溫度的臘，例如巴西棕櫚臘、蜂蠟、褐煤臘、白蠟、紫膠臘、鯨臘、小燭樹(shù)臘、蓖麻蠟、小冠巴西棕蠟、和米糠蠟；或其兩種或多種的混合物。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的包衣組合物，其中所述顆粒為巴西棕櫚蠟顆粒。
12.如前述權(quán)利要 求中任一項(xiàng)所述的包衣組合物，其中所述病原體為細(xì)菌物種、真菌物種或節(jié)肢動(dòng)物物種。
13.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的包衣組合物，其中所述活生物試劑為至少一種生物拮抗劑，其以定位于所述顆粒的表面上和/或所述種子的表面上的細(xì)菌孢子和/或真菌孢子的形式存在。
14.有機(jī)載體在制備包括如權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)定義的生物試劑的如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的包衣組合物中的應(yīng)用，其中所述有機(jī)載體由蠟的顆粒構(gòu)成。
15.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中所述包衣組合物為種子包衣組合物。
16.如權(quán)利要求142或權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其中所述有機(jī)載體顆粒選自天然蠟、合成蠟和無(wú)機(jī)蠟，其具有> 50°C的熔點(diǎn)，更優(yōu)選> 60°C的熔點(diǎn)，且最優(yōu)選地由具有> 70°C的熔點(diǎn)的硬蠟構(gòu)成。
17.如權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述有機(jī)載體顆粒選自巴西棕櫚蠟、蜂蠟、褐煤蠟、白蠟、紫膠蠟、鯨蠟、十六酸蜂花酯、鯨蠟醇十六酸酯、小燭樹(shù)蠟、蓖麻蠟、小冠巴西棕臘、羊毛臘、甘鹿臘、retamo臘和米糠臘,或其兩種或多種的混合物。
18.如權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述單子葉植物結(jié)構(gòu)包衣組合物包含巴西棕櫚蠟的顆粒。
19.如權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述有機(jī)載體顆粒具有>5Mm的平均體積直徑，例如在> 8 μ m-200 μ m的范圍內(nèi)的平均體積直徑。
20.蠟作為干燥顆粒的形式的有機(jī)載體在如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的單子葉種子包衣組合物中的應(yīng)用。
21.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中所述有機(jī)載體顆粒選自天然蠟、合成蠟和無(wú)機(jī)蠟，其具有> 50°C的熔點(diǎn)，優(yōu)選> 60°C的熔點(diǎn)，且優(yōu)選地由具有> 70°C的熔點(diǎn)的硬蠟構(gòu)成。
22.如權(quán)利要求20或21所述的應(yīng)用，其中所述有機(jī)載體顆粒選自巴西棕櫚蠟、蜂蠟、褐煤蠟、白蠟、紫膠蠟、鯨蠟、十六酸蜂花酯、鯨蠟醇十六酸酯、小燭樹(shù)蠟、蓖麻蠟、小冠巴西棕蠟、羊毛蠟、甘蔗蠟、retamo蠟和米糠蠟，或其兩種或多種的混合物。
23.如權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述種子包衣組合物包含巴西棕櫚蠟的有機(jī)載體顆粒。
24.如權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述有機(jī)載體顆粒具有>5Mm的平均體積直徑，例如在> 8 μ m-200 μ m的范圍內(nèi)的平均體積直徑。
25.制備如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的單子葉種子包衣組合物的方法，包括: 1)選擇有機(jī)載體物質(zhì)，其中所述載體物質(zhì)選自具有≥50°攝氏度的熔點(diǎn)的蠟； 2)將所述有機(jī)載體物質(zhì)粉碎為期望的平均體積直徑≥5μm的顆粒，例如平均體積直徑在≥8 μ m-200 μ m的范圍內(nèi)的顆粒；和 3)將生物試劑添加至步驟2)的產(chǎn)品顆粒。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述有機(jī)載體物質(zhì)選自巴西棕櫚蠟、蜂蠟、褐煤臘、白臘、紫膠臘、餘臘、小燭樹(shù)臘、昆麻臘、小誕巴西掠臘、和米糖臘，或其兩種或多種的混合物。
27.如權(quán)利要求25或權(quán)利要求26所述的方法，其中所述物質(zhì)為巴西棕櫚蠟。
28.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的包衣組合物，其用于單子葉植物結(jié)構(gòu)上。
29.如權(quán)利要求28所述的包衣組合物，其中所述單子葉植物結(jié)構(gòu)是單子葉種子，其選自稻屬種，例如稻{Oryza sa tiva);小麥屬種，例如小麥{T.aestivum,小麥:春小麥和冬小麥品種)；黑麥屬種，例如黑麥{Secede cereale);燕麥屬種，例如燕麥(Avenasativa);玉米屬種，例如玉米、Zea mays,[玉蜀黍]);高粱屬種，例如高粱{Sorghumbicolor);大麥屬種，例如大麥Q(jìng)lordeum vuIgare);和單子葉植物的雜交種,例如黑小麥Cr Triticosecale)。
30. 使用包衣組合物包衣單子葉種子的方法，所述包衣組合物包含有機(jī)載體物質(zhì)和生物試劑，所述生物試劑是一種或多種真菌性病原體、細(xì)菌性病原體和節(jié)肢動(dòng)物的生物拮抗劑，所述方法包括將所述生物試劑添加至有機(jī)載體物質(zhì)，其中所述有機(jī)載體物質(zhì)為干燥顆粒的形式，將所述兩種組分混合在一起，并將所得組合物施用至單子葉種子。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述包衣組合物包含以干燥顆粒的形式施用至單子葉植物種子的顆粒組合物。
32.如權(quán)利要求30或31所述的方法，其中所述包衣組合物包含有機(jī)載體物質(zhì)，所述有機(jī)載體物質(zhì)包含顆粒形式的有機(jī)蠟，其選自巴西棕櫚蠟、蜂蠟、褐煤蠟、白蠟、紫膠蠟、鯨蠟、小燭樹(shù)蠟、蓖麻蠟、小冠巴西棕蠟、和米糠蠟；或其兩種或多種的混合物。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述包衣組合物包括一種或多種生物試劑，其選自殺昆蟲(chóng)劑和殺蝴劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑和活生物試劑。
34.如權(quán)利要求30-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有機(jī)載體物質(zhì)為巴西棕櫚蠟。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述生物試劑選自殺真菌劑和殺昆蟲(chóng)劑。
36.包含如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的包衣組合物的單子葉植物結(jié)構(gòu)。
37.如權(quán)利要求36所述的單子葉植物結(jié)構(gòu)，其為種子。
38.如權(quán)利要求36或權(quán)利要求37所述的單子葉植物結(jié)構(gòu)，其為包衣的種子。
【文檔編號(hào)】A01N51/00GK103619166SQ201280030101
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月20日
【發(fā)明者】N.H.H.杰索普 申請(qǐng)人:?？怂魅颂赜邢薰?br>