雙生病毒復制抑制劑的制作方法
【專利摘要】復制抑制劑，其是針對屬于雙生病毒科的玉米線條病毒屬的病毒的復制抑制劑，所述復制抑制劑含有鋅指蛋白并且可以抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，所述鋅指蛋白可以與該病毒的莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自該全長DNA的1處或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合。
【專利說明】雙生病毒復制抑制劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及對植物病毒有效的感染防除方法。更具體地，涉及針對作為植物病毒的雙生病毒中所包含的屬于玉米線條病毒屬的植物病毒的復制抑制劑和對屬于玉米線條病毒屬的植物病毒所致的感染具有抗性的植物等。
【背景技術(shù)】
[0002]鋅指與螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序、亮氨酸拉鏈基序同為DNA結(jié)合基序之一，其是在氨基末端側(cè)具有2個半胱氨酸和在羧基末端側(cè)具有2個組氨酸，且在這些殘基上配位有鋅(Zn)的立體結(jié)構(gòu)。鋅指對DNA具有非常強的結(jié)合力，因此提出了利用該基序與DNA牢固結(jié)合的人工DNA結(jié)合蛋白((以下，本說明書中有時稱為“AZP”)，并報道了使用識別密碼表(Nondegenerate Recognition Code Table (非簡并識別密碼表))設(shè)計的 AZP,該 AZP 可以識別特定的堿基序列(日本特表2004-519211號公報；Biochemistry, 41，pp.7074-7081，2002)。
[0003]一個鋅指基序可識別并結(jié)合3bp或4bp，通過用肽接頭來連接鋅指可以調(diào)節(jié)想要特異性結(jié)合的堿基序列的長度。鋅指基序的第4號識別堿基序列是反義鏈，并與下一鋅指基序的第I號識別喊基序列重置，因此N個鋒指基序識別并結(jié)合3N+lbp的喊基序列(參照圖1)。
[0004]報道了使用該AZP可以實現(xiàn)對植物DNA病毒的感染防除(J.Virology, 79，pp.2614-2619，2005)。該出版物中報道了，在擬南芥中AZO對植物DNA病毒甜菜嚴重曲頂病毒(Beet Severe Curly Top Virus, BSCTV)的感染防除效果，該方法采用通過AZP來抑制病毒復制起始所需的復制蛋白(Itep)與復制起點上的Rep結(jié)合位點(同向重復序列)結(jié)合的方法，是基于復制起點的同向重復序列設(shè)計具有比R印高的DNA結(jié)合能力的AZP來抑制病毒復制的方法。然而，在用AZP阻斷R印的同向重復序列的該方法中，復制起點具有病毒固有的堿基序列，因而為了與各種植物病毒對應(yīng)，存在必須使用各自不同的AZP的問題。從該觀點出發(fā)，人們希望提供利用單一的AZP實現(xiàn)針對多種植物病毒的感染防除效果的方法。
[0005]另一方面，在中華人民共和國的陜西省漢中發(fā)現(xiàn)了引起小麥萎縮、斑葉、黃化和出穂降低的病害，作為其原因病毒，鑒定為小麥萎縮病病毒(Wheat Dwarf Virus: WDV、以下有時將該病毒簡稱為 “WDV”) (Zhiwu BaohudSSN: 0529-1542)，Vol.34，N0.2，pp.17-21，2008)。還明確了漢中分離所得數(shù)種WDV的基因組結(jié)構(gòu)是相同的，屬于雙生病毒(Geminiviridae)科的玉米線條病毒(Masterevirus)。關(guān)于 W)V,除了 Plant Pathology,57, pp.838-841, 2008; Plant Pathology, 58, pp.1161-1169，2009 之外，還有 Virusgenes, 34，pp0.359-366，2007 等報道。
[0006]雙生病毒是 感染植物、具有I個或2個單鏈環(huán)狀DNA的病毒的總稱，雖然包括多種植物病毒，但大致分類為菜豆金色花葉病毒(Begomovirus)屬、番茄偽曲頂病毒(Topocuvirus)屬、甜菜曲頂病毒(Curtovirus)屬、和玉米線條病毒屬4種。作為屬于菜豆金色花葉病毒(Begomovirus)屬的病毒，除了番爺黃化曲葉病毒(TomatoYellowLeaf CurlVirus: TYLCV)之外，可舉出例如:馬鈴薯黃色花葉病毒(Potato Yellow Mosaic Virus:PYMV)、菜豆金色花葉病毒(Bean Golden Mosaic Virus: BGMV)等；作為屬于玉米線條病毒屬的病毒，除了上述WDV之外,還可舉出:玉米條斑病毒(Maize Streak Virus: MSV)、芒屬條斑病毒(Miscanthas Streak Virus: MiSV)、煙草黃萎病毒(Tobacco Yellow Dwarf Virus:TYDV)、虎尾草條點花葉病毒(Chloris Straite Mosaic Virus: CSMV)等。此外,屬于番爺偽曲頂病毒屬的病毒可舉出番爺偽曲頂病毒(Tomato Pseudo-curly Top Virus: TPCTV),屬于甜菜曲頂病毒屬的病毒可舉出甜菜輕型曲頂病毒(Beet Mild Curly Top Virus: BMCTV)(參照圖3)。
[0007]雙生病毒一旦進入到植物內(nèi)，首先通過植物內(nèi)源性的因子形成雙鏈環(huán)狀DNA。接著，來自病毒的復制蛋白(Rep)與位于基因間區(qū)(IR)的莖環(huán)上游的Rep結(jié)合位點結(jié)合。Rep是具有多功能的蛋白質(zhì)，與Rep結(jié)合位點結(jié)合，在莖環(huán)的環(huán)部分的9個堿基序列中加入切口后，與加入了切口的DNA的5’末端共價結(jié)合。然后，以-鏈為模板，由3’末端開始DNA合成，在合成了 I個拷貝的基因組時，通過R印再次于新合成的9個堿基序列中加入切口。同時切出的I個拷貝的基因組份的DNA通過R印連接，復制單鏈環(huán)狀DNA，Rep與新合成的5’末端共價結(jié)合。通過該重復來進行雙生病毒的復制，Rep以外的復制所需的材料全部來自植物(參照圖2以及，化學與生物(化學i生物)，41，pp.311-317，2003等)。
[0008]已知Rep只切斷單鏈DNA，為了使Rep切斷病毒DNA，病毒DNA需要采取莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在雙生病毒中，已知形成該莖環(huán)的堿基序列在菜豆金色花葉病毒屬中極為高度保守。通常，莖區(qū)由9個GC對和2個AT對組成，環(huán)區(qū)由11個堿基或12個堿基組成，在TT、TTT、TA或ATA之后存在TAATATTAC的堿基序列(參照化學和生物，41，pp.311-317，2003中p.313的圖2等)。
[0009]如果可以 提供以雙生病毒中玉米線條病毒屬中保守的堿基序列為標靶的病毒復制抑制方法，則不僅可期待有效防除WDV感染，還可期待有效防除屬于玉米線條病毒屬的多種植物病毒感染。應(yīng)予說明，對于具有雙生病毒持續(xù)抗性的轉(zhuǎn)化植物的制作方法，已知有國際公開W02004/101798中公開的方法等，但與本發(fā)明的方法完全不同。
[0010]現(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻
專利文獻1:日本特表2004-519211號公報 專利文獻2:國際公開W02004/101798 非專利文獻
非專利文獻 I biochemistry, 41，pp.7074-7081，2002 非專利文獻 2 J.Virology, 79，pp.2614-2619，2005
非專利文獻 3:Zhiwu Baohu(ISSN: 0529-1542)，Vol.34, N0.2, pp.17-21，2008
非專利文獻 4:Plant Pathology, 57，pp.838-841，2008
非專利文獻 5:Plant Pathology, 58，pp.1161-1169，2009
非專利文獻 6:Virus genes, 34，pp0.359-366，2007
非專利文獻7:化學和生物(化學i生物)，41，pp.311-317，2003。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0011]發(fā)明要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的課題在于提供對雙生病毒有效的感染防除方法。更具體地，本發(fā)明的課題在于提供對屬于雙生病毒所包含的玉米線條病毒屬的植物病毒的復制進行抑制的藥劑和對屬于玉米線條病毒屬的植物病毒具有抗性的植物等。
[0012]用于解決技術(shù)問題的方法
本發(fā)明人著眼于該莖環(huán)部分，為了提供可以普遍抑制屬于雙生病毒的多種病毒的復制的方法而進行了深入研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn):通過使AZP與莖環(huán)部分的DNA特異性結(jié)合，使病毒DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化，抑制向莖環(huán)結(jié)構(gòu)變化，由此可以抑制僅切斷單鏈DNA的Rep所致的病毒DNA的切斷。此外，本發(fā)明人還確認了該病毒復制抑制作用實際上在植物體中發(fā)揮作用。該方法對通過利用例如在雙生病毒的菜豆金色花葉病毒屬中尤其高度保守的莖環(huán)部來提供對屬于菜豆金色花葉病毒屬的病毒通用的病毒復制抑制劑極其有用。
[0013]進而，本發(fā)明人推進了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):通過利用在屬于雙生病毒的玉米線條病毒屬的病毒中保守的莖環(huán)部和其周邊區(qū)域并適用相同的方法，可以提供對包含小麥萎縮病病毒(WDV)等的屬于玉米線條病毒屬的病毒通用的病毒復制抑制劑，從而完成了本發(fā)明。
[0014]即，根據(jù)本發(fā)明，提供復制抑制劑，其是針對屬于雙生病毒科的玉米線條病毒屬的病毒的復制抑制劑，所述復制抑制劑含有鋅指蛋白并且可以抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，所述鋅指蛋白可以與該病毒的莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自該全長DNA的I或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合。
[0015]根據(jù)上述發(fā)明的優(yōu)選方式，提供:上述復制抑制劑，其含有可以與選自屬于玉米線條病毒屬的病毒的莖環(huán)區(qū)的全長DNA的I處(I個)的部分DNA結(jié)合的單一的鋅指蛋白；上述復制抑制劑，其含有可以與連續(xù)DNA結(jié)合的單一的鋅指蛋白，所述連續(xù)DNA由選自屬于玉米線條病毒屬的病毒的莖環(huán)區(qū)的全長DNA的I處的部分DNA、和結(jié)合于該DNA并選自周邊區(qū)域的I處的DNA構(gòu)成；以及上述復制抑制劑，其含有鋅指蛋白，該鋅指蛋白是通過接頭將2個以上各自可以與選自由莖環(huán)區(qū)和結(jié)合于該莖環(huán)區(qū)的周邊區(qū)域構(gòu)成的DNA的2處以上的部分DNA結(jié)合的鋅指蛋白結(jié)合而成。
[0016]進而根據(jù)優(yōu)選方式，提供上述復制抑制劑，其中，上述鋅指蛋白是含有8個至13個、優(yōu)選9個至12個鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白。
[0017]此外，根據(jù)本發(fā)明，還提供編碼上述鋅指蛋白的核酸、和針對雙生病毒的復制抑制劑，該復制抑制劑含有編碼上述鋅指蛋白的核酸。
[0018]根據(jù)上述發(fā)明的優(yōu)選方式，提供上述復制抑制劑，其中，屬于玉米線條病毒屬的病毒是小麥萎縮病病毒(WDV)。
[0019]從其他觀點出發(fā)，根據(jù)本發(fā)明，提供含有上述鋅指蛋白或編碼上述鋅指蛋白的核酸的針對屬于玉米線條病毒屬的病毒的抗病毒劑；含有上述鋅指蛋白或編碼上述鋅指蛋白的核酸的針對屬于玉米線條病毒屬的病毒的感染預(yù)防劑；針對屬于玉米線條病毒屬的病毒所致的感染的防除用農(nóng)藥，其含有上述鋅指蛋白或編碼上述鋅指蛋白的核酸。
[0020]進而從其他觀點出發(fā)，根據(jù)本發(fā)明，提供預(yù)防植物的屬于玉米線條病毒屬的病毒感染的方法，該方法包括對植物施用預(yù)防有效量的上述鋅指蛋白或編碼上述鋅指蛋白的核酸的步驟；針對屬于玉米線條病毒屬的病毒感染的防除方法，該方法包括對植物施用防除有效量的上述鋅指蛋白或編碼上述鋅指蛋白的核酸的步驟。[0021]此外，根據(jù)本發(fā)明，提供基因重組植物，其是對屬于玉米線條病毒屬的病毒具有抗性的植物，其可表達上述鋅指蛋白；轉(zhuǎn)化植物，其是對屬于玉米線條病毒屬的病毒具有抗性的植物，并且導入有編碼上述鋅指蛋白的基因；使植物獲得針對屬于玉米線條病毒屬的病毒的抗性的方法，其包括用編碼上述鋅指蛋白的基因轉(zhuǎn)化植物的步驟。
[0022]進而根據(jù)本發(fā)明，提供含有編碼上述鋅指蛋白的核酸的重組載體；和上述重組載體，其用于將植物轉(zhuǎn)化為對屬于玉米線條病毒屬的病毒具有抗性的植物。作為載體，可使用植物用的病毒載體等。
[0023]發(fā)明效果
本發(fā)明的復制抑制劑是以在屬于雙生病毒科的玉米線條病毒屬的病毒中保守的莖環(huán)區(qū)作為靶標，因而可作為針對屬于玉米線條病毒屬的多種病毒所致感染的通用復制抑制劑發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明的復制抑制劑不僅對屬于玉米線條病毒屬的病毒的代表性病毒W(wǎng)DV感染，而且對屬于玉米線條病毒屬的其它病毒也可發(fā)揮高度有效性，因而作為針對屬于玉米線條病毒屬的多種病毒的防除方法極其有用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024][圖1]示出鋅指基序和DNA的結(jié)合方式的圖。
[0025][圖2]雙生病毒的復制步驟的示意圖。
[0026][圖3]示出雙生病毒和TYLCV的包含關(guān)系的圖。
[0027][圖4]示出TYLCV的莖環(huán)區(qū)的圖。
[0028][圖5]示出包含于雙生病毒中的數(shù)種病毒的莖環(huán)區(qū)同源性的圖。
[0029][圖6]示出只以TYLCV為靶標的復制抑制劑的實例(上半部分)和以多種雙生病毒為靶標的復制抑制劑的實例(下半部分)的圖。
[0030][圖7]示出TYLCV專用AZP-2的制作步驟的方案。
[0031][圖8]示出雙生病毒通用AZP-3的制作步驟的方案。
[0032][圖9]示出通過凝膠移位試驗評價TYLCV專用AZP-2對靶標DNA序列的結(jié)合能力的結(jié)果的圖。
[0033][圖10]示出凝膠移位試驗評價雙生病毒通用AZP-3對靶標DNA序列的結(jié)合能力的結(jié)果的圖。
[0034][圖11]示出為了比較而通過凝膠移位試驗評價R印N對靶標DNA序列的結(jié)合能力的結(jié)果的圖。
[0035][圖12]示出GST-AZP(AZP-2)抑制R印切斷復制起點的活性的圖。泳道I表示底物DNA、泳道2表示切斷產(chǎn)物標志物，泳道3表示用2 μ M GST-Rep進行切斷。
[0036][圖13]示出GST-AZP(ΑΖΡ-3)抑制R印切斷復制起點的活性的圖。示出GST-R印濃度2 μ Μ、反應(yīng)溫度25°C、反應(yīng)時間30分鐘下的切斷物。
[0037][圖14]示出PUC35S0-TYLCV3/4/6的制作方法的圖。35S:來自花椰菜花葉病毒的啟動子；NLS:核定位信號；Ω:用于提高翻譯效率的5’-前導序列；N0ST:終止子；TYLCV3/4/6:與所有TYLCV中的共有堿基序列結(jié)合的AZP(識別序列為5’ -GGCCATCCGTATAATATTACCGGATGGCCGC-3’)。
[0038][圖15]示出轉(zhuǎn)化用APZ表達質(zhì)粒的制作方法的圖。N0S:正纈氨酸合成啟動子(來自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens) ) ；NPT2:卡那霉素抗性基因；⑶S:β -半乳糖苷酶基因；RB (右邊界)和LB (左邊界):約25bp的重復序列(該序列之間的DNA區(qū)轉(zhuǎn)移至植物基因組中)。
[0039][圖16]示出轉(zhuǎn)化體Tl的插入基因的結(jié)構(gòu)、以及用于檢測卡那霉素抗性基因和AZP基因的PCR引物組的圖。
[0040][圖17]示出檢測轉(zhuǎn)化體Tl的卡那霉素抗性基因和AZP基因的結(jié)果的圖。泳道I~4表示使用由各Tl植物提取的DNA、N表示使用由野生型番茄提取的DNA、P表示使用轉(zhuǎn)化中所用的雙元載體(binary vector),分別進行PCR的結(jié)果。
[0041][圖18]示出AZP表達盒全部區(qū)域中的插入基因的結(jié)構(gòu)、以及用于確認插入基因組的引物組的圖。
[0042][圖19]示出通過PCR確認AZP基因插入在導入AZP-2而得的T2植物中的結(jié)果的圖。為了檢測AZP表達盒，泳道I~8表示使用由各Tl植物提取的DNA、P表示使用轉(zhuǎn)化中所用的雙元載體，分別進行PCR的結(jié)果。
[0043][圖20]示出對于導入AZP-2而得的T2植物，通過PCR鑒定AZP插入基因的拷貝數(shù)的結(jié)果的圖。泳道I~18示出使用由來自特定轉(zhuǎn)化體Tl的T2植物提取的DNA、N示出使用由野生型番茄提取的DNA、P示出使用轉(zhuǎn)化中所用的雙元載體，分別進行PCR的結(jié)果。
[0044][圖21]示出確認AZP在導入AZP-2而得的T2植物中的表達的結(jié)果的圖。通過利用抗HA抗體的蛋白質(zhì)印跡法，由圖20所示的T2植物的葉提取液中檢出了 AZP。圖中的泳道編號與圖20中對應(yīng)。
[0045][圖22]示出對于導入AZP-2而得的T3植物，通過PCR鑒定AZP插入基因的純合T2品系的結(jié)果的圖。泳道I~16示出使用由來自特定T2品系的T3植物提取的DNA進行PCR的結(jié)果。將在全部T3個體中確認了 AZP插入基因的該T2植物作為純合進行篩選。
[0046][圖23]示出確認AZP在導入AZP-2而得的T3植物中的表達的結(jié)果的圖。泳道I~4是使用來自T3植物的葉的提取液、N是使用來自野生型番茄的葉的提取液、和P是使用來自所用品系的T2植物的葉的提取液，分通過利用抗HA抗體的蛋白質(zhì)印跡檢出了 AZP。
[0047][圖24]示出通過土壤桿菌接種法(Agro-1noculation)向野生型Micro-Tom番爺注入具有TYLCV基因組的土壤桿菌，使TYLCV感染成立的結(jié)果的圖。在生長后的個體(右)中明確觀察到TYLCV感染的特征性癥狀即葉的卷曲或黃化，同時可見明顯的生長抑制。
[0048][圖25]示出對導入AZP-2而得的T3植物進行TYLCV感染試驗的結(jié)果的圖。轉(zhuǎn)化體中未見感染癥狀。
[0049][圖26]示出由感染病毒30天后的AZP-2轉(zhuǎn)化番茄回收葉，使用TYLCV檢測用引物進行PCR的結(jié)果的圖。
[0050][圖27]示出使TYLCV感染由導入AZP-3制作的Tl植物的I個個體得到的T3植物的結(jié)果的圖。
[0051][圖28]示出在AZP-3的轉(zhuǎn)化體中未檢出病毒DNA的圖。
[0052][圖29]示出小麥萎縮病病毒(WDV)的突變體的圖。[0053][圖30]示出針對含有WDV的屬于玉米線條病毒屬的病毒的3種復制抑制劑的靶標位點的圖。AZPll和AZP13設(shè)計為識別正義鏈，AZP12基于反義鏈側(cè)的序列設(shè)計(實施例1)。[0054][圖31]示出AZP-1l的制作步驟的圖。
[0055][圖32]示出AZP-12的制作步驟的圖。
[0056][圖33]示出AZP-13的制作步驟的圖。
[0057][圖34]示出用于制備具有AZP-1l和AZP-12表達盒的雙元載體的前體載體的結(jié)構(gòu)的圖。
[0058][圖35]示出用于擴增泛素啟動子和AZP的片段的引物組的圖。
[0059][圖36]示出用PCR擴增泛素啟動子和AZP的片段的結(jié)果的圖。
[0060][圖37]示出用于擴增含AZP的區(qū)域的引物組的圖。
[0061][圖38]示出AZP在導入AZPlI和AZP12的Tl個體中強表達的結(jié)果的圖。
[0062][圖39]示出使WDV感染導入AZPll或AZP12基因制作的Tl轉(zhuǎn)化體后通過PCR檢測WDV基因組DNA的結(jié)果的圖。
【具體實施方式】
[0063]本發(fā)明的復制抑制劑是針對屬于雙生病毒科的玉米線條病毒屬的病毒的復制抑制劑，其特征在于，含有鋅指蛋白并且可以抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，所述鋅指蛋白可以與上述病毒的莖環(huán)區(qū)的全長DN A或選自該全長DNA的I或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合。 [0064]本說明書中所用的術(shù)語“雙生病毒”意指感染植物的DNA病毒，其是具有I個或2個單鏈環(huán)狀DNA的病毒，該術(shù)語的含義在例如化學與生物，41，pp.311-317，2003等中有具體說明。根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)、宿主范圍和媒介昆蟲的種類，雙生病毒分類為以下4個屬，即，玉米線條病毒(Mastrevirus)屬、甜菜曲頂病毒(Curtovirus)屬、番爺偽曲頂病毒(Topocuvirus)屬、和菜豆金色花葉病毒(Begomovirus)屬,本發(fā)明的復制抑制劑可以以它們之中尤其是屬于玉米線條病毒屬的任意病毒為靶標。屬于各屬的病毒的基因組構(gòu)成在上述出版物(化學和生物，41，pp.311-317，2003)的圖2中具體例示。此外，屬于雙生病毒的病毒及其縮寫符號在例如國際公開W02004/101798中公開有詳細的表單。通過參照，將國際公開W02004/101798的全部公開內(nèi)容包含作為本說明書的公開。雙生病毒中除了已知的雙生病毒之外，還包含未知的雙生病毒和已知的雙生病毒變異而成的新種雙生病毒等。
[0065]作為雙生病毒中包含的病毒，可舉出例如:MSV(玉米條紋病毒(Maize streakvirus))、WDV (小麥萎縮病病毒(Wheat dwarf virus))、BeYDV (菜豆黃矮病毒(Beanyellow dwarf virus))等屬于玉米線條病毒屬的病毒，BCTV(甜菜曲頂病毒(Beet cury topvirus))等屬于甜菜曲頂病毒屬的病毒,TPCTV(番爺偽曲頂病毒(Tomato pseudo-cury topvirus))等屬于番爺偽曲頂病毒屬的病毒，以及BGMV(菜豆金色花葉病毒(Bean goldenmosaic virus))、ACMV (非洲木薯花葉病毒(African cassava mosaic virus))、SLCV (南瓜曲葉病毒(Squash leaf curl virus)) > TGMV (番爺金色花葉病毒(Tomato golden mosaicvirus))、和TYLCV(番爺黃化曲葉病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus))等屬于菜豆金色花葉病毒屬的病毒，但并不限定于此。本發(fā)明的復制抑制劑提供為以MSV (玉米條紋病毒)、WDV (小麥萎縮病病毒)、BeYDV(菜豆黃矮病毒)等屬于玉米線條病毒屬的病毒為對象的復制抑制劑，其中，WDV是特別優(yōu)選的對象。
[0066]屬于菜豆金色花葉病毒屬的病毒中，已知作為復制抑制劑的結(jié)合部位的莖環(huán)區(qū)高度保守。作為屬于菜豆金色花葉病毒屬的病毒，可舉出例如:TYLCCNV、TYLCGV、TYLCMalV、TYLCSV、TYLCTHV、TYLCV、ACMV、BGMV、CaLCuV、ToCMoV、TGMV、ToGMoV、ToMHV、ToMoTV、ToMoV, ToRMV, ToSLCV、ToSRV、棉花曲葉(CLCrV、CLCuAV, CICuGV、CLCuKV, CLCuMV,CLCuRV)、東非木薯花葉(EACMCV、EACMMV, EACMV、EACMZV)、馬鈴薯黃色花葉(PYMPV、PYMTV、PYMV)、南瓜曲葉(SLCCNV、SLCV, SLCYV)、甘薯曲葉(SPLCGV、SPLCV)、煙草曲葉(TbLCJV、TbLCKoV、TbLCYNV、TbLCZV)、番茄曲葉(ToLCBV、ToLCBDV、ToLCGV、ToLCKV、ToLCLV、ToLCMV, ToLCNDV, ToLCSLV, ToLCTffV, ToLCVV, ToLCV)等，但并不限定于此。以下，為了說明本發(fā)明復制抑制劑的設(shè)計手法和作用機制等，作為參考，有時特別會提及屬于菜豆金色花葉病毒屬的TYLCV。圖3示出雙生病毒和TYLCV和WDV的包含關(guān)系。
[0067]本發(fā)明的復制抑制劑含有鋅指蛋白，并且具有抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成的作用，所述鋅指蛋白可以與屬于玉米線條病毒屬的病毒的莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自該全長DNA的I或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合。對于雙生病毒的“莖環(huán)區(qū)”的術(shù)語，若以例如屬于菜豆金色花葉病毒屬的TYLCV為例進行說明，則莖環(huán)區(qū)是由彼此互補地結(jié)合的2個莖區(qū)(分別由11個堿基組成的區(qū)域)、和存在于其間并形成環(huán)的環(huán)區(qū)(由11堿基組成的區(qū)域)組成的33個堿基的區(qū)域。已知TYLCV存在多種株，在所有TYLCV中，莖環(huán)區(qū)的堿基序列高度保守。圖4示出TYLCV的莖環(huán)區(qū)。該莖環(huán)區(qū)在屬于菜豆金色花葉病毒的其它病毒中也高度保守，例如，在兩種BGMV的DNA的CR (共同區(qū))上存在由34個堿基組成的莖環(huán)區(qū)，該堿基序列與屬于菜豆金色花葉病毒的其它病毒的莖環(huán)區(qū)的堿基序列的同源性極高。
[0068]本說明書中，莖環(huán)區(qū)的堿基序列“高度保守”意指所要比較的堿基序列的同源性在80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上、進一步優(yōu)選97%以上、特別優(yōu)選99%以上。對于屬于玉米線條病毒屬的病毒也一樣，通常也存在與屬于菜豆金色花葉病毒屬的病毒相比，莖環(huán)區(qū)的同源性 低的情形，但屬于玉米線條病毒屬的病毒中的莖環(huán)區(qū)的堿基序列也保守，同源性通常在60%以上、優(yōu)選70%以上、更優(yōu)選80%以上、進一步優(yōu)選90%以上、特別優(yōu)選95%以上。進而，對于屬于雙生病毒的其它屬的病毒，莖環(huán)區(qū)也高度保守。圖5示出包含于雙生病毒中的數(shù)種病毒的莖環(huán)區(qū)同源性。
[0069]本發(fā)明的復制抑制劑可以設(shè)計為，與如上所述在屬于玉米線條病毒屬的病毒中保守的莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自該全長DNA的I或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合，該特異性結(jié)合的結(jié)果是可以抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成。本發(fā)明的復制抑制劑還可以設(shè)計為，除了與莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自該全長DNA的I或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合的性質(zhì)之外，還與連接至莖環(huán)區(qū)DNA的上游和/或下游的側(cè)翼區(qū)的DNA特異性結(jié)合，這種方式在本發(fā)明中是優(yōu)選方式。
[0070]特別優(yōu)選的方式之一是(a)復制抑制劑，其含有可以與連續(xù)DNA結(jié)合的單一的鋅指蛋白，所述連續(xù)DNA由選自屬于玉米線條病毒屬的病毒的莖環(huán)區(qū)的全長DNA的I處的部分DNA、和結(jié)合于該DNA并選自側(cè)翼區(qū)的I處的DNA構(gòu)成。作為該特別優(yōu)選的方式的復制抑制劑的具體例，在本說明書的實施例1中公開有AZP-1l和12(圖30)。此外，在特別優(yōu)選的其它方式中，為(b)復制抑制劑，其含有鋅指蛋白，所述鋅指蛋白與選自莖環(huán)區(qū)的該全長DNA的I處的部分DNA特異性結(jié)合。作為該特別優(yōu)選的方式的復制抑制劑的具體例，在本說明書的實施例1中公開有AZP-13(圖30)。進而，還優(yōu)選(c)上述復制抑制劑，其含有鋅指蛋白，該鋅指蛋白是通過接頭將2個以上各自可以與選自由莖環(huán)區(qū)和結(jié)合于該莖環(huán)區(qū)的周邊區(qū)域構(gòu)成的DNA的2處以上的部分DNA結(jié)合的鋅指蛋白結(jié)合而成。為了通過特異性結(jié)合抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，只要本發(fā)明的抑制劑可與選自莖環(huán)區(qū)的DNA結(jié)合、或與選自莖環(huán)區(qū)的DNA以及選自該莖環(huán)區(qū)的周邊區(qū)域即側(cè)翼區(qū)的DNA結(jié)合，并將病毒DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化即可，通過基于莖環(huán)區(qū)和根據(jù)需要的其周邊區(qū)域的堿基序列，選擇適當?shù)匿\指結(jié)構(gòu)域，可以設(shè)計抑制屬于玉米線條病毒屬的病毒的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成的鋅指蛋白。
[0071]鋅指蛋白中所含的鋅指結(jié)構(gòu)域可使用識別密碼表(非簡并識別密碼表)，設(shè)計成可識別特定的堿基序列。本說明書中，鋅指結(jié)構(gòu)域意指構(gòu)成存在于鋅指蛋白上的DNA結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)域，有時也簡稱為“指”。代表性的鋅指蛋白具有2個、3個、4個、6個、或10個左右的鋅指結(jié)構(gòu)域。識別密碼表和識別特定堿基序列而特異性結(jié)合的鋅指蛋白的設(shè)計方法記載于例如日本特表2004-519211號公報中。通過參照，將上述專利公報的全部公開內(nèi)容包含于本說明書的公開中。此外，也可以參照Biochemistry, 41, pp.7074-7081, 2002等。如上所述，屬于玉米線條病毒屬的病毒的基因組DNA的莖環(huán)區(qū)的堿基序列信息可容易獲得，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地設(shè)計制造至少可以與莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自全長DNA的I或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合的鋅指蛋白。
[0072]為了參考，例如，在實施例的參考例I中示出只以TYLCV為靶標的復制抑制劑的設(shè)計方法。設(shè)計可以與包含在TYLCV之間高度保守的莖環(huán)區(qū)DNA (33個堿基)的全長或大致全長的DNA結(jié)合的鋅指蛋白即可，通過使用選自這種鋅指蛋白的I種鋅指蛋白來作為本發(fā)明的復制抑制劑，可以抑制全部的TYLCV的復制。作為這種鋅指蛋白，可以設(shè)計例如含有10個鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白。能夠?qū)⑸鲜龇椒ㄟm宜應(yīng)用于以TYLCV以外的雙生病毒家族為靶標的復制抑制劑的設(shè)計，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。
[0073]此外，為了參考，在實施例的參考例2中也示出了以TYLCV之外的包含屬于菜豆金色花葉病毒屬的病毒的多種雙生病毒為靶標的復制抑制劑的設(shè)計方法。例如，可從莖區(qū)的全長DNA中選擇作為靶標雙生病毒中的共同序列的2處以上的部分DNA，設(shè)計與這些部分DNA結(jié)合的單一的鋅指 蛋白，或設(shè)計分別與這些部分DNA結(jié)合的2個以上的鋅指蛋白，將這些2個以上的鋅指蛋白用適當?shù)慕宇^，例如，肽接頭等分別連接即可。接頭除了使用氨基酸殘基數(shù)為I~40個、優(yōu)選I~20個、進一步優(yōu)選I~10個左右的肽接頭之外，例如還可以使用亞烷基鏈或聚乙二醇鏈等合成接頭或糖鏈等。在從莖區(qū)的全長DNA中選擇2處以上的部分DNA時，優(yōu)選選擇為不含有在作為靶標的包括屬于菜豆金色花葉病毒屬的病毒的多種雙生病毒的莖區(qū)中為非共有序列的部分DNA，通常期望選擇位于該非共有序列的上游和下游的共有序列的DNA來作為部分DNA。
[0074]作為參考，只以TYLCV為靶標的復制抑制劑的實例、和以包含屬于菜豆金色花葉病毒屬的病毒的多種雙生病毒為靶標的復制抑制劑的實例分別示于圖6。圖中，上側(cè)為只以TYLCV為靶標時的實例，下側(cè)為以包含屬于菜豆金色花葉病毒屬的病毒的多種雙生病毒為靶標時的實例。
[0075]例如，(a)只以TYLCV為靶標的復制抑制劑可舉出具有序列表的序列編號I所示的氨基酸序列的復制抑制劑，以及以包含屬于菜豆金色花葉病毒屬的病毒的多種雙生病毒為靶標的復制抑制劑可舉出具有序列編號2所示的氨基酸序列的復制抑制劑。此外，(b)作為由在序列編號I或2所限定的氨基酸序列中具有I至數(shù)個、優(yōu)選I~5個左右氨基酸的缺失、置換和/或添加的氨基酸序列組成的復制抑制劑的與由序列編號I或2所限定的氨基酸序列組成的蛋白實質(zhì)上具有相同的復制抑制作用的蛋白也可用作復制抑制劑。進而，(C)與序列編號I或2所限定的氨基酸序列具有70%、優(yōu)選80%、進一步優(yōu)選90%以上的同源性，與由序列編號I或2所限定的氨基酸序列組成的蛋白實質(zhì)上具有相同的復制抑制作用的蛋白也可以用作復制抑制劑。
[0076]作為用于制備只以TYLCV為靶標的復制抑制劑的實例、和以包含屬于菜豆金色花葉病毒屬的病毒的多種雙生病毒為靶標的復制抑制劑的核酸，除了編碼上述(a)的蛋白的DNA (序列表的序列編號3或4所示的堿基序列所限定的DNA)之外，可使用含有編碼上述(b)或(c)的蛋白的DNA的核酸。作為編碼上述(b)或(c)所示蛋白的DNA，例如，包含可在嚴格條件下與由序列編號3或4所示堿基序列限定的DNA雜交的DNA等。作為這樣的DNA，可舉出例如:使用DNA作為探針，在集落雜交法、噬菌斑雜交法、或DNA印跡雜交法中，使用固定有來自集落或噬菌斑的DNA或DNA片段的濾器，在0.7~1.0 M左右的NaCl存在下、在65°C下進行雜交，然后使用0.1~2 X SSC溶液(I X SSC溶液含有150 mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉)在65°C條件下洗滌濾器，可由此鑒定的DNA等。例如，可優(yōu)選使用與作為探針使用的DNA的堿基序列具有70%以上、優(yōu)選80%以上、進一步優(yōu)選90%以上、特別優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選98%以上的同源性的DNA。
[0077]本發(fā)明所提供的針對屬于玉米線條病毒屬的病毒的復制抑制劑的設(shè)計可如下所述進行。作為屬于玉米線條病毒屬的病毒的代表例，可舉出WDV，但對于WDV，已知圖29所示的突變體，莖環(huán)區(qū)高度保守，進而分別連接至莖區(qū)的下游和上游的周邊區(qū)域(側(cè)翼區(qū))也高度保守(關(guān)于WDV的基因組序列和突變體，可參照Plant Pathology, 57，pp.838-841，2008; Plant Pathology, 58，pp.1161-1169，2009; Virus genes, 34，pp0.359-366，2007等)。本發(fā)明的復制抑制劑的設(shè)計中要考慮的周邊區(qū)域的堿基數(shù)，例如從莖區(qū)的末端起為200個以下，優(yōu)選為100個以下，進一步優(yōu)選為50個以下，特別優(yōu)選為30個以下左右。進而，這些區(qū)域在屬于玉米線條病毒屬的其它病毒中也保守，該區(qū)域的同源性通常在60%以上、優(yōu)選70%以上、更優(yōu)選80%以上、進一步優(yōu)選90%以上、特別優(yōu)選95%以上。
[0078]因此，為了抑制WDV的復制，可以使用與WDV的莖環(huán)區(qū)特異性結(jié)合的鋅指蛋白，或者使用與WDV的莖環(huán)區(qū)的一部分結(jié)合、同時與連接至WDV的莖區(qū)的上游和/或下游的DNA特異性結(jié)合的鋅指蛋白。作為一例，圖30示出針對含有WDV的屬于玉米線條病毒屬的病毒的本發(fā)明的復制抑制劑的靶標位點。為了抑制WDV的復制，除了與正義鏈特異性結(jié)合的鋅指蛋白之外，還可以使用與反義鏈特異性結(jié)合的鋅指蛋白。
[0079]本說明書的實施例1中，作為識別正義鏈的鋅指蛋白，具體公開有AZPll和AZP13，作為基于反義鏈側(cè)的序列設(shè)計的鋅指蛋白，具體公開有AZP12。此外，AZP11、AZP12和AZP13的設(shè)計方法分別示于圖31、圖32、和圖33，AZPlU AZP12和AZP13的氨基酸序列分別示于序列表的序列編號5、6、和7。作為本發(fā)明的復制抑制劑，也可以使用(d)作為由在序列編號5、6或7所限定的氨基酸序列中具有I至數(shù)個、優(yōu)選I~5個左右氨基酸的缺失、置換、和/或添加的氨基酸序列組成的復制抑制劑的、具有與由序列編號5、6、或7所限定的氨基酸序列組成的蛋白實質(zhì)上相同的針對屬于玉米線條病毒屬的病毒的復制抑制作用的蛋白。進而，還可以使用(e)與由序列編號5、6、或7所限定的氨基酸序列具有70%、優(yōu)選80%、進一步優(yōu)選90%以上的同源性，且具有與由序列編號5、6、或7所限定的氨基酸序列組成的蛋白實質(zhì)上相同的復制抑制作用的蛋白來作為本發(fā)明的復制抑制劑。
[0080]作為用于制備針對屬于玉米線條病毒屬的病毒的復制抑制劑的核酸，例如，除了編碼上述AZP11、AZP12和AZP13的DNA (分別由序列表的序列編號8、9和10所示堿基序列所限定的DNA)之外，還可使用包含編碼上述(d)或(e)的蛋白的DNA的核酸。作為編碼上述(d)或(e)所示蛋白的DNA，例如，包含可在嚴格條件下與由序列編號8、9和10所示堿基序列所限定的DNA雜交的DNA等。作為這樣的DNA，可舉出例如:使用DNA作為探針，在集落雜交法、噬菌斑雜交法、或DNA印跡雜交法中，使用固定有來自集落或噬菌斑的DNA或DNA片段的濾器，在0.7~1.0 M左右的NaCl存在下、在65°C下進行雜交，然后使用0.1~2 X SSC溶液(I X SSC溶液含有150 mM氯化鈉和15 mM檸檬酸鈉)在65°C條件下洗滌濾器，可由此鑒定的DNA等。例如，可優(yōu)選使用與作為探針使用的DNA的堿基序列具有70%以上、優(yōu)選80%以上、進一步優(yōu)選90%以上、特別優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選98%以上的同源性的DNA。
[0081]本發(fā)明的復制抑制劑以上述鋅指蛋白或編碼該鋅指蛋白的核酸的形式提供，通過將本發(fā)明的復制抑制劑直接作為農(nóng)藥對植物施用，可以進行針對屬于玉米線條病毒屬的病毒的感染防除。本發(fā)明的復制抑制劑的施用方法沒有特別限定，例如，可以使用本領(lǐng)域周知的制劑用添加物來制為農(nóng)藥用組合物。含有蛋白或核酸作為有效成分的農(nóng)藥用組合物在本領(lǐng)域是已知的，可采用適宜的方法制備農(nóng)藥用組合物?？膳e出例如:使用引入了上述核酸的質(zhì)粒等載體，將上述核酸導入植物細胞內(nèi)并瞬時轉(zhuǎn)化植物的方法；或者使用載體將上述核酸引入植物基因組的方法等，但并不限于該方法。本發(fā)明的方法中可利用的載體也包含感染植物的病毒載體。
[0082]農(nóng)藥用組合物的形態(tài)沒有特別限定，只要是本領(lǐng)域可利用的形態(tài)則可采用任何形態(tài)。例如，可以使用乳劑、溶液劑、油劑、水溶劑、水合劑、流動劑(7 口 7 7''^ )、粉劑、微粒劑、顆粒劑、氣溶 膠、熏蒸劑、或糊劑等形態(tài)的組合物。農(nóng)藥用組合物的制造方法也沒有特別限定，可適當采用本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的方法。此外，也可以將其它抗病毒劑、殺蟲劑、殺菌劑、殺蟲殺菌劑、除草劑等其它農(nóng)藥的有效成分配合于農(nóng)藥用組合物中。
[0083]根據(jù)本發(fā)明，提供可表達上述復制抑制劑的轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明中作為轉(zhuǎn)化對象的植物沒有特別限定，除了植物體整體之外，還可以是植物器官(例如葉、花瓣、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、薄壁組織、木質(zhì)部、維管束、柵狀組織、海棉狀組織等)、或植物培養(yǎng)細胞的任一種。植物的種類沒有特別限定，可以以任意植物為對象，優(yōu)選以屬于玉米線條病毒屬的病毒感染成立的植物種類為對象。
[0084]更具體地，作為植物種類，可舉出例如:屬于錦葵科(秋葵等)、藜科(甜菜、菠菜等)、十字花科(蕪菁、花椰菜、青花椰菜、卷心菜、油菜( = t )、紫羅蘭、蘿卜、青梗菜、大白菜、山崳菜等)、鳶尾科(鳶尾、唐菖蒲、小蒼蘭等)、白花丹科(不凋花(Statice)等)、禾本科(水稻、結(jié)縷草、玉米、麥等)、苦苣苔科(Gesneriaceae)(非洲堇等)、五加科(土當歸等)、葫蘆科(南瓜、黃瓜、越瓜、西瓜、甜瓜等)、柿樹科(柿子等)、菊科(非洲菊、菊、金盞花、秋英屬、牛蒡、瓜葉菊、茼蒿、大麗花、向日葵、蜂斗菜、雛菊、六月菊、萵苣等)、胡桃科(胡桃等)、桑科(無花果、桑樹、蛇麻草等)、罌粟科(冰島罌粟等)、玄參科(金魚草等)、報春花科(仙客來、報春花等)、天南星科(筠篛、芋頭等)、仙人掌科(仙人掌等)、唇形科(一串紅、紫蘇等)、秋海棠科(秋海棠屬等)、姜科(姜、囊荷等)、睡蓮科(蓮藕等)、堇菜科(三色堇等)、傘形科(水芹、旱芹、胡蘿卜、歐芹、鴨兒芹等)、金粟蘭科(草珊瑚等)、杜鵑花科(漿果類等)、山茶科(茶等)、大戟科(一品紅等)、茄科(馬鈴薯、煙草、番茄、茄子、柿子椒、獅子菜椒等)、石竹科(康乃馨、多年生滿天星等)、薔薇科(杏、草莓、梅、櫻桃、李、梨、薔薇、枇杷、桃、珍珠繡線菊、蘋果、西洋梨等)、旋花科(牽?；ā⒏适淼?、櫳牛兒苗科(天竺葵等)、葡萄科(葡萄等)、山毛櫸科(栗等)、牡丹科(牡丹、芍藥等)、獼猴桃科(獼猴桃等)、豆科(紅豆、扁豆、菜豆、毛豆、豌豆、香豌豆、蠶豆、大豆、花生等)、蕓香科(柑橘等)、薯蕷科(山藥等)、虎耳草科(蘭花等)、百合科(蘆筍、洋蔥、郁金香、韭菜、蒜、蔥、風信子、百合、Il頭、冬蔥等)、蘭科(卡特蘭屬、繡球花、蝴蝶蘭等)、龍舌蘭科(龍血樹類等)、龍膽科(洋桔梗、龍膽等)、禾本科(小麥、水稻等)的植物，但并不限定于此。
[0085]優(yōu)選可舉出例如:番茄、胡椒、煙草、南瓜、木薯、甘薯、棉花、甜瓜、馬鈴薯、大豆、葡萄、玉米、小麥、水稻、甘蔗、豆、甜菜、西瓜、秋葵、樹薯等，但并不限定于此。進一步優(yōu)選的植物是小麥或水稻等，特別優(yōu)選的植物是小麥。
[0086]作為 要轉(zhuǎn)化的植物源，可舉出:原生質(zhì)體、種子、萌芽、苗、愈傷組織、培養(yǎng)細胞、植物體等，并無特別限定。根據(jù)對象植物的種類，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇適當?shù)牟课贿M行轉(zhuǎn)化。
[0087]用于轉(zhuǎn)化的載體的種類沒有特別限定，優(yōu)選載體中含有用于使編碼上述鋅指蛋白的基因表達的啟動子和/或增強子序列。作為啟動子和增強子序列，只要是在植物細胞中可使上述基因表達即可，其種類沒有特別限定，可使用任意的啟動子和增強子序列。例如，可使用含有如土壤桿菌或根瘤菌的植物細胞內(nèi)表達的基因、來自植物體、植物病毒或細菌的啟動子等。作為啟動子，可使用例如:來自根癌土壤桿菌的T-DNA的啟動子、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子、NOS啟動子、核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisc0)啟動子、GRP1-8啟動子、來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子、來自植物的肌動蛋白或組蛋白等的啟動子/增強子等，但并不限定于此。
[0088]載體中可以含有編碼各種抗生素抗性基因或其它標記基因作為篩選標記基因的序列。作為標記基因的實例，可舉出例如:抗大觀霉素基因、鏈霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、遺傳霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、抗抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)的除草劑的抗性基因、抗抑制谷氨酰胺合成酶的除草劑的抗性基因(例如bar基因)、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、熒光素酶基因等，但并不限定于此。
[0089]為了提高基因表達效率，例如，有時也優(yōu)選在基因的編碼區(qū)的核苷酸編碼區(qū)的3’末端包含Poly (A) +序列。作為Poly (A) +序列，可使用來自各種植物基因或T-DNA的序列，但并不限定于此。也可將對使基因高水平表達有用的其它序列、例如特定基因的內(nèi)含子序列、5’非翻譯區(qū)的序列等導入載體。此外，為了促進向核內(nèi)的轉(zhuǎn)運，還優(yōu)選引入核定位信號(NLS)等。
[0090]對于高等植物的基因表達有用的載體是本領(lǐng)域所周知的，可使用任意的載體。例如，將載體導入植物細胞時，作為可將載體DNA的一部分引入宿主植物的基因組的載體，除了來自根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒的載體之外，還可舉出:來自Ti質(zhì)粒的KYLX6、pKYLX7、ρΒΙ101、ρΒΗ2113、ρΒΙ121等，但并不限定于此。
[0091]對于表達載體，可采用用于將外源性基因?qū)胫参锛毎墓椒?，例如基因槍法、電穿孔法、聚乙二?PEG)法、磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、顯微注射、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、以及土壤桿菌法等微生物媒介轉(zhuǎn)染法等，導入所需的植物細胞中。其中優(yōu)選基因槍法、電穿孔法、聚乙二醇法和土壤桿菌法等，可特別優(yōu)選采用土壤桿菌法(Methods Mol.Biol, 82，pp.259-266，1998)。有時也可以通過采用雙成分載體(雙元載體)法高效地進行基因重組。
[0092]應(yīng)予說明，表達載體的構(gòu)建方法以及植物的轉(zhuǎn)化方法在本說明書的實施例中進一步具體說明，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參照上述一般說明和實施例的具體說明，通過將載體的種類或要導入載體中的序列、轉(zhuǎn)化法等進行適當變化或改變，可以轉(zhuǎn)化所需植物，使其表達本發(fā)明的復制抑制劑。
實施例
[0093]以下通過實施例進一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不限于下述實施例。
[0094]參考例I 1.材料與方法 (I)AZP的設(shè)計
基于日本特表2004-519211號公報所記載的識別密碼表設(shè)計分別識別以下兩種DNA區(qū)的鋅指蛋白(以下，在實施例中簡稱為“AZP”)。
a.TYLCV中保守的莖環(huán)區(qū)
b.雙生病毒中保守的莖環(huán)區(qū)
在圖6的上半部分所示的AZP(TYLCV專用)中，連續(xù)地連接10個鋅指結(jié)構(gòu)域。圖6的下半部分所示的AZP(雙生病毒通用)中，是將識別莖環(huán)區(qū)內(nèi)的、雙生病毒中保守的兩個區(qū)的2種AZP用短肽連 接。
[0095](2) AZP表達質(zhì)粒的制作
按照圖7所示方案制作TYLCV專用AZP (以下，稱為“AZP-2”)。首先通過PCR合成分別連接有3個鋅指的基因，將各基因克隆至大腸桿菌表達載體的pET-2la (Novagen社)的BamHI/Hind III位點，然后確認所得質(zhì)粒的堿基序列，由此得到pET-TYLCV-3、pET_TYLCV_4、和pET-TYLCV-5。接著通過PCR擴增pET_TYLCV_3和pET_TYLCV_4內(nèi)的3指AZP的基因并連接，最終得到PET-TYLCV3/4。制作識別5’ -TATA-3’的鋅指基因，按照上述方法與pET_TYLCV5內(nèi)的3指AZP基因連接，由此制作pET-TYLCV6。最后通過PCR，由pE_TYLCV3/4和pET_TYLCV6分別擴增6指AZP基因和4指AZP基因并連接，由此制作識別在形成莖環(huán)區(qū)的序列的33個堿基中的31個堿基的AZP-2表達用質(zhì)粒(pET-TYLCV3/4/6)。
[0096]按照圖8所示方案制作雙生病毒通用AZP(以下稱為“AZP-3”)。首先，為了引入識別在莖環(huán)區(qū)內(nèi)的、雙生病毒中保守的2個區(qū)的2種AZP基因和接頭肽基因，首先制作前體質(zhì)粒(pET-MCS)。通過PCR，由pET-TYLCV3/4擴增識別雙生病毒中保守的較長區(qū)的6指AZP基因，克隆至pET-MCS，由此制作pET-TYLCV3/4-MCS。接著，通過PCR由pET_TYLCV5擴增識別雙生病毒中保守的較短區(qū)的3指AZP基因，克隆至pET-TYLCV3/4-MCS，由此制作表達具有6個氨基酸作為接頭肽的AZP-3的質(zhì)粒(pET-TYLCV3/4-MCS-TYLCV5)。
[0097](3) AZP 的表達
用AZP表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，將所得轉(zhuǎn)化體在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37°C下培養(yǎng)，在0D_達到0.6-0.7時添加IPTG，使終濃度為I mM，誘導目標蛋白的表達。進一步培養(yǎng)3小時，然后通過離心回收大腸桿菌，在蛋白純化之前在-80°C下保存。
[0098](4) AZP 的純化
各AZP按照基本相同的方法純化。向在-80°C下保存的大腸桿菌中加入IOml裂解緩沖液(100 mM Trs-HCl、100 mM NaCl、0.I mM ZnCl2,5 mM DTT、pH 8.0)，重復 3 次冷凍和融解，使大腸桿菌的細胞壁容易破壞。接著加入到超聲波破碎機中，破碎大腸桿菌，然后通過離心回收含有目標蛋白質(zhì)的上清。將該上清加載于陽離子交換樹脂的Biorex-70 (Bio-Rad制造)中，使目標蛋白質(zhì)吸附于樹脂，然后用洗滌緩沖液(50 mM Trs-HCl,50 mM NaCU0.1 mMZnCl2、0.2 mM DTT,pH 8.0)充分洗滌。接著用洗脫緩沖液(50 mM Trs-HCl,300 mM NaCU0.1mMZnCl2、0.2mMDTT、pH8.0)洗脫目標蛋白質(zhì)。只收集含有目標蛋白質(zhì)的級分，用超濾膜濃縮，然后加入等量的甘油，進行攪拌后，在_80°C下保存。AZP純度通過SDS-PAGE上的考馬斯藍染色的條帶的量來判斷。各蛋白質(zhì)的濃度使用Protein Assay ESL(Roche制造)來確定。
[0099](5) RepN表達質(zhì)粒的制作
R印N是病毒復制蛋白R印的N末端區(qū)部分(191個氨基酸殘基)，具有DNA結(jié)合能力。為了應(yīng)用于AZP抑制R印與同向重復序列結(jié)合的試驗，按照以下方法制備R印N。使用從受感染的番茄中回收的TYLCV基因組，通過PCR，由TYLCV基因組擴增R印N基因，與AZP的情形同樣，克隆至pET-21a的BamH I/Hind III位點。通過確認所得質(zhì)粒的堿基序列，制作了RepN表達用的質(zhì)粒(pET-RepN)。
[0100](6) RepN蛋白的表達和純化
RepN的表達與AZP表達的情形同樣進行，獲得足夠量的表達。所得大腸桿菌在進行蛋白質(zhì)純化之前保存于_80°C。R印N的純化與AZP的情形同樣進行。在使用Biorex-70的離子交換色譜中，用洗脫緩沖液(50mM Tris-HCl、250mMNaCl、0.2mMDTT、pH8.0)洗脫，由此獲得高純度的R印N。
[0101](7) AZP和R印N對復制起點的結(jié)合能力的評價
各蛋白質(zhì)對靶DNA序列的結(jié)合能力的評價是通過凝膠移位試驗進行的。制作含有靶DNA序列的DNA寡聚物，將5’末端用32P標記。接著，在含有標記DNA的結(jié)合緩沖液(10 mMTris-HCl、100 mM NaCl、5 mM MgCl2、0.1 mMZnCl2、0.05% BSA、10% glycerol、ρΗ7.5)中添加規(guī)定量的蛋白質(zhì)，在冰上反應(yīng)I小時。將該反應(yīng)物上樣于6%非改性丙烯酰胺凝膠上，在4°C下電泳2小時(電泳緩沖液:45mM Tris-硼酸)。電泳后將凝膠置于色譜紙上進行干燥。在充分干燥后使其感光到X射線膠片，檢測標記DNA的條帶。游離DNA和與蛋白質(zhì)的DNA復合體的量比為1:1時的蛋白質(zhì)濃度相當于與靶DNA序列的解離常數(shù)。根據(jù)該蛋白質(zhì)濃度進行AZP和R印N的結(jié)合能力的比較。
[0102](8) AZP抑制病毒復制蛋白切斷的能力的評價 (a) Rep表達質(zhì)粒的制作-1
在抑制切斷的能力的評價中，具有切斷活性的全長的Rep是必需的，因此進行了 Rep表達質(zhì)粒的制作。與RepN表達質(zhì)粒的制作同樣地，Rep基因通過PCR由TYLCV基因組擴增，并克隆至pET-21a的BamH I/Hind III位點。確認所得質(zhì)粒的堿基序列，由此制作了 Rep表達用的質(zhì)粒(pET-Rep)。
[0103](b) Rep表達質(zhì)粒的制作-2
如果是Rep單獨，則在大腸桿菌破碎后可能無法以溶解的狀態(tài)檢測，因此，以與促進難溶的蛋白質(zhì)溶解且純化簡便的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合體的形式制作R印。通過PCR,由GST融合蛋白表達用質(zhì)粒(pET-41a，Novagen制造)擴增含有T7啟動子和GST基因的DNA區(qū)，克隆至pET-R印的BamH I/Sph I位點。確認DNA堿基序列，由此制作GST-R印蛋白表達用的質(zhì)粒(pET-GST-R印)。
[0104](C) GST-Rep融合蛋白的表達
用 pET-GST-Rep 分別轉(zhuǎn)化三種大腸桿菌 BL21(DE3)、Rosetta2 (DE3) pLysS 和BL21-Codon-Plus(DE3)-RIL，與R印N蛋白表達時同樣地，在37°C下用I mM IPTG誘導得到的各克隆表達。在各大腸桿菌中的表達量相同，但大腸桿菌破碎后的GST-Rep的溶解量是在BL21(DE3)中最高。因此，使用BL21(DE3)轉(zhuǎn)化體進行30°C下的蛋白質(zhì)表達。
[0105](d) GST-Rep 蛋白的純化
將大腸桿菌沉淀懸浮于3mL裂解緩沖液(4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 137 mMNaCl, 2.7 mM KCl, pH7.3，0.1 mM ZnCl2, 5 mM DTT)中，進行超聲處理。通過 SDS-PAGE 確認GST-Rep蛋白的溶解，然后離心，只取出上清。將預(yù)先用20倍量的IXGST-結(jié)合洗滌緩沖液(GST-Bind Wash Buffer)洗滌的GST結(jié)合樹脂轉(zhuǎn)移至15mL錐形管中，進一步用5mL I XGST-結(jié)合洗滌緩沖液(4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl,PH7.3)洗滌，以400Xg、25°C離心5分鐘，小心除去上清。將含有超聲處理后的GST-R印蛋白的上清用0.45 μ m膜濾器過濾，將所得濾液添加于進行了上述前處理的樹脂中。在4°C下振蕩過夜，使GST-AZP蛋白吸附于樹脂上。將該樹脂過柱，用洗滌緩沖液(4.3 mM Na2HPO4,1.47 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1 mM ZnCl2)洗滌，然后用洗脫緩沖液(50 mMTris HCl, pH8.0, 0.1 mM ZnCl2, 10 mM還原型谷胱甘肽)洗脫。通過SDS-PAGE確認洗脫的各級分，收集含有GST-Rep蛋白的級分，通過超濾膜濃縮至總量為300 μ L。蛋白質(zhì)濃度通過市售的試劑盒(ProteinAssayECL)確定。
[0106](e) GST-AZP融合蛋白的表達
制作AZP與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合體，使該GST-AZP基因位于T7啟動子下游，將這樣的表達載體導入大腸桿菌。將該大腸桿菌在120mL LB-Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600達到0.65~0.75。培養(yǎng)后添加IPTG，使終濃度為ImM，進一步培養(yǎng)3小時，由此誘導GST-AZP蛋白表達。將誘導后的大腸桿菌離心后回收，保存于-80 °C。GST-AZP蛋白的純化按照與GST-Rep蛋白純化同樣的方法進行。
[0107](f)AZP抑制病毒復制蛋白切斷的能力的評價
在含有由含R印結(jié)合位點的200個堿基對組成的標記DNA (5nM)的反應(yīng)溶液(25 mMTris-HCl, pH7.5，75 mM NaCl, 2.5 mM DTT)中添加GST-AZP (或者為了進行性能比較試驗而添加GST-R印N，或者為了進行對照試驗而添加GST)，混合，在冰上靜置30分鐘。然后分別添加GST-Rep和MgCl2,使終濃度為2 μ M和5mM，然后在25°C下反應(yīng)。30分鐘后添加2 μ L
0.5Μ EDTA,使反應(yīng)終止，進行苯酚處理和乙醇沉淀。用3 μ L加樣緩沖液(80%甲酰胺、IOmMEDTA)溶解，將制作的樣品在8%改性丙烯酰胺凝膠中進行電泳。
[0108]2.結(jié)果
(I) AZP對靶標DNA序列的結(jié)合能力的評價
通過凝膠移位試驗評價純化的AZP和RepN與祀DNA序列結(jié)合的能力。該試驗中，在用32P標記的DNA中，以各種濃度添加蛋白質(zhì)，進行結(jié)合反應(yīng)，然后將游離DNA和與蛋白質(zhì)的DNA復合體在非改性凝膠上分離。求出游離DNA和與蛋白質(zhì)的DNA復合體的條帶比為1:1時的蛋白質(zhì)濃度(相當于解離常數(shù))，此時可知，TYLCV專用的ΑΖΡ-2的解離常數(shù)為0.3~InM(圖9)，雙生病毒通用的AZP-3的解離常數(shù)為〈ΙΟηΜ(圖10)。另一方面，ItepN的解離常數(shù)為30nM(圖11)。由該試驗確認到:所設(shè)計的AZP-2和AZP-3對靶DNA序列的結(jié)合力均比RepN強ο
[0109](2) AZP抑制病毒復制蛋白切斷的能力的評價
如圖12的泳道4~7所示，純化的TYLCV專用的GST-AZP (AZP-2)可有效地抑制R印對復制起點的切斷。其抑制效果依賴于AZP濃度，且在20 PM下觀察到完全抑制。另一方面，在R印的顯性失活體R印N中完全未見對切斷的抑制(圖12的泳道8~11)。RepN具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，當然DNA結(jié)合與要抑制的R印的完全相同。對于GST，如泳道12所見，完全未見切斷抑制，由此也可確認:在泳道4~7中確認的GST-AZP的切斷抑制活性全部來自于ΑΖΡ。此外，對于GST-AZP(ΑΖΡ-3)也同樣地評價了切斷抑制能力。其結(jié)果示于圖13。
[0110]參考例2
1.材料與方法 (I)AZP轉(zhuǎn)化番茄的制作 (a) AZP的植物用穩(wěn)定表達載體的制作
將編碼AFP-2的基因插入到植物基因組中是通過土壤桿菌法進行的。為了原生質(zhì)體試驗用，按照圖 14 的方法，由 pUC35S0-MCS 制備 pUC35S0_TYLCV3/4/6，用 EcoR I 和 Hind III從該質(zhì)粒中切出含有35S啟動子-AZP基因-NOS終止子的區(qū)。將片段在瓊脂糖凝膠上純化，然后克隆至雙元質(zhì)粒PBI121的EcoR I/Hind III位點，得到pBI_0TYLCV3/4/6。通過測序確認堿基序列正確。對于AZP-3也進行同樣的操作。
[0111](b)Micro-Tom 的育種
在72孔塑料托盤中裝入栽培土，用噴壺輕輕打濕土壤，然后一個一個地播種Micro-Tom種子,在其上輕輕覆蓋濕潤的土,將全體用Saran Wrap覆蓋。將該托盤在人工氣候室(光期:25°C，16小時；暗期:22°C，8小時)中培養(yǎng)。在確認發(fā)芽時除去Saran Wrap，在同一條件下繼續(xù)培養(yǎng)。播種后經(jīng)過約2周后，將苗移栽至直徑12cm的塑料花盆中，培養(yǎng)至回收種子。
[0112](c)Micro-Tom 的種的制備
回收紅色成熟的Micro-Tom的果實，在其赤道線上用刀分成兩部分，用抹刀將所有的種子回收至50ml塑料管中。用水輕輕洗滌，然后用1%鹽酸水洗滌10分鐘，使種子周圍的明膠層溶解。接著用流水將種子洗滌10分鐘，將多余的水分用紙巾吸取，然后在室溫下風干2天。干燥的種子在4°C下保存。
[0113](d)基因?qū)隡icro-Tom子葉
將10~20粒Micro-Tom種子用10%稀釋的Haiter (花王制造)殺菌，然后用無菌水洗漆4次。將該種子播種于固定有播種用培養(yǎng)基(IXMurashige-Skoog(MS)培養(yǎng)基、15g/L蔗糖、3g/L脫乙酰吉蘭糖膠)的苗木箱中，在25°C、16小時晝長條件下生長6天。將真葉達到數(shù)毫米左右的個體用于轉(zhuǎn)化。
[0114]在進行土壤桿菌感染的前一天，將20 μ L用pB1-0TYLCV3/4/6轉(zhuǎn)化的土壤桿菌C58ClRifR(GV2260)的甘油貯液接種于 2mL 的 LB 培養(yǎng)基(Kan 100mg/L、Amp 50mg/L)，在30°C下培養(yǎng)24小時。在感染當天，將ImL 土壤桿菌菌液取至Eppendorf管中，以5000rpm離心5分鐘，收集菌體。將該菌體懸浮于40mL含有100 μ M乙酰丁香酮、10 μ M的巰基乙醇的MS培養(yǎng)基中。
[0115]用刀片切取Micro-Tom的子葉，自前端至一半附近切成兩段。將這些子葉切片浸泡于上述土壤桿菌懸浮液中，靜置10分鐘使其感染。放在滅菌后的Kim紙巾(々A夕才^ )上，吸取多余的懸浮液，將葉置于共培培養(yǎng)基(1父15培養(yǎng)基、3(^/1蔗糖、38/1脫乙酰吉蘭糖膠、1.5mg/L反式玉米素、40 μ M乙酰丁香酮、0.l%MES，pH5.7)。將蓋子用外科膠帶密封，用鋁箔遮光，在25°C下培養(yǎng)。3~4天后，將感染的子葉切片轉(zhuǎn)移至愈傷組織誘導培養(yǎng)基(I XMS培養(yǎng)基、3g/L脫乙酰吉蘭糖膠、1.5 mg/L反式玉米素、100 mg/L Kan>667 mg/L安美汀(Augmentin)、0.1% MES, pH 5.7)。由感染了約2周的一部分切片中形成愈傷組織，也可見形成枝條。
[0116]每隔2周移種在新的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。由愈傷組織中切除形成了 3~4片葉的個體的子葉切片部分，轉(zhuǎn)移至枝條誘導培養(yǎng)基(SIM培養(yǎng)基，將CM培養(yǎng)基的反式玉米素濃度降至1.0mg/L),促進枝條的生長。在枝條生長至I~2cm長度時,在枝條最下端將其從愈傷組織上切離，移種于生根培養(yǎng)基(RM培養(yǎng)基，1/2 XMS培養(yǎng)基、3g/L脫乙酰吉蘭糖膠、50mg/L Kan、375mg/L安美汀、0.l%MES，pH5.7)。將在生根培養(yǎng)基中2周以內(nèi)生根的個體的根切除，移種至苗木箱內(nèi)固化的生根培養(yǎng)基中，進行生根的二次篩選。將在苗木箱中生根的個體轉(zhuǎn)移至以下的馴化步驟。
[0117]對于在最初的生根培養(yǎng)基(平板)中2周以內(nèi)未生根的個體，薄薄地切除切口，移種于新的生根培養(yǎng)基中，再次誘導生根。對于在苗木箱的生根培養(yǎng)基中可見生根的個體，為了使其結(jié)實獲得種子而植于土壤。此時，要緩慢地降低濕度進行馴化，使植物不會因濕度環(huán)境等變化而枯死。具體來說，在苗木箱中加入濕潤的土壤，在其中種植生根個體，使最初為高濕度狀態(tài)，漸漸將蓋子松開，緩慢降低濕度。將在苗木箱內(nèi)用約I個月進行充分馴化的植物種植于盆中生長。
[0118]對于第二次的生根篩選之后的植物，通過PCR確認是否導入了目標基因。切取約5mm的I片真葉，通過CTAB法提取基因組DNA。使用最終懸浮于300 μ LTE中的基因組DNA溶液中的I μ L，通過PCR法檢查基因?qū)?。作為引物，設(shè)計使用使卡那霉素抗性基因(ΝΡΤ2基因)得到擴增的引物組、和使含有人工轉(zhuǎn)錄基因和NOS終止子的區(qū)得到擴增的引物組。
[0119](e)從轉(zhuǎn)化體中提取蛋白
將轉(zhuǎn)化植物的I~2cm的葉采集至微量管中。向其中加入液氮使其冷凍，使用勻漿杵細細粉碎。液氮氣化后加入200 μ L SDS樣品緩沖液(0.125Μ Tris-HCl (pH6.8)、4%SDS、20%甘油、0.01%BPB、10% 2-ME)，進一步磨碎。在95°C下保溫10分鐘，離心，然后將上清轉(zhuǎn)移至新的微量管中。將其作為植物提取蛋白的樣品。
[0120](f)蛋白質(zhì)印跡
使用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠對提取的蛋白質(zhì)中的IyL進行電泳。同時對作為分子量標記的Perfect Protein Western Marker (Novagen制造)進行電泳。將蛋白質(zhì)由丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜，然后使用麗春紅S確認蛋白質(zhì)。將膜在封閉液(5%脫脂乳、0.05%吐溫20，PBS)中振蕩，然后使其與過氧化物酶標記-抗HA抗體反應(yīng)。作為抗分子量標記的抗體，也同時使S-蛋白 HRP反應(yīng)。使用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)使X射線膠片感光，檢測信號。由該信號的大小和信號強度驗證在轉(zhuǎn)化植物內(nèi)是否有AZP表達。
[0121](2)病毒感染實驗(a)病毒感染用質(zhì)粒的制作
病毒感染是利用土壤桿菌的感染能力來進行。為了將具有2個復制起點的病毒基因組拷貝導入雙元質(zhì)粒，對于TYLCV和TYLCV-mild這兩種，按照以下所示2個階段進行目標質(zhì)粒的制作。TYLCV-mild與TYLCV的不同在于Rep結(jié)合的同向重復序列不同，為了研究對雙生病毒的通用性而使用。
[0122]通過PCR，由TYLCV的病毒基因組DNA擴增包含復制起點的0.5個拷貝份的DNA片段，克隆至雙元質(zhì)粒PBI121的EcoR I/Hind III位點，得到pBI_TYLCV(0.5)。通過測序確認堿基序列正確。在導入TYLCV的I個拷貝份的DNA片段之際，對用PCR擴增的DNA進行克隆時，必須確認所制作的質(zhì)粒的堿基序列，但是由于目標質(zhì)粒含有1.5個拷貝的病毒基因組，因此必然存在重復的DNA區(qū)，無法通過測序確認堿基序列正確。因此，一旦在克隆質(zhì)粒pBluescript II KS+中引入I個拷貝份的病毒基因組，即確認全部堿基序列，然后不進行PCR而將用限制酶切出的DNA片段導入pBI_TYLCV(0.5)。
[0123]通過PCR，由TYLCV的病毒基因組DNA擴增包含復制起點的I個拷貝份的DNA片段，克隆至pBluescript II KS+的Pst I/Hind III位點,得到pBS-TYLCV。通過測序確認全部堿基序列正確。接著用BsrG I和Hind III從pBS-TYLCV切出病毒基因組I個拷貝份的DNA片段，在瓊脂糖凝膠上純化，然后克隆至pBI_TYLCV(0.5)的BsrG I/Hind III位點，最終得到目標質(zhì)粒pB1-TYLCV (1.5)。對于TYLCV-mild也進行同樣的操作，最終可得到目標質(zhì)粒 PB1-TYLCV-mild(1.5)。
[0124](b)病毒感染用質(zhì)粒的感染能力的確認
制作土壤桿菌C58ClRifR(GV2260)的感受態(tài)細胞。在該感受態(tài)細胞中導入所制作的具有1.5個拷貝的TYLCV基因 組或TYLCV-mild基因組的雙元載體，制作土壤桿菌接種法用的土壤桿菌的甘油貯液，保存于_80°C。在對野生型番茄進行感染的前一天，將該甘油貯液接種于6mL的LB培養(yǎng)基(Kan 100mg/L、Amp 50mg/L),在3(TC下培養(yǎng)一晝夜。接著收集土壤桿菌，懸浮于ImL緩沖液中。將該懸浮液注入到播種后約10天的苗的子葉中，使其感染。感染后定期進行植物個體的觀察以及葉中病毒DNA的檢測。用于此目的的DNA樣品的制作如上所述進行，使用對各TYLCV為特異性的引物組進行PCR，根據(jù)所得PCR產(chǎn)物的分析而在分子水平上評價病毒感染。
[0125](3) TYLCV感染抗性的評價
在來自轉(zhuǎn)化體T3的苗中注入具有病毒雙元載體的土壤桿菌的懸浮液，隨時間變化用肉眼確認感染癥狀。此外，從感染的番茄的葉中提取DNA，按照前項的方法，通過PCR驗證植物體內(nèi)病毒是否增殖。
[0126]2.結(jié)果
(I)AZP轉(zhuǎn)化番茄的制作
分別通過土壤桿菌向Micro-Tom番茄中導入AZP基因。將用圖15所示的具有各AZP表達盒的雙元載體轉(zhuǎn)化的土壤桿菌感染子葉切片，導入基因。接著，使用含有卡那霉素的培養(yǎng)基誘導愈傷組織、枝條，接著誘導根。選擇生根較深地伸入瓊脂培養(yǎng)基的個體，由此，在誘導生根時進一步篩選轉(zhuǎn)化體，馴化，然后移栽于土壤中，從而得到轉(zhuǎn)化體。
[0127]通過PCR法確認了這些轉(zhuǎn)化體Tl具有AZP基因。為了檢測卡那霉素抗性基因和AZP基因，使用圖16所示的PCR引物組(各圖中以橙色和藍色的箭頭表示)進行PCR。如圖17所示，在所得轉(zhuǎn)化體中檢出了兩者的基因，確認轉(zhuǎn)化操作順利進行。為防止萬一，還用其它的引物組確認了 AZP表達盒全部區(qū)插入到番茄基因組中(圖18:用粉色箭頭表示)。如圖19所示，確認到從35S啟動子至NOS終止子，AZP表達盒全部區(qū)均導入到植物基因組中。
[0128](2) T2和T3植物的制作和各品系的分析
對于所得Tl植物中的AZP基因的拷貝數(shù)，調(diào)查T2植物中插入了 AZP基因的個體的比例，通過卡方檢驗來鑒定。即，由各Tl品系回收T2種子，播種這些種子，通過PCR鑒定所得各T2個體中的AZP基因的有無。在導入AZP-2得到的T2植物中，各以一個品系為例示于圖19。以圖19為例，在由通過PCR法確定的Tl品系得到的T2植物的18個個體中，13個個體具有AZP基因，分離比為13:5。如果該Tl品系具有I個拷貝的AZP基因，則其分離比應(yīng)該為3:1。因此，如果通過卡方檢驗假定為I個拷貝，則卡方值為0.074，P=0.01的臨界值為6.63，因此該虛假設(shè)不能放棄。另一方面，如果假定插入了 2個拷貝，則卡方值為14.2，比臨界值大，該虛假設(shè)可放棄。由以上驗證結(jié)果可知，該Tl品系是單拷貝插入體。對其它的Tl個體也同樣進行了單拷貝插入體的篩選(圖20)。
[0129]進一步通過蛋白質(zhì)印跡確認各方法的轉(zhuǎn)化體中AZP的表達。在各方法用的AZP表達盒中，預(yù)先加有HA附加表位，使得通過使用抗HA抗體的蛋白質(zhì)印跡法，可以驗證轉(zhuǎn)化體中AZP蛋白的表達。如圖21所示，對于導入了 AFP-2的T2植物，也可確認AZP蛋白質(zhì)強烈表達。
[0130]由確認了有I個拷貝的AZP基因插入的Tl植物得到的各T2品系是純合或雜合，這通過來自各T2植物的T3苗的PCR分析確定。通過由來自各T2品系的T3苗(各品系使用約20個個體的苗) 的葉中提取的DNA樣品的PCR分析，如果確認所有苗中均具有AZP基因，則可以斷定其親本T2品系為純合(如果分離比為1: 3，則其親本T2品系為雜合)。在來自同一 T2品系的所有T3植物中均具有AZP基因，因此可知該T2品系為純合(圖22)。通過統(tǒng)計處理也確認為純合。此外，還通過蛋白質(zhì)印跡確認了 T3植物中AZP的表達(圖23)。對于使用AFP-3轉(zhuǎn)化的植物，對于來自各T2植物的T3苗也進行同樣的操作，得到了同樣的結(jié)果。
[0131][表1]



|AZP-2~
正常型Tl植物Τ?
Ii天?個拷貝的τι~2
插入多個拷貝的Tl_2_
(拷貝數(shù)未鑒定的Tl) ~Τ5)~
具有純合Τ2的Tl_6_
采蕩到純合的Τ2的Tl ~
(未鑒定純合性的Tl)I (5)
注)“具有純合的Τ2的Tl”品系表示對于所得的插入I個拷貝的Tl進行分析得到的結(jié)果。
[0132](3) TYLCV雙元質(zhì)粒的制作和感染能力的確認
驗證了是否可通過土壤桿菌接種法來使MiciO-Tom番茄感染。向多種野生型Micro-Tom中注入具有TYLCV基因組的土壤桿菌，嘗試TYLCV感染。進行了多次試驗，結(jié)果是每次均能以高效率感染。感染后約10天，在幼葉中觀察到TYLCV感染的特征性的葉的萎縮(縮退)。也進一步在生長后的個體中明確觀察到TYLCV感染的特征性癥狀即葉的卷曲或黃化。感染的個體中可見明顯的生長抑制(圖24)，開花雖然多但結(jié)實的概率顯著較低。
[0133]在分子水平上也確認了利用土壤桿菌接種法的TYLCV的感染。感染成立后，回收各階段的葉，在所有的感染的葉中，通過PCR法可檢測出TYLCV基因組DNA。此外，對于TYLCV-mild也進行同樣的試驗，但與TYLCV不同，其感染癥狀溫和。特別是感染初期的癥狀的程度是葉周邊顏色變淺，有時很難從表型(表現(xiàn)系)進行感染的判斷。因此，除了通過表型判定，通過利用PCR法在分子水平上鑒定感染個體中的TYLCV-mild的復制也可進行準確的判定。
[0134](4)通過AZP表達獲得TYLCV感染抗性
從導入AZP-2制作的Tl植物中的3個個體分別得到純合T2品系(參照表1)，再由該純合T2品系得到T3植物，與上述同樣地使其感染TYLCV。如圖25所示，在轉(zhuǎn)化番茄中未見到如在感染的野生型(圖左側(cè)的植物)中見到的葉的萎縮或黃化。進而通過PCR在分子水平上評價感染抗性。如圖26所示，在T3純合體中未檢測出病毒DNA。此外，不僅純合體，而且雜合體也未檢測出病毒DNA,未見病毒的增殖。
[0135]對于由導入AZP-3制作的Tl植物的I個個體得到的T3植物也同樣使其感染TYLCV，結(jié)果如圖27所示，在轉(zhuǎn)化番茄中未見到如在感染的野生型中見到的葉的萎縮或黃化。進而，如圖28所示，AZP-3的轉(zhuǎn)化體中也未檢測出病毒DNA。
[0136]實施例1
(I)以WDV為靶標的AZP的設(shè)計
基于日本特表2004-519211號公報所記載的識別密碼表設(shè)計分別識別以下兩種DNA區(qū)的鋅指蛋白。
a.上游側(cè)的莖區(qū)與其側(cè)翼區(qū)
b.莖環(huán)區(qū)
c.下游側(cè)的莖區(qū)與其側(cè)翼區(qū)
AZP-1l設(shè)計為:連續(xù)地連接10個鋅指結(jié)構(gòu)域而可識別圖30所示的31個堿基對。AZP-12則設(shè)計為:連續(xù)地連接12個鋅指結(jié)構(gòu)域而可識別如圖30所示的37個堿基對(其中AZP-12基于反義鏈側(cè)的序列進行設(shè)計)。AZP-13則設(shè)計為:連續(xù)地連接9個鋅指結(jié)構(gòu)域而可識別圖30所示的28個堿基對。
[0137](2) AZP表達質(zhì)粒的制作
按照圖31所示的方案制作ΑΖΡ-ll。首先通過PCR合成分別連接有3個鋅指的基因，將各基因克隆至大腸桿菌表達載體的pET-2la(Novagen社)的BamH I/Hind III位點，然后確認所得質(zhì)粒的堿基序列，由此得到pET-WDV3-l、pET- WDV3-2、和pET- WDV3-3。接著，通過PCR擴增pET- WDV3-2和pET- WDV3-3內(nèi)的3指AZP的基因并連接，最終得到pET_WDV6。制作識別5’ -GGGT-3’的鋅指基因，按照上述方法與pET-WDV3-l內(nèi)的3指AZP基因連接，由此制作PET-WDV4。最后通過PCR，由pET_WDV4和pET_WDV6分別擴增6指AZP基因和4指AZP基因并連接，由此制作編碼識別包含上游側(cè)的莖區(qū)和其側(cè)翼區(qū)的連續(xù)的31個堿基的AZP-1l 的質(zhì)粒(pET-WDVlO)。
[0138] 按照圖32所示的方案制作AZP-12。首先通過PCR合成分別連接有3個鋅指的基因，將各基因克隆至大腸桿菌表達載體的pET-2 la (Novagen社)的BamH I/Hind III位點，然后確認所得質(zhì)粒的堿基序列，由此得到pET-WDV3-4、pET-WDV3-5、pET-WDV3_6、和PET-WDV3-7。接著，通過PCR擴增pET_WDV3_4和pET_WDV3_5內(nèi)的3指AZP的基因并連接，最終得到PET-WDV6-2。此外，通過PCR擴增pET_WDV3_6和pET_WDV3_7內(nèi)的3指AZP的基因并連接，最終得到PET-WDV6-3。最后，通過PCR由pE_WDV6_2和pET-WDV6_3分別擴增6指AZP基因并連接，由此制作編碼識別包含下游側(cè)的莖區(qū)和其側(cè)翼區(qū)的連續(xù)的37個堿基的AZP-12 的質(zhì)粒(pET-WDV12)。
[0139]按照圖33所示的方案制作AZP-13。首先通過PCR合成分別連接有3個鋅指的基因，將各基因克隆至大腸桿菌表達載體的pET-21a(N0vagen社)的BamH I/Hind III位點，然后確認所得質(zhì)粒的堿基序列，由此得到pET-WDV3-8、pET-WDV3-9、和pET-WDV3-10。接著，通過PCR擴增pET-WDV3-9和pET_WDV3_10內(nèi)的3指AZP的基因并連接，最終得到pET_WDV6_4。最后通過PCR由pE-WDV6-4擴增6指AZP基因并連接，由此制作編碼識別莖環(huán)區(qū)28個堿基的 AZP-13 的質(zhì)粒(pET-WDV9)。
[0140]實施例2
1.材料與方法
(I) AZP的植物用穩(wěn)定表達載體的制作
將上述實施例1中設(shè)計的編碼AZPll和AZP12的各基因片段插入雙元載體pUBIN_ZH2的多克隆位點中的該酶切位點。雙元載體PUBIN-ZH2是在pPZP202 (P.Hajdukiewicz, Z.Svab, P.Maliga, 1994.Plant Molecular Biology 25: 989-994)的 T-DNA 部分引入在花椰菜花葉病毒35S啟動子和胭脂堿合成酶終止子之間導入有潮霉素抗性基因的盒、和在玉米泛素基因啟動子(Plant physiology Volume 100, 1992, Pages 1503-1507)和廁脂喊合成酶終止子之間具有多克隆位點的基因表達用盒而成的(圖34)。如此，制作出含有AZPll和AZP12的2種植物用穩(wěn)定表 達載體。
[0141](2)使用土壤桿菌將小麥AZP基因?qū)胄←?br> 使用上述⑴中所得轉(zhuǎn)化用載體，通過凍融法(Hofgen et al.(1998) Storageof competent cells for Agrobacterium transformation.Nucleic Acids Res.0ct25;16(20):9877)轉(zhuǎn)化土壤桿菌(LBA4404株)。進而，使用由上述方法獲得的土壤桿菌的轉(zhuǎn)化體，實施小麥(品種:Haruyokoi)的轉(zhuǎn)化。小麥的轉(zhuǎn)化采用日本專利第4754968號所記載的植物原位轉(zhuǎn)化法。
[0142](3)T0代中的基因?qū)氪_認
將上述(2)中所得的轉(zhuǎn)化處理個體移至裝有培養(yǎng)土的罐中，以23°C、長日條件(16小時光期、8小時暗期)生長。通過PCR確認目的基因?qū)肱c否。在TO代的轉(zhuǎn)化個體生長到6葉期的階段，切取約5 mm的真葉I片，通過CTAB法提取基因組DNA。使用基因組DNA溶液(IOng/1 μ L ) I μ L，通過PCR法檢查基因?qū)?。作為引物，設(shè)計并使用對包含泛素啟動子和AZP的區(qū)域進行擴增的引物組。
[0143](4) Tl代中的基因?qū)氪_認
使可確認到PCR條帶的TO代個體生長，獲得Tl種子。使所得Tl種子發(fā)芽，由生長后個體的葉提取基因組，實施PCR。方法以與上述(3)實施的方法相同的方法來實施。
[0144](5)從Tl轉(zhuǎn)化體中提取RNA、進行cDNA合成
將Tl代轉(zhuǎn)化體的葉(第I~第2葉)采集至微量管中，使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN社制)，提取總RNA。方法依照試劑盒說明書。使用所得的總RNA I μ g，通過HighCapacity RNA-to-cDNA (注冊商標)Kit ( 7 7。9 4 F /1M 才 '> 7 f Λ 文' 社制)來合成cDNA。
[0145](6) Tl代中的導入基因的表達確認(RT-PCR)
使用(5)中所制備的cDNA溶液I μ L，通過PCR法檢查導入基因表達。PCR的循環(huán)數(shù)設(shè)為30個循環(huán)。作為引物，設(shè)計使用對包含AZP的區(qū)域進行擴增的引物組。此外，通過序列分析確認所得條帶為AZP片段。
[0146]2.結(jié)果
(I)AZP轉(zhuǎn)化小麥的制作
分別通過土壤桿菌來實施AZP基因向小麥中的導入。在圖34所示的雙元載體中導入AZP基因，制備具有AZP表達盒的雙元載體，使經(jīng)該載體轉(zhuǎn)化的土壤桿菌感染小麥種子，導入基因。將轉(zhuǎn)化處理后的種子移至裝有培養(yǎng)土的罐中，以25°C、長日條件(16小時光期、8小時暗期)生長。
[0147](2)T1代中的基因?qū)氪_認
由進行了轉(zhuǎn)化處理的個體得到種子(Tl種子)并使之發(fā)芽，通過PCR法確認生長后的Tl代的個體具有AZP基因。為了擴增泛素啟動子和AZP的片段，使用圖35所示的PCR引物組進行PCR。如圖36所示，數(shù)個個體(N0.4，5，7)中檢測出了目標片段，因而可確認轉(zhuǎn)化操作良好進行。應(yīng)予說明，通過序列分析確認所得片段為泛素啟動子和AZP基因的片段。
[0148](3) Tl代中的導入基因的表達確認(RT-PCR)
進而通過RT-PCR確認各轉(zhuǎn)化體中的AZP表達。作為引物，設(shè)計使用對包含AZP的區(qū)域進行擴增的引物組(圖37)。如圖38所示，在導入有AZPll和ΑΖΡ12的Tl個體中可確認AZP有強表達。應(yīng)予說明，通過序列分析確認所得片段為AZP基因的片段。
[0149]實施例3
1.材料與方法
(I)WDV感染用質(zhì)粒的制作
感染使用了 TOV 中的 Yunnnan Kunming 型(Accession Number: EU541489)。感染用的WDV雙元質(zhì)粒的制作如下所示以3個階段進行。
[0150]首先，將WDV的I個拷貝份的DNA片段克隆至克隆質(zhì)粒pBluescript II KS+。即，通過PCR由合成DNA寡聚物重構(gòu)并合成WDV的I個拷貝份的DNA片段，然后將DNA末端用Bsa I和Hind III切斷，然后將所得DNA片段克隆至pBluescript II KS+的Acc65 I/HindIII位點，得到pBS-WDV。通過測序確認堿基序列正確。
[0151]接著，通過PCR，由pBS-WDV上的WDV的病毒基因組DNA擴增包含復制起點的0.5個拷貝份的DNA片段，克隆至雙元質(zhì)粒pBI121的Cla I/ EcoR I位點，得到pBI_WDV(0.5)。通過測序確認堿基序列正確。
[0152]在導入WDV的I個拷貝份的DNA片段之際，對用PCR擴增的DNA進行克隆時，必須確認所制作的質(zhì)粒的堿基序列，但是由于目標質(zhì)粒含有1.5個拷貝的病毒基因組，因此必然存在重復的DNA區(qū)，無法通過測序確認堿基序列正確。因此，不進行PCR而通過限制酶從制作的pBS-WDV中切出DNA片段，并將該片段導入pB1-ffDV(0.5)。即，用Bsiff I和HindIII從pBS-WDV切出病毒基因組I個拷貝份的DNA片段，在瓊脂糖凝膠上純化，然后克隆至pB1-WDV(0.5)的 Bsiff I/Hind III 位點，最終得到目標質(zhì)粒的 pB1-ffDV(l.5)。[0153](2) WDV 的感染
制作土壤桿菌C58ClRifR(GV2260)的感受態(tài)細胞。在該感受態(tài)細胞中導入所制作的具有1.5個拷貝的WDV基因組的雙元質(zhì)粒，制作土壤桿菌接種法用的土壤桿菌的甘油貯液，保存于_80°C。在對小麥進行感染的前一天，將該甘油貯液接種于6mL的LB培養(yǎng)基(Kan100mg/L、Amp 50mg/L),在3(TC下培養(yǎng)一晝夜。接著收集土壤桿菌，懸浮于ImL緩沖液中。將該懸浮液注入到播種后約20天的苗的莖中，使其感染。感染后對植物個體葉中的病毒DNA進行檢測。用于此目的的DNA樣品的制作如上所述進行,使用對WDV的Yunnnan Kunming型為特異性引物組進行的PCR，根據(jù)對PCR產(chǎn)物的分析而在分子水平上評價病毒感染。
[0154](3) WDV感染抗性的評價
由導入AZPll或AZP12基因而得的Tl轉(zhuǎn)化體獲得苗，在該苗中注入具有WDV病毒雙元質(zhì)粒的土壤桿菌的懸浮液。從感染小麥的葉中提取DNA，依照前項的方法，通過PCR驗證植物體內(nèi)病毒是否增殖。
[0155]2.結(jié)果
(I)WDV雙元質(zhì)粒的制作和病毒感染的確認
驗證了是否可通過土壤桿菌接種法來使小麥感染。向多種野生型小麥(品種:“春來^ ”)中注入具有WDV基因組的土壤桿菌，嘗試WDV感染。在土壤桿菌注入后20天回收幼葉，提取DNA。通過使用該DNA樣品的PCR法，可以在注入了土壤桿菌的野生型小麥個體中，在回收的葉中檢測WDV基因組DNA。其一例示于圖39。 [0156](2)通過AZP表達獲得WDV感染抗性
在導入AZPll或AZP12基因制作的Tl轉(zhuǎn)化體中隨機選擇3個個體，與上述相同地分別對其接種WDV，在接種后20天回收葉，通過PCR法調(diào)查WDV基因組DNA檢出與否。如圖39所示，所有轉(zhuǎn)化小麥中均為檢測出TOV病毒DNA，未見病毒的增殖。
[0157]產(chǎn)業(yè)實用性
本發(fā)明的復制抑制劑可以對屬于玉米線條病毒屬的WDV或其它病毒發(fā)揮高有效性，因而作為針對屬于玉米線條病毒屬的多種病毒的防除方法極其有用。
【權(quán)利要求】
1.復制抑制劑，其是針對屬于雙生病毒科的玉米線條病毒屬的病毒的復制抑制劑，所述復制抑制劑含有鋅指蛋白并且可以抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，所述鋅指蛋白可以與該病毒的莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自該全長DNA的I處或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合。
2.權(quán)利要求1所述的復制抑制劑，其含有可以與選自屬于玉米線條病毒屬的病毒的莖環(huán)區(qū)的全長DNA的I處的部分DNA結(jié)合的單一的鋅指蛋白。
3.權(quán)利要求1所述的復制抑制劑，其含有可以與連續(xù)DNA結(jié)合的單一的鋅指蛋白，所述連續(xù)DNA由選自屬于玉米線條病毒屬的病毒的莖環(huán)區(qū)的全長DNA的I處的部分DNA、和結(jié)合于該DNA并選自側(cè)翼區(qū)的I處的DNA構(gòu)成。
4.權(quán)利要求1至3中任一項所述的復制抑制劑，其中，上述鋅指蛋白是含有9個至12個鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白。
5.權(quán)利要求1至4中任一項所述的復制抑制劑，其中，屬于玉米線條病毒屬的病毒是小麥萎縮病病毒。
6.核酸，其編碼權(quán)利要求1至5中任一項所述的鋅指蛋白。
7.植物轉(zhuǎn)化用的重組載體，其含有權(quán)利要求6所述的核酸。
8.農(nóng)藥，其含有權(quán)利要求1至5中任一項所述的鋅指蛋白或編碼該鋅指蛋白的核酸作為有效成分。
9.預(yù)防屬于雙生 病毒科的玉米線條病毒屬的病毒所致的植物的感染的方法，其包括對植物施用預(yù)防有效量的權(quán)利要求1至5中任一項所述的鋅指蛋白或編碼該鋅指蛋白的核酸的步驟。
10.基因重組植物，其對屬于雙生病毒科的玉米線條病毒屬的病毒具有抗性，并且其可表達權(quán)利要求1至5中任一項所述的鋅指蛋白。
11.通過導入編碼權(quán)利要求1至5中任一項所述的鋅指蛋白的核酸而轉(zhuǎn)化的植物。
12.使植物獲得針對屬于雙生病毒科的玉米線條病毒屬的病毒的抗性的方法，其包括將編碼權(quán)利要求1至5中任一項所述的鋅指蛋白的核酸導入該植物進行轉(zhuǎn)化的步驟。
13.植物轉(zhuǎn)化用載體，其含有編碼權(quán)利要求1至5中任一項所述的鋅指蛋白的核酸。
【文檔編號】A01N63/00GK104011205SQ201280052566
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月27日
【發(fā)明者】世良貴史 申請人:世良貴史