T細(xì)胞受體基因修飾小鼠的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物，在其基因組中包含未經(jīng)重排的T細(xì)胞受體可變基因基因座，以及提供了包含該未經(jīng)重排的T細(xì)胞受體可變基因基因座的非人胚胎、細(xì)胞和組織。還提供了用于制備所述基因修飾的非人動(dòng)物的構(gòu)建體以及制備所述基因修飾的非人動(dòng)物的方法。本發(fā)明還提供了使用所述基因修飾的非人動(dòng)物的多種方法。
【專利說(shuō)明】T細(xì)胞受體基因修飾小鼠
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/552，582，申請(qǐng)日為2011年10月28日；美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/621，198，申請(qǐng)日為2012年4月6日和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/700，908，申請(qǐng)日為2012年9月14日的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本申請(qǐng)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及基因修飾的非人動(dòng)物例如嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)，在所述動(dòng)物的基因組中包含人源或人源化的T細(xì)胞受體(TCR)可變基因基因座(例如TCRa和TCRi^可變基因基因座和/或TCRS和TCR Y可變基因基因座)，并且表達(dá)來(lái)自人源或人源化的TCR可變基因基因座的人源或人源化的TCR多肽(例如TCRα和TCRP多肽和/或TCR δ和TCRy多肽)。具有本發(fā)明的人源或人源化的TCR可變基因基因座的非人動(dòng)物在內(nèi)源性非人源TCR基因座包含未經(jīng)重排的人源TCR可變區(qū)基因區(qū)段(例如V、D和/或J區(qū)段)。本發(fā)明還涉及胚胎、組織和細(xì)胞(例如T細(xì)胞)，其包含人源或人源化的TCR可變基因基因座并且表達(dá)人源或人源化的TCR多肽。本申請(qǐng)還提供了制備包含人源或人源化的TCR可變基因基因座的基因修飾非人動(dòng)物的方法；以及使用包含人源或人源化的TCR可變基因基因座并且表達(dá)來(lái)自這些基因座的人源或人源化的TCR多肽的非人動(dòng)物、胚胎、組織和細(xì)胞的方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，通過(guò)B淋巴細(xì)胞(例如免疫球蛋白)和T淋巴細(xì)胞(例如T細(xì)胞受體或TCR)上的受體分子識(shí)別外來(lái)抗原。血液和細(xì)胞外空間中的病原體是在體液免疫應(yīng)答過(guò)程中由抗體識(shí)別的，而在細(xì)胞內(nèi)對(duì)病原體的破壞是在細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程中由T細(xì)胞介導(dǎo)的。
[0006]T細(xì)胞識(shí)別并攻擊在主要組織相容性復(fù)合物(MHC)背景下遞呈至細(xì)胞表面上的抗原?？乖R(shí)別由T細(xì)胞表面上表達(dá)的TCR介導(dǎo)。有兩大類(lèi)T細(xì)胞具有這種功能:細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其表達(dá)細(xì)胞表面蛋白CD8，和輔助T細(xì)胞，其表達(dá)細(xì)胞表面蛋白CD4。細(xì)胞毒性T細(xì)胞活化信號(hào)級(jí)聯(lián)導(dǎo)致遞呈該抗原的細(xì)胞被直接破壞(在MHC I背景下)，而輔助T細(xì)胞分化成幾種類(lèi)型，并且其活化(在MHC II背景下通過(guò)識(shí)別遞呈的抗原而激發(fā))導(dǎo)致巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的病原體破壞和刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。
[0007] 由于其具有抗原特異性，因而目前對(duì)抗體針對(duì)多種人類(lèi)疾病的治療潛力進(jìn)行了廣泛研究。為生成能夠中和人類(lèi)靶點(diǎn)的抗體,但避免同時(shí)激活針對(duì)這種抗體的免疫應(yīng)答，科學(xué)家們集中精力在生產(chǎn)人源或人源化的免疫球蛋白上。在體內(nèi)生產(chǎn)人源化的抗體的一種方法是使用VELOCIMMUNE?小鼠，這種人源化小鼠包含(I)彼此之間可操作地連接的未經(jīng)重排的人源免疫球蛋白V、D和J區(qū)段庫(kù)，所述區(qū)段庫(kù)和小鼠恒定區(qū)位于內(nèi)源性小鼠免疫球蛋白重鏈基因座，以及(2)彼此之間可操作地連接的未經(jīng)重排的人源V K和Jk區(qū)段庫(kù)，所述區(qū)段庫(kù)和小鼠恒定K區(qū)位于內(nèi)源性小鼠免疫球蛋白K輕鏈基因座。這樣，VELOCIMMUNE?小鼠提供了用于工程化制備人源抗體的高度多樣化的重排抗體可變結(jié)構(gòu)域的豐富來(lái)源。
[0008]與抗體類(lèi)似，T細(xì)胞受體包含可變區(qū)，其由包含V(D) J可變區(qū)區(qū)段的未經(jīng)重排的基因座(α和β基因座，或者δ和Υ基因座)編碼，并且該可變區(qū)賦予了 T細(xì)胞抗原結(jié)合特異性。亦與抗體類(lèi)似，TCR對(duì)其抗原的特異性能夠用于開(kāi)發(fā)新療法。因此，在本領(lǐng)域中需要非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如大鼠或小鼠)，所述動(dòng)物包含能夠重排以形成編碼人源T細(xì)胞受體可變結(jié)構(gòu)域基因的未經(jīng)重排的人源T細(xì)胞可變區(qū)基因區(qū)段，包括彼此間同源的結(jié)構(gòu)域和與目的抗原特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。還需要一種包含T細(xì)胞可變區(qū)基因座的非人動(dòng)物，所述基因座包含保守的人源化，其包括包含未經(jīng)重排的人源基因區(qū)段的非人動(dòng)物，所述人源基因區(qū)段能夠重排以形成與非人源(內(nèi)源性)Τ細(xì)胞受體恒定基因序列連接的T細(xì)胞受體可變區(qū)基因。還需要能夠生成多樣性的人源T細(xì)胞受體可變序列庫(kù)的非人動(dòng)物。需要在對(duì)目的抗原應(yīng)答時(shí)能夠重排大部分或全部功能性T細(xì)胞受體可變區(qū)區(qū)段以形成包含完全人源可變結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞受體多肽的非人動(dòng)物。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本申請(qǐng)?zhí)峁┝朔侨藙?dòng)物例如嚙齒動(dòng)物，所述動(dòng)物包含表達(dá)在細(xì)胞免疫應(yīng)答中具有功能的人源化的分子的非人源細(xì)胞。本申請(qǐng)還提供了包含未經(jīng)重排的TCR可變基因基因座的非人動(dòng)物。本申請(qǐng)?zhí)峁┝梭w內(nèi)和體外系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含人源化的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，其中所述嚙齒動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)一種或多種人源化的免疫系統(tǒng)分子。本申請(qǐng)還提供了編碼人源化的TCR蛋白的未經(jīng)重排的人源化的TCR嚙齒動(dòng)物基因座。
[0011 ] 在一個(gè)方面，本 申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基因修飾的非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)，所述動(dòng)物在其基因組中包含(a)未經(jīng)重排的TCRd可變基因基因座，其包含與非人源(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)TCRa恒定基因序列可操作地連接的至少一個(gè)人源Va區(qū)段和至少一個(gè)人源J α區(qū)段，和/或(b)未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座，其包含與非人源(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)TCRii恒定基因序列可操作地連接的至少一個(gè)人源νβ區(qū)段、至少一個(gè)人源D β區(qū)段和至少一個(gè)人源JP區(qū)段。
[0012]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述未經(jīng)重排的TCRa可變基因基因座取代在內(nèi)源性TCR a可變基因基因座的內(nèi)源性非人源(例如嚙齒動(dòng)物)TCRα可變基因基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座取代在內(nèi)源性TCRii可變基因基因座的內(nèi)源性非人源(例如嚙齒動(dòng)物)TCRii可變基因基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述內(nèi)源性非人源(例如嚙齒動(dòng)物)Va和Ja區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的Va/Ja序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述內(nèi)源性非人源(例如嚙齒動(dòng)物)νβ、?β和JP區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的νβ/?β/Ιβ序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含缺失以使得所述動(dòng)物的基因組不包含功能性Va和功能性Ja區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含缺失以使得所述動(dòng)物的基因組不包含功能性內(nèi)源性V β、功能性內(nèi)源性D β和功能性內(nèi)源性J β區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述動(dòng)物包含全部功能性內(nèi)源性Va和Ja區(qū)段的缺失。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嚙齒動(dòng)物包含全部功能性內(nèi)源性、Di3和Ji3區(qū)段的缺失。在一些實(shí)施方式中，所述人源Va和Ja區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的V a/J α序列。在一些實(shí)施方式中，所述人源Vi3、Di3和Ji3區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的Vi3/Di3/Ji3序列。因此，在不同實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物)在T細(xì)胞表面表達(dá)包含人源可變區(qū)和非人源(例如嚙齒動(dòng)物)恒定區(qū)的T細(xì)胞受體。[0013]在一些方面，所述非人動(dòng)物的T細(xì)胞在胸腺中經(jīng)歷T細(xì)胞發(fā)育以產(chǎn)生⑶4和⑶8單陽(yáng)性T細(xì)胞。在一些方面，所述非人動(dòng)物包含正常的脾臟CD3+T細(xì)胞與總脾臟細(xì)胞的比率。在不同實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物在外周生成中心和效應(yīng)記憶T細(xì)胞群。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方式中，在本申請(qǐng)所描述的非人動(dòng)物中未經(jīng)重排的TCRa可變基因基因座包含61個(gè)人源J α區(qū)段和8個(gè)人源V α區(qū)段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在非人動(dòng)物中未經(jīng)重排的TCRa可變基因基因座包含完整的人源J α區(qū)段庫(kù)和完整的人源V α區(qū)段庫(kù)。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方式中，在本申請(qǐng)所描述的非人動(dòng)物中未經(jīng)重排的TCRP可變基因基因座包含14個(gè)人源J β區(qū)段、2個(gè)人源D β區(qū)段和14個(gè)人源V β區(qū)段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在非人動(dòng)物中未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座包含完整的人源J β區(qū)段庫(kù)、完整的人源Di3區(qū)段庫(kù)和完整的人源Vβ區(qū)段庫(kù)。
[0016]在一個(gè)附加的實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所描述的非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物)在人源化的TCR α基因座進(jìn)一步包含人源TCRS可變區(qū)段的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物)進(jìn)一步包含至少一個(gè)人源V δ、D δ和J δ區(qū)段，例如在人源化的TCR α基因座完整的人源νδ、DS和JS區(qū)段庫(kù)。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物保留內(nèi)源性非人源TCR α和/或TCRP基因座，其中所述基因座是非功能性基因座。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述非人動(dòng)物是哨齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述哨齒動(dòng)物選自小鼠和大鼠 。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述哨齒動(dòng)物是小鼠。
[0019]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的小鼠，所述小鼠在其基因組中包含(a)未經(jīng)重排的TCRa可變基因基因座，其包含與非人源(例如小鼠或大鼠)TCRa恒定基因序列可操作地連接的人源Ja區(qū)段庫(kù)和人源Va區(qū)段庫(kù)，和/或(b)未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座，其包含與非人源(例如小鼠或大鼠)TCRii恒定基因序列可操作地連接的人源
區(qū)段庫(kù)、人源Di3區(qū)段庫(kù)和人源νβ區(qū)段庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠包含完整的人源Va區(qū)段庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠包含完整的人源νβ區(qū)段庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠包含完整的人源Va區(qū)段和人源Ja區(qū)段庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠包含完整的人源Va區(qū)段和人源νβ區(qū)段庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠包含完整的人源Va、人源Ja、人源νβ、人源Ε)β和人源Ji3區(qū)段庫(kù)。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠包含至少一個(gè)內(nèi)源性小鼠Va和至少一個(gè)內(nèi)源性小鼠Ja區(qū)段，其中所述內(nèi)源性區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的V a/Ja區(qū)段，并且其還包含至少一個(gè)內(nèi)源性小鼠ViK至少一個(gè)內(nèi)源性小鼠Di3和至少一個(gè)內(nèi)源性小鼠JP區(qū)段，其中所述內(nèi)源性區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的Vi3 /Di3 /Ji3序列。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方式中，包含人源TCRa可變區(qū)區(qū)段的未經(jīng)重排的TCR α可變基因基因座取代在內(nèi)源性小鼠TCRa可變基因座的小鼠TCRa可變基因，并且包含人源TCR^可變區(qū)區(qū)段的未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座取代在內(nèi)源性小鼠TCRii可變基因座的小鼠TCR^可變基因。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Va和Ja區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的人源V a/J a序列，并且所述人源Vi3、Di3和Ji3區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的人源Vi3/Di3/Ji3序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述經(jīng)重排的人源V a/Ja序列可操作地與小鼠TCRa恒定區(qū)序列連接。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述經(jīng)重排的人源Vi3/Di3/Ji3序列可操作地與小鼠TCRii恒定區(qū)序列連接。因此，在不同實(shí)施方式中，所述小鼠在T細(xì)胞表面表達(dá)T細(xì)胞受體，其中所述T細(xì)胞受體包含人源可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠在人源化的TCRa基因座進(jìn)一步包含人源TCR δ可變區(qū)區(qū)段(例如人源VS、JS和DS區(qū)段)庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源TCRS可變區(qū)區(qū)段庫(kù)是完整的人源TCRS可變區(qū)區(qū)段庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源TCRS可變區(qū)區(qū)段在內(nèi)源性TCRa基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源TCRS可變區(qū)區(qū)段取代內(nèi)源性小鼠TCRS可變區(qū)區(qū)段。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因修飾的小鼠在T細(xì)胞表面表達(dá)包含人源可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的T細(xì)胞受體。在一個(gè)方面，所述小鼠的T細(xì)胞經(jīng)歷胸腺T細(xì)胞發(fā)育以產(chǎn)生CD4和⑶8單陽(yáng)性T細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述小鼠包含正常的脾臟⑶3+Τ細(xì)胞與總脾臟細(xì)胞的比率；在一個(gè)方面，所述小鼠針對(duì)目的抗原產(chǎn)生中心和效應(yīng)記憶T細(xì)胞群。
[0025]本申請(qǐng)還提供了制備本申請(qǐng)所述的基因修飾的非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)的方法。
[0026]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備人源化的嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)的方法，所述方法包括在內(nèi)源性嚙齒動(dòng)物TCR基因座用人源未經(jīng)重排的TCRa和TCRii可變區(qū)區(qū)段取代嚙齒動(dòng)物TCRa和TCRii可變區(qū)區(qū)段，而非嚙齒動(dòng)物恒定基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包含用人源TCRa可變區(qū)區(qū)段(Va和/或Ja)取代嚙齒動(dòng)物TCRa可變區(qū)區(qū)段(Va和/或Ja)，其中所述TCRa可變區(qū)區(qū)段可操作地與非人源TCR恒定區(qū)基因連接以形成人源化的TCRa基因座，以及用人源TCRii可變區(qū)區(qū)段(νβ和/或Di3和/或J3)取代嚙齒動(dòng)物TCRii可變區(qū)區(qū)段(νβ和/或Di3和/或Ji3)，其中所述TCRii可變區(qū)區(qū)段可操作地與非人源TCR恒定區(qū)基因連接以形成人源化的TCRii基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源化的嚙齒動(dòng) 物是小鼠并且所述小鼠的種系包含在內(nèi)源性TCRa基因座可操作地與內(nèi)源性小鼠TCRa恒定序列連接的人源TCRa可變區(qū)區(qū)段；并且所述小鼠的種系包含在內(nèi)源性TCRii基因座可操作地與內(nèi)源性小鼠TCRii恒定序列連接的人源TCRii可變區(qū)區(qū)段。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備基因修飾的非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)的方法，所述動(dòng)物在T細(xì)胞表面表達(dá)包含人源或人源化的可變區(qū)和非人源(例如嚙齒動(dòng)物)恒定區(qū)的T細(xì)胞受體，所述方法包括:在第一非人動(dòng)物的內(nèi)源性非人源TCRa可變基因基因座用未經(jīng)重排的人源化的TCRα可變基因基因座取代內(nèi)源性非人源TCRa可變基因基因座，所述人源化的TCR α可變基因基因座包括至少一個(gè)人源V α區(qū)段和至少一個(gè)人源J α區(qū)段，其中所述人源化的TCRa可變基因基因座可操作地與內(nèi)源性非人源TCRa恒定區(qū)連接；在第二非人動(dòng)物的內(nèi)源性非人源TCRii可變基因基因座用未經(jīng)重排的人源化的TCRii可變基因基因座區(qū)段取代內(nèi)源性非人源TCRii可變基因基因座，所述人源化的TCRii可變基因基因座包括至少一個(gè)人源νβ區(qū)段、至少一個(gè)人源Ε)β區(qū)段和至少一個(gè)人源JP區(qū)段，其中所述人源化的TCRii可變基因基因座可操作地與內(nèi)源性TCRii恒定區(qū)連接；以及將所述第一和第二非人動(dòng)物交配以獲得表達(dá)包含人源或人源化可變區(qū)和非人源恒定區(qū)的T細(xì)胞受體的非人動(dòng)物。
[0028]在所述方法的一個(gè)實(shí)施方式中，所述內(nèi)源性非人源(例如嚙齒動(dòng)物)Va和Ja區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的Va/Ja序列并且所述內(nèi)源性非人源(例如嚙齒動(dòng)物)νβ、Di3和JP區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的Vi3/Di3/Ji3序列。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Va和Ja區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的Va/Ja序列并且所述人源V β、D β和J3區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的Vi3/Di3/Ji3序列。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方式中，所述未經(jīng)重排的人源化的TCRa可變基因基因座包含61個(gè)人源Ja區(qū)段和8個(gè)人源V α區(qū)段，以及所述未經(jīng)重排的人源化的TCRii可變基因基因座包含14個(gè)人源Vβ區(qū)段、2個(gè)人源Di3區(qū)段和14個(gè)人源Ji3區(qū)段。在所述方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述未經(jīng)重排的人源化的TCRa可變基因基因座包含完整的人源Ja區(qū)段庫(kù)和完整的人源Va區(qū)段庫(kù)，以及所述未經(jīng)重排的人源化的TCRii可變基因基因座包含完整的人源Vi3區(qū)段庫(kù)、完整的人源Di3區(qū)段庫(kù)和完整的人源JP區(qū)段庫(kù)。
[0029]在所述方法的一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物)的T細(xì)胞經(jīng)歷胸腺T細(xì)胞發(fā)育以產(chǎn)生CD4和CD8單陽(yáng)性T細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物)包含正常的脾臟CD3+T細(xì)胞與總脾臟細(xì)胞的比率。在一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物)針對(duì)目的抗原生成中心和效應(yīng)記憶T細(xì)胞群。
[0030]在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的內(nèi)源性非人源TCRa可變基因基因座的取代在單個(gè)ES細(xì)胞中進(jìn)行，并且將所述單個(gè)ES細(xì)胞引入非人源(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)胚胎以制備基因修飾的非人動(dòng)物(即，第一非人動(dòng)物，例如第一嚙齒動(dòng)物)；以及本申請(qǐng)所述的內(nèi)源性非人源TCRii可變基因基因座的取代在單個(gè)ES細(xì)胞中進(jìn)行，并且將所述單個(gè)ES細(xì)胞引入非人源(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)胚胎以制備基因修飾的非人動(dòng)物(即，第二非人動(dòng)物，例如第二哨齒動(dòng)物)。在一個(gè)實(shí)施方式中，將所述第一哨齒動(dòng)物和第二嚙齒動(dòng)物交配以形成子代，其中所述子代在其種系中包含人源化的TCRa可變基因座和人源化的TCRii可變基因座。
[0031]在所述方法的一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物例如小鼠。因此，本發(fā)明還提供了一種制備基因修飾的小鼠的方法。
[0032] 本申請(qǐng)還提供了一種來(lái)源于本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)的細(xì)胞，例如分離的T細(xì)胞(例如細(xì)胞毒性T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞等)。本申請(qǐng)還提供了來(lái)源于本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的組織和胚胎。
[0033]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備人源TCR可變結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包含如本申請(qǐng)所述的將嚙齒動(dòng)物進(jìn)行基因修飾使其包含人源化的TCR α基因座和/或人源化的TCR^基因座，將所述嚙齒動(dòng)物保持在足以形成T細(xì)胞的條件下，其中所述T細(xì)胞表達(dá)人源TCRa和/或人源TCRii可變結(jié)構(gòu)域。
[0034]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備編碼與目的表位結(jié)合的人源TCR可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列的方法，所述方法包括將如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物與目的表位接觸，使所述非人動(dòng)物保持在足以使所述動(dòng)物將目的表位遞呈至動(dòng)物的人源化的TCR上的條件下，并且鑒定所述動(dòng)物編碼與目的表位結(jié)合的人源TCR可變結(jié)構(gòu)域多肽的核酸。
[0035]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藢⑷绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物用于制備人源化的TCR受體的用途。在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藢⑷绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物用于制備人源TCR可變結(jié)構(gòu)域的用途。在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藢⑷绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物用于制備編碼人源TCR可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列的用途。
[0036]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝司幋a人源TCR可變結(jié)構(gòu)域或其片段的核酸序列用于制備抗原結(jié)合蛋白的用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合蛋白包含TCR可變結(jié)構(gòu)域，其包含與目的抗原結(jié)合的人源TCRa和/或人源TCRP可變結(jié)構(gòu)域。
[0037]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物用于制備在其表面上表達(dá)人源化的T細(xì)胞受體的非人源細(xì)胞的用途。
[0038]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藖?lái)自如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的人源化的T細(xì)胞受體。
[0039]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝嗽谌绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物中制備的編碼人源TCR可變結(jié)構(gòu)域或其片段的核酸序列。
[0040]本申請(qǐng)所述的任何實(shí)施方式和方面均可以彼此結(jié)合使用，除非另有說(shuō)明或在上下文中是顯而易見(jiàn)的。通過(guò)對(duì)隨后的詳細(xì)描述的綜述其他實(shí)施方式對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見(jiàn)的。下文的詳細(xì)描述包括對(duì)本發(fā)明不同實(shí)施方式的示例性描述，其對(duì)所主張的發(fā)明不具有限制性。附圖構(gòu)成了本說(shuō)明書(shū)的一部分，其與說(shuō)明書(shū)一起僅用于展示實(shí)施方式，而不是限制本發(fā)明。
[0041]附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0042]圖1描述了 在小鼠中TCR分子和MHC分子之間的相互作用:左圖顯示了人源化的TCR小鼠的小鼠T細(xì)胞(上)，其包含具有人源可變TCR結(jié)構(gòu)域和小鼠恒定TCR結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞受體，
[0043]其識(shí)別由抗原遞呈細(xì)胞(下)通過(guò)MHC I類(lèi)分子遞呈的抗原(灰色的球)；右圖顯示了通過(guò)MHCII類(lèi)分子遞呈的相同過(guò)程。MHC I和MHC II復(fù)合物與其各自的輔助受體⑶8和⑶4 一起顯示。小鼠區(qū)用黑色表示和人源區(qū)用白色表示。
[0044]圖2描述了(未按照比例)小鼠(上圖，第一基因座)和人源(上圖，第二基因座)TCRa基因座的一般組織結(jié)構(gòu)。下圖展示了在14號(hào)染色體的內(nèi)源性小鼠基因座用人源TCRa可變區(qū)區(qū)段(空心符號(hào))取代小鼠中(實(shí)心符號(hào))的TCRa可變區(qū)區(qū)段的策略；具有人源Va和Ja區(qū)段的人源化的TCRa基因座與小鼠恒定區(qū)和小鼠增強(qiáng)子在圖中一起顯示；在所顯示的實(shí)施方式中，TCRS基因座在人源化過(guò)程中缺失。
[0045]圖3描述了(未按照比例)將小鼠TCR α基因座逐步人源化的策略，其中TCR α可變區(qū)基因區(qū)段被順序添加至初始人源化的缺失的小鼠基因座(MAID1540)的上游。小鼠序列以實(shí)心符號(hào)表示；人源序列以空心符號(hào)表示。MAID指代經(jīng)修飾的等位基因ID編號(hào)。TRAV=TCR V α 區(qū)段，TRAJ = TCR J α 區(qū)段(hTRAJ =人源 TRAJ)，TRAC = TCR C α 結(jié)構(gòu)域，TCRD=TCR δ。
[0046]圖4是對(duì)在TCRa基因座逐步人源化策略的詳細(xì)描述(未按照比例)。圖4Α描述了小鼠TCRa V和J區(qū)段的缺失過(guò)程；圖4Β描述了將2V和61J人源區(qū)段插入缺失的小鼠TCRa基因座的策略；圖4C描述了插入附加人源V區(qū)段的策略，導(dǎo)致產(chǎn)生共計(jì)8個(gè)V和61個(gè)J人源區(qū)段；圖4D描述了插入附加人源V區(qū)段的策略，導(dǎo)致產(chǎn)生共計(jì)23個(gè)V和61個(gè)J人源區(qū)段；圖4Ε描述了導(dǎo)致產(chǎn)生35個(gè)V和61個(gè)J人源區(qū)段的附加人源V區(qū)段的插入的策略；圖4F描述了導(dǎo)致產(chǎn)生48個(gè)V和61個(gè)J人源區(qū)段的附加人源區(qū)段的插入的策略；和圖4G描述了導(dǎo)致產(chǎn)生54個(gè)V和61個(gè)J人源區(qū)段的附加人源區(qū)段的插入的策略。MAID指代經(jīng)修飾的等位基因ID編號(hào)。
[0047]圖5描述了(未按照比例)小鼠TCRa基因座人源化策略的一個(gè)實(shí)施方式，其中人源 TCR δ 序列(TCR δ Vs、TCR δ Ds、TCR δ Js、TCR δ enh (增強(qiáng)子)和 TCR δ 恒定(C))也位于人源化的TCRa基因座。小鼠序列以實(shí)心符號(hào)表不；人源序列以空心符號(hào)表不。LTVEC表示較大的靶向載體；hTRD =人源TCR δ。
[0048]圖6描述了(未按照比例)小鼠(上圖，第一基因座；在小鼠6號(hào)染色體上)和人源(上圖，第二基因座；在人7號(hào)染色體上)TCRii基因座的一般組織結(jié)構(gòu)。下圖展示了在小鼠6號(hào)染色體的內(nèi)源性小鼠基因座用人源TCRP可變區(qū)區(qū)段(空心符號(hào))取代小鼠中(實(shí)心符號(hào))的TCRii可變區(qū)區(qū)段的策略。具有人源Vi3，Di3，and Ji3區(qū)段的人源化的TCR^基因座與小鼠恒定區(qū)和小鼠增強(qiáng)子在圖中一起顯示；在所顯示的實(shí)施方式中，所述人源化的基因座保留了小鼠胰蛋白酶原基因(實(shí)心長(zhǎng)方形)；以及在所顯示的特定實(shí)施方式中，在5’小鼠胰蛋白酶原基因上游保留了單一小鼠V區(qū)段。
[0049]圖7描述了(未按照比例)將小鼠TCRP基因座逐步人源化的策略，其中TCR^可變區(qū)基因區(qū)段被順序添加至缺失的小鼠TCRii可變基因座。小鼠序列以實(shí)心符號(hào)表示；人序列以空心符號(hào)表示。MAID指代經(jīng)修飾的等位基因ID編號(hào)。TRBV或TCRBV = TCRP V區(qū)段。
[0050]圖8是對(duì)在TCRP基因座逐步人源化策略的詳細(xì)描述。圖8A描述了小鼠TCR^ V區(qū)段缺失的策略；圖8B描述了將14個(gè)V區(qū)段插入缺失的TCRii基因座的策略；圖8C描述了將2個(gè)D和14個(gè)J區(qū)段插入TCRii基因座(i)的策略，隨后1xP位點(diǎn)缺失(ii)，導(dǎo)致產(chǎn)生14個(gè)V、2個(gè)D和14個(gè)J人源區(qū)段；圖80描述了導(dǎo)致產(chǎn)生40個(gè)V、2個(gè)D和14個(gè)J人源區(qū)段的附加人源V區(qū)段的插入的策略；和圖SE描述了導(dǎo)致產(chǎn)生66個(gè)V、2個(gè)D和14個(gè)J人源區(qū)段的附加人源V區(qū)段的插入的策略；圖8F描述了對(duì)小鼠增強(qiáng)子下游的小鼠V區(qū)段的取代，導(dǎo)致產(chǎn)生67個(gè)V、2個(gè)D和14個(gè)J人源區(qū)段。在這個(gè)特定的實(shí)施方式中，一個(gè)小鼠V區(qū)段是保留的小鼠胰蛋白酶原基因的5’端。
[0051]圖9描述了使用抗-CD3抗體染色的脾細(xì)胞百分率的典型FACS分析直方圖(其中Y軸是細(xì)胞數(shù)，X軸是平均熒光強(qiáng)度，以及分子?xùn)棚@示了在單一淋巴細(xì)胞群中CD3+T細(xì)胞的頻率)。其中所包括的小鼠種類(lèi)有:野生型(WT)小鼠、缺失TCRa基因座的純合子小鼠(第一幅上圖；圖3的MAID1540);缺失TCRa基因座且包含8個(gè)人源Va和61個(gè)人源Ja區(qū)段的純合子小鼠(第二幅上圖；圖3的MAID1767或人源化的TCRa小鼠)；除了一個(gè)上游和一個(gè)下游小鼠νβ區(qū)段以外缺失了 TCRii基因座的純合子小鼠(第一幅下圖；圖7的MAID1545);缺失了除一個(gè)上游和一個(gè)下游小鼠V β區(qū)段外的TCRP基因座且包含14個(gè)人源νβ、2個(gè)人源Di3和14個(gè)人源Ji3區(qū)段的純合子小鼠(第二幅下圖；圖7的MAID1716或人源化的TCRP小鼠)以及TCRa和TCRi^基因座缺失(除了所述的兩個(gè)小鼠νβ區(qū)段以外)且在內(nèi)源性TCRa基因座包含8個(gè)人源V α和61個(gè)人源J α區(qū)段以及在內(nèi)源性TCRii基因座包含14個(gè)人源Vβ、2個(gè)人源D β和14個(gè)人源Ji3區(qū)段的純合子小鼠(MAID1767/1716或人源化的TCRa/β小鼠)。
[0052] 圖10是來(lái)自使用抗-⑶4 (Y軸)和抗-⑶8 (X軸)抗體(上圖)以及抗-⑶44 (Y軸)和抗_CD25(X軸)抗體(下圖)染色的WT、人源化的TCR α純合子(1767H0 ;hTCRa)、人源化的TCR^純合子(1716H0 ；hTCR^)和人源化的TCRa/β純合子小鼠(1716Η01767Η0 ；hTCRa/β)的小鼠胸腺細(xì)胞的典型FACS等高線圖。在上圖中的FACS曲線能夠區(qū)分雙陰性(DN)、雙陽(yáng)性(DP)、CD4單陽(yáng)性(CD4SP)和CD8單陽(yáng)性(SP CD8)T細(xì)胞。在下圖中的FACS曲線能夠區(qū)分在T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中不同階段的雙陰性T細(xì)胞(DN1、DN2、DN3和DN4)。1716和1767指代圖3和圖7中指定的MAID編號(hào)。
[0053]圖 11 表示在 WT、hTCRa (1767H0) ；hTCR^ (1716H0)或 hTCRa/β (1716H01767H0)小鼠(η = 4)的胸腺中DN、DP、CD4SP和CD SP T細(xì)胞的頻率(上圖)或絕對(duì)數(shù)量(下圖)。
[0054]圖 12 是 WT、hTCRa (1767H0)、hTCR β (1716Η0)或 hTCRa/β (1716Η01767Η0)小鼠脾細(xì)胞的典型FACS分析:左圖表示基于抗-⑶19抗體(Y軸；對(duì)8淋巴細(xì)胞染色)或抗-⑶3抗體(X軸淋巴細(xì)胞染色)染色的單細(xì)胞的分析；中圖表示基于抗-CD4 (Y軸)或抗-CD8(X軸)抗體染色的CD3+細(xì)胞的分析和右圖表示基于抗-CD44(Y軸)或抗_CD62L(X軸)抗體染色的CD4+或CD8+細(xì)胞的分析，所述染色能夠區(qū)分外周不同類(lèi)型的T細(xì)胞(初始T細(xì)胞vs.中心記憶T細(xì)胞(Tcm) vs.效應(yīng)或效應(yīng)記憶T細(xì)胞(Teff/Tem))。
[0055]圖 13 表示了 WT、hTCRa (1767H0)、hTCR β (1716Η0)或 hTCRa/β (1716Η01767Η0)小鼠(η = 4)每個(gè)脾臟(Y軸)中CD4+(左圖)或CD8+(右圖)T細(xì)胞的數(shù)量。
[0056]圖 14 表示了 WT、hTCRa (1767H0)、hTCR β (1716Η0)或 hTCRa/β (1716Η01767Η0)小鼠(η = 4)每個(gè)脾臟(Y軸)的CD4+(上圖)或CD8+(下圖)T細(xì)胞中T初始、Tcm和Teff/em細(xì)胞的數(shù)量。
[0057]圖15 為匯總了在 WT、hTCRP (1716H0)或 hTCRa /β (1716Η01767Η0)小鼠的脾臟CD8+T細(xì)胞(圖15Α)或CD4+T細(xì)胞(圖15Β)中不同人源TCRP V區(qū)段的表達(dá)情況(使用可變區(qū)段特異性抗體通過(guò)FACS分析確定)的表格。數(shù)據(jù)以平均值土SD表示(η = 4只小鼠每組)。 [0058]圖16描述了在胸腺或脾臟T細(xì)胞中存在于WT、hTCRa (1767H0) ;hTCR@ (1716H0)或hTCRa/β (1716H01767H0)小鼠的的不同人源TCR β V區(qū)段mRNA的表達(dá)情況(Y軸)；圖16A表示對(duì)人源TCRP可變區(qū)段(hTRBV)18、19、20和24mRNA表達(dá)情況的分析和圖16B表示對(duì)hTRBV25、27、28和29mRNA表達(dá)情況的分析。
[0059]圖17描述了使用抗-CD3抗體染色的脾細(xì)胞(其中Y軸是細(xì)胞數(shù)，X軸是平均熒光強(qiáng)度和分子?xùn)棚@示了在單一淋巴細(xì)胞群中CD3+T細(xì)胞的頻率)的典型FACS直方圖。其中所包括的小鼠有:WT小鼠、缺失TCRa基因座的純合子小鼠(TCRAAV)、缺失TCRa基因座且具有2個(gè)人源V區(qū)段和61個(gè)人源J區(qū)段的純合子小鼠(TCRA2hV ;圖3的MAID1626)、缺失TCR α基因座且具有8個(gè)人源V區(qū)段和61個(gè)人源J區(qū)段的純合子小鼠(TCRA8hV;圖3的MAID1767)以及缺失TCRa基因座且具有23個(gè)人源V區(qū)段和61個(gè)人源J區(qū)段的純合子小鼠(TCRA23hV ;圖 3 的 MAID1979)。。
[0060]圖18，左上圖，是使用抗-⑶4 (Y軸)或抗-⑶8 (X軸)抗體染色的從WT或具有23個(gè)人源V區(qū)段和61個(gè)人源J區(qū)段的純合hTCRa小鼠(1979H0)獲得的胸腺的CD3+T細(xì)胞典型FACS分析；左下圖是抗-⑶44 (Y軸)或抗-⑶25 (X軸)染色的來(lái)自WT或1979小鼠的DN T細(xì)胞的FACS分析；右圖是表示在WT或1979H0小鼠(η = 4)中DN、DP、CD4SP或CD8SP的胸腺細(xì)胞的百分率(Y軸)的圖。
[0061]圖19，左圖是使用抗-⑶19或抗-⑶3抗體染色的來(lái)自WT或1979HO小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞的典型FACS分析；右圖是表示從WT和1979H0小鼠(η = 4)獲得的⑶3+的脾臟細(xì)胞百分率(Y軸)的圖。
[0062]發(fā)明詳述[0063]定義
[0064]本發(fā)明提供了基因修飾的非人動(dòng)物，例如嚙齒動(dòng)物例如小鼠或大鼠，其表達(dá)人源化的T細(xì)胞受體。本發(fā)明還涉及基因修飾的非人動(dòng)物，所述動(dòng)物在其種系中包含未經(jīng)重排的T細(xì)胞受體可變基因基因座。本申請(qǐng)還提供了包含其的胚胎、細(xì)胞和組織；制備其的方法；以及使用其的方法。除非另有定義，否則本申請(qǐng)使用的所有術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)包括所述術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)在本領(lǐng)域中所具有的含義，除非有相反的明確說(shuō)明或根據(jù)使用所述術(shù)語(yǔ)或短語(yǔ)的上下文是顯而易見(jiàn)的。
[0065]當(dāng)用于描述保守的氨基酸取代時(shí)，術(shù)語(yǔ)“保守的”包括氨基酸殘基被另一個(gè)具有帶有相似化學(xué)特性(例如電荷或疏水性)的側(cè)鏈R基的氨基酸殘基取代。保守的氨基酸取代可以通過(guò)修飾核苷酸序列來(lái)實(shí)現(xiàn)以引入將會(huì)編碼保守取代的核苷酸變化。在通常情況下，保守的氨基酸取代將基本上不會(huì)改變目的蛋白的功能性特性，例如T細(xì)胞識(shí)別由MHC分子遞呈的肽的能力。具有帶有相似化學(xué)特性的側(cè)鏈的氨基酸基團(tuán)的例子包括脂肪族側(cè)鏈如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；脂肪族-羥基側(cè)鏈如絲氨酸和蘇氨酸；含有酰胺的側(cè)鏈如天冬酰胺和谷胺酰胺；芳香側(cè)鏈如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；堿性側(cè)鏈如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；酸性側(cè)鏈如天冬氨酸和谷氨酸；和含硫側(cè)鏈如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守的氨基酸取代基團(tuán)包括例如纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、賴氨酸/精氨酸、丙氨酸/纈氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些實(shí)施方式中，保守的氨基酸取代可以是蛋白中的任意天然殘基被丙氨酸取代，例如用于丙氨酸掃描誘變。在一些實(shí)施方式中，制備在PAM2501og-似然性矩陣中具有正值的保守取代，如Gonnet等，((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science256:1443-45)所公開(kāi)的，其通過(guò)引用并入本申請(qǐng)。在一些實(shí)施方式中，所述取代是適度的保守取代，其中所述取代在PAM2501og-似然性矩陣中具有非負(fù)值。
[0066]因此，本發(fā)明還包 括一種基因修飾的非人動(dòng)物，所述動(dòng)物表達(dá)人源化的TCRa和β多肽(和/或人源化的TCRS和TCR Y多肽)，其中所述多肽包含本申請(qǐng)所述的氨基酸序列的保守氨基酸取代。
[0067]本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，除了本申請(qǐng)所述的編碼人源化的TCRa和β多肽的核酸殘基以外，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，其他核酸也可以編碼本發(fā)明的多肽。因此，除了在其基因組中包含編碼人源化的TCR多肽的核苷酸序列的基因修飾非人動(dòng)物以外，本申請(qǐng)還提供了由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性使得在其基因組包含不同于本申請(qǐng)所述的核酸序列的非人動(dòng)物。
[0068]術(shù)語(yǔ)“同一性”當(dāng)與序列一起使用時(shí)包括由本領(lǐng)域公知的能夠用于測(cè)定核苷酸和/或氨基酸序列同一性的多種不同算法所確定的同一性。在本申請(qǐng)所述的一些實(shí)施方式中，使用 open gap 罰分為 10.0 和 extend gap 罰分為 0.1 的 ClustalW V.1.83 (slow)算法和使用Gonnet相似性矩陣(MacVector?10.0.2, MacVector Inc., 2008)石角定同一性。用于序列同一性比較的序列的長(zhǎng)度取決于特定的序列。在不同實(shí)施方式中，通過(guò)從其N(xiāo)末端至C末端對(duì)成熟蛋白的序列進(jìn)行比較確定同一性。在不同實(shí)施方式中，當(dāng)將人源/非人源嵌合序列與人序列進(jìn)行比較時(shí)，將所述人源/非人源嵌合序列的人源部分(而不是非人源部分)用于比較，以確定人源序列和人源/非人源嵌合序列的人源部分之間的同一性水平(例如對(duì)人源/小鼠嵌合蛋白的人源胞外域與人源蛋白的人源胞外域進(jìn)行比較)。
[0069]關(guān)于序列的術(shù)語(yǔ)“同源性”或“同源的”，例如核苷酸或氨基酸序列，是指的兩條序列經(jīng)最佳排列對(duì)齊和比較，具有至少約75%的核苷酸或氨基酸、至少約80%的核苷酸或氨基酸、至少約90-95 %的核苷酸或氨基酸，例如超過(guò)97 %的核苷酸或氨基酸是相同的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，對(duì)于最佳基因靶向而言，靶向構(gòu)建體應(yīng)含有與內(nèi)源性DNA序列同源的臂(即“同源臂”)；因此，在靶向構(gòu)建體與被靶向的內(nèi)源性序列之間能夠發(fā)生同源重組。
[0070]術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指并列，其中被這樣描述的組分處于允許其以預(yù)計(jì)方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。由此，編碼蛋白的核酸序列可以可操作地與調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子序列等)連接，以 保留合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，本發(fā)明的人源化的蛋白的不同部分可以可操作地與細(xì)胞中保留合適的折疊、加工、靶向、表達(dá)和其他功能特性的蛋白連接。除非另有明示，本發(fā)明的人源化的蛋白的不同結(jié)構(gòu)域彼此之間被可操作地連接。
[0071]關(guān)于基因取代的術(shù)語(yǔ)“取代”指在內(nèi)源性遺傳基因座放入外源性遺傳物質(zhì)，以用直系同源或同源核酸序列取代全部或部分內(nèi)源性基因。在一個(gè)例子中，內(nèi)源性非人源基因或其片段被相應(yīng)的人源基因或其片段取代。相應(yīng)的人源基因或其片段是所取代的內(nèi)源性非人基因或其片段的直系同源物、同源物或在結(jié)構(gòu)和/或功能上與其基本相同或相同的人源基因或其片段。如下文中的實(shí)施例所示，內(nèi)源性非人源TCRa和β可變基因基因座的核苷酸序列被與人源TCRa和β可變基因基因座對(duì)應(yīng)的核苷酸序列取代。
[0072]如本申請(qǐng)所使用的“功能性”，例如功能性蛋白，指保留通常與天然蛋白相關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)生物活性的蛋白。例如，在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在內(nèi)源性基因座的取代(例如在內(nèi)源性非人源TCRa、TCRi3、TCRS和/或TCR Y可變基因基因座的取代)使得基因座無(wú)法表達(dá)功能性內(nèi)源性蛋白。
[0073]如本申請(qǐng)所使用的TCR基因座或TCR基因基因座(例如TCR α基因座或TCR^基因座)指包含TCR編碼區(qū)的基因組DNA，其包括整個(gè)TCR編碼區(qū)，包括未經(jīng)重排的V (D) J序列、增強(qiáng)子序列、恒定序列和任意上游或下游(UTR、調(diào)控區(qū)等)或介于中間的DNA序列(內(nèi)含子等)。TCR可變基因座或TCR可變基因基因座(例如TCRa可變基因基因座或TCRi^可變基因基因座)指包含包括TCR可變區(qū)區(qū)段(V(D)J區(qū))但不包括TCR恒定序列的區(qū)域的基因組DNA，并且在不同實(shí)施方式中，不包含增強(qiáng)子序列。出于基因操作(例如選擇性表達(dá)盒、限制性位點(diǎn)等)的目的其他序列可以包括在TCR可變基因基因座中，并且這些包括在本申請(qǐng)中。
[0074]基因修飾的TCR動(dòng)物
[0075]在不同實(shí)施方式中，本發(fā)明通常提供了基因修飾的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物在其基因組中包含未經(jīng)重排的人源化的TCR可變基因基因座。
[0076]T細(xì)胞結(jié)合與主要組織相容性復(fù)合物(MHC ;在小鼠中)或人白細(xì)胞抗原(HLA ;在人中)復(fù)合物結(jié)合的抗原遞呈細(xì)胞表面上的小抗原決定簇上的表位。T細(xì)胞通過(guò)T細(xì)胞表面上的T細(xì)胞受體(TCR)復(fù)合物與這些表位結(jié)合。T細(xì)胞受體是由兩種類(lèi)型的鏈組成的異二聚體結(jié)構(gòu):a (alpha)和β (beta)鏈,或者Y (gamma)和δ (delta)鏈。α鏈?zhǔn)怯晌挥讦粱蜃?在人或小鼠14號(hào)染色體上)內(nèi)的核酸序列編碼的，其也包括整個(gè)δ基因座，并且β鏈?zhǔn)怯晌挥讦禄蜃?在小鼠6號(hào)染色體或人7號(hào)染色體上)內(nèi)的核酸序列編碼的。大多數(shù)T細(xì)胞具有α β TCR ;而少數(shù)T細(xì)胞具有Y δ TCR0 TCR與MHC I類(lèi)(遞呈至⑶8+Τ細(xì)胞)和MHC II類(lèi)(遞呈至CD4+T細(xì)胞)分子之間的相互作用見(jiàn)圖1 (實(shí)心符號(hào)表示非人源序列；空心符號(hào)表示人源序列，顯示了本發(fā)明TCR蛋白的一個(gè)特定實(shí)施方式)。[0077]T細(xì)胞受體α和β多肽(以及類(lèi)似地Y和δ多肽)通過(guò)二硫鍵彼此連接。組成TCR的兩個(gè)多肽中的每一個(gè)均含有胞外結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)構(gòu)域包含恒定和可變區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾(跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾也是恒定區(qū)的一部分)。TCR的可變區(qū)決定其抗原特異性，并且與免疫球蛋白類(lèi)似，其包含3個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。亦與免疫球蛋白基因類(lèi)似，T細(xì)胞受體可變基因基因座(例如TCRa和TCRii基因座)含有多個(gè)未經(jīng)重排的V (D) J片段(可變(V)、連接(J)以及在TCRP和δ中的多樣性⑶區(qū)段)。在胸腺中的T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，TCRa可變基因基因座經(jīng)歷重排，以使得所得到的TCRa鏈由VJ區(qū)段的特定組合(Va/Ja序列)編碼；以及TCRii可變基因基因座經(jīng)歷重排，以使得所得到的TCR β鏈由VDJ區(qū)段的特定組合(V β /D β /J β序列)編碼。
[0078]與胸腺基質(zhì)的相互作用觸發(fā)胸腺細(xì)胞經(jīng)歷若干發(fā)育階段，其特征為表達(dá)不同細(xì)胞表面標(biāo)記物。在胸腺中不同發(fā)育階段特征性細(xì)胞表面標(biāo)記物的概述見(jiàn)表1。在TCRii可變基因基因座的重排始于DN2階段并且在DN4階段結(jié)束，而TCRa可變基因基因座的重排發(fā)生在DP階段。在TCRii基因座重排完成后，所述細(xì)胞在細(xì)胞表面表達(dá)TCRii鏈以及替代性a 鏈 pT a。參見(jiàn) Janeway’ s Immunobiology,第 7 章，如上所述。
[0079]表1:在胸腺中T細(xì)胞的發(fā)育階段
[0080]
【權(quán)利要求】
1.一種基因修飾的非人動(dòng)物，在其基因組中包含: 未經(jīng)重排的T細(xì)胞受體(TCR) α可變基因基因座，其包括與非人源TCRa恒定基因序列可操作地連接的至少一個(gè)人源Va區(qū)段和至少一個(gè)人源Ja區(qū)段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物，其中所述未經(jīng)重排的TCRa可變基因基因座取代內(nèi)源性非人源TCRa可變基因基因座。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物，其中內(nèi)源性非人源Va和Ja區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的V a/J a序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物缺乏功能性內(nèi)源性非人源TCRa可變基因座。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的動(dòng)物，其中所述缺乏功能性內(nèi)源性非人源TCRa可變基因座包含選自以下組的缺失:(a)全部?jī)?nèi)源性Va基因區(qū)段、(b)全部?jī)?nèi)源性Ja基因區(qū)段的缺失和(C)其組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物，其中所述人源Va和Ja區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的人源Va/Ja序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物在T細(xì)胞表面表達(dá)包含人源TCRa可變區(qū)的T細(xì)胞受體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物的T細(xì)胞經(jīng)歷胸腺T細(xì)胞發(fā)育以產(chǎn)生CD4和⑶8單陽(yáng)性T細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物包含正常的脾臟CD3+T細(xì)胞與總脾臟細(xì)胞的比率。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)目的抗原的中心和效應(yīng)記憶T細(xì)胞群。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物，其中所述未經(jīng)重排的TCRa可變基因基因座包含完整的人源Ja區(qū)段庫(kù)和完整的人源Va區(qū)段庫(kù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物保留內(nèi)源性非人源TCRa可變基因基因座，并且其中所述基因座是無(wú)功能的基因座。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的動(dòng)物，其中所述嚙齒動(dòng)物是小鼠。
15.一種基因修飾的非人動(dòng)物，在其基因組中包含: 未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座，其包括與非人源TCRii恒定基因序列可操作地連接的至少一個(gè)人源V β區(qū)段、至少一個(gè)人源D β區(qū)段和至少一個(gè)人源JP區(qū)段。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的動(dòng)物，其中所述未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座取代內(nèi)源性非人源TCRii可變基因基因座。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的動(dòng)物，其中內(nèi)源性嚙齒動(dòng)物νβ、?β和Ji3區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的V β/D β/J β序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物缺乏功能性內(nèi)源性非人源TCRii可變基因座。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的動(dòng)物，其中所述功能性內(nèi)源性嚙齒動(dòng)物TCRii可變基因座的缺乏包含選自以下組的缺失:(a)全部?jī)?nèi)源性Vi3基因區(qū)段的缺失、(b)全部?jī)?nèi)源性Di3基因區(qū)段的缺失、(C)全部?jī)?nèi)源性JP基因區(qū)段的缺失，和(d)上述缺失的組合。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的動(dòng)物，其中所述人源ViKDβ和Ji3區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的人源￥0/1)0/70序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物在T細(xì)胞表面表達(dá)包含人源TCRii可變區(qū)的T細(xì)胞受體。
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物的T細(xì)胞經(jīng)歷胸腺T細(xì)胞發(fā)育以產(chǎn)生⑶4和⑶8單陽(yáng)性T細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物包含正常的脾臟CD3+T細(xì)胞與總脾臟細(xì)胞的比率。
24.根據(jù)權(quán)利要求15所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物生成針對(duì)目的抗原的中心和效應(yīng)記憶T細(xì)胞群。
25.根據(jù)權(quán)利要求15所述的動(dòng)物，其中所述未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座包含完整的人源JP區(qū)段庫(kù)、完整的人源D β區(qū)段庫(kù)和完整的人源Vβ區(qū)段庫(kù)。
26.根據(jù)權(quán)利要求15所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物保留內(nèi)源性非人源TCRii可變基因基因座，并且其中所述基因座是無(wú)功能的基因座。
27.根據(jù)權(quán)利要求15所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的動(dòng)物，其中所述嚙齒動(dòng)物是小鼠。
29.—種基因修飾的非人動(dòng)物，在其基因組中包含: 未經(jīng)重排的T細(xì)胞受體(TCR) α可變基因基因座，其包含與非人源TCRa恒定基因序列可操作地連接的至少一個(gè)人源Va區(qū)段和至少一個(gè)人源Jα區(qū)段；以及， 未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座，其包括與非人源TCRii恒定基因序列可操作地連接的至少一個(gè)人源V β區(qū)段、至少一個(gè)人源D β區(qū)段和至少一個(gè)人源JP區(qū)段。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的動(dòng)物，其中所述未經(jīng)重排的TCRa可變基因基因座取代內(nèi)源性非人源TCR α可變基因基因座，并且其中所述未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座取代內(nèi)源性非人源TCRii可變基因基因座。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的動(dòng)物，其中內(nèi)源性非人源Vα和Ja區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的Va/Ja序列，并且其中內(nèi)源性非人源Vi3、Di3和Ji3區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的”/叩/^序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求29所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物缺乏功能性內(nèi)源性非人源TCRa可變基因座并且缺乏功能性內(nèi)源性非人源TCRii可變基因座。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的動(dòng)物，其中所述功能性內(nèi)源性非人源TCRa可變基因座的缺乏包含選自下組的缺失:(a)全部?jī)?nèi)源性Va基因區(qū)段的缺失、(b)全部?jī)?nèi)源性Jci基因區(qū)段的缺失，和(C)上述缺失的組合； 并且所述功能性內(nèi)源性非人源TCRii可變基因座的缺乏包含選自下組的缺失:(a)全部?jī)?nèi)源性νβ基因區(qū)段的缺失、(b)全部?jī)?nèi)源性Di3基因區(qū)段的缺失、(C)全部?jī)?nèi)源性J3基因區(qū)段的缺失，和(d)上述缺失的組合。
34.根據(jù)權(quán)利要求29所述的動(dòng)物，其中所述人源Va和Ja區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的人源Va/Ja序列，并且所述人源Vi3、Di3和Ji3區(qū)段重排形成經(jīng)重排的人源V β/D β/J β序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物在T細(xì)胞表面表達(dá)包含人源可變區(qū)和非人源動(dòng)物恒定區(qū)的T細(xì)胞受體。
36.根據(jù)權(quán)利要求29所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物的T細(xì)胞經(jīng)歷胸腺T細(xì)胞發(fā)育以產(chǎn)生⑶4和⑶8單陽(yáng)性T細(xì)胞。
37.根據(jù)權(quán)利要求29所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物包含正常的脾臟CD3+T細(xì)胞與總脾臟細(xì)胞的比率。
38.根據(jù)權(quán)利要求29所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物針對(duì)目的抗原生成中心和效應(yīng)記憶T細(xì)胞群。
39.根據(jù)權(quán)利要求29所述的動(dòng)物，其中所述未經(jīng)重排的TCRa可變基因基因座包含61個(gè)人源Ja區(qū)段和8個(gè)人源Va區(qū)段，并且其中所述未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座包含14個(gè)人源J β區(qū)段、2個(gè)人源D β區(qū)段和14個(gè)人源V β區(qū)段。
40.根據(jù)權(quán)利要求29所述的動(dòng)物，其中所述未經(jīng)重排的TCRa可變基因基因座包含完整的人源Ja區(qū)段庫(kù)和完整的人源Va區(qū)段庫(kù)，并且其中所述未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座包含完整的人源JP區(qū)段庫(kù)、完整的人源Di3區(qū)段庫(kù)和完整的人源νβ區(qū)段庫(kù)。
41.根據(jù)權(quán)利要求29所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物保留內(nèi)源性非人源TCRa和TCR^可變基因基因座，并且其中所述基因座是無(wú)功能的基因座。
42.根據(jù)權(quán)利要求29所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物在人源化的TCRa基因座進(jìn)一步包含人源νδ區(qū)段的核苷酸序列。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物在人源化的TCRa基因座進(jìn)一步包含完整的人源V δ區(qū)段庫(kù)、完整的人源DS區(qū)段庫(kù)和完整的人源JS區(qū)段庫(kù)。
44.根據(jù)權(quán)利要求29所述的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的動(dòng)物，其中所述嚙齒動(dòng)物是小鼠。
46.一種制備基因修飾的非人動(dòng)物的方法，所述動(dòng)物在T細(xì)胞表面表達(dá)包含人源可變區(qū)和非人源恒定區(qū)的T細(xì)胞受體，所述方法包括: 在第一非人動(dòng)物中用包含至少一個(gè)人源Vα區(qū)段和至少一個(gè)人源Jα區(qū)段的未經(jīng)重排的人源化的TCRa可變基因基因座取代內(nèi)源性非人源TCRa可變基因基因座，以生成人源化的TCRa可變基因基因座，其中所述人源化的TCRa可變基因基因座可操作地與內(nèi)源性非人源TCR α恒定區(qū)連接； 在第二非人動(dòng)物中用包含至少一個(gè)人源Vβ區(qū)段、至少一個(gè)人源Di3區(qū)段和至少一個(gè)人源JP區(qū)段的未經(jīng)重排的人源化的TCRii可變基因基因座取代內(nèi)源性非人源TCRii可變基因基因座，以生成人源化的TCRii可變基因基因座，其中所述人源化的TCRii可變基因基因座可操作地與內(nèi)源性非人源TCRii恒定區(qū)連接；和 將所述第一和第二動(dòng)物交配以獲得表達(dá)包含人源可變區(qū)和非人源恒定區(qū)的T細(xì)胞受體的非人動(dòng)物。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中內(nèi)源性非人源Vα和Ja區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的Va/Ja序列，并且其中內(nèi)源性非人源Vi3、Di3和Ji3區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的 νβ/?β/Ιβ 序列。
48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述基因修飾的動(dòng)物缺乏功能性內(nèi)源性非人源TCRa可變基因座并且缺乏功能性內(nèi)源性非人源TCRii可變基因座。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述功能性內(nèi)源性非人源TCRa可變基因座的缺乏包含選自以下組的缺失:(a)全部?jī)?nèi)源性Va基因區(qū)段的缺失、(b)全部?jī)?nèi)源性Ja基因區(qū)段的缺失，和(C)上述缺失的組合； 并且所述功能性內(nèi)源性非人源TCRii可變基因座的缺乏包含選以自下組的缺失:(a)全部?jī)?nèi)源性νβ基因區(qū)段的缺失、(b)全部?jī)?nèi)源性Di3基因區(qū)段的缺失、(c)全部?jī)?nèi)源性J3基因區(qū)段的缺失，和(d)上述缺失的組合。
50.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述人源Va和Ja區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的人源Va/Ja序列，并且所述人源Vi3、Di3和Ji3區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的人源V β/D β / 序列。
51.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物的T細(xì)胞經(jīng)歷胸腺T細(xì)胞發(fā)育以產(chǎn)生⑶4和⑶8單陽(yáng)性T細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述動(dòng)物包含正常的脾臟CD3+T細(xì)胞與總脾臟細(xì)胞的比率。
53.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述動(dòng)物生成針對(duì)目的抗原的中心和效應(yīng)記憶T細(xì)胞群。
54.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述未經(jīng)重排的人源化的TCRa可變基因基因座包含61個(gè)人源Ja區(qū)段和8個(gè)人源Va區(qū)段，并且其中所述未經(jīng)重排的人源化的TCR β可變基因基因座包含14個(gè)人源J β區(qū)段、2個(gè)人源D β區(qū)段和14個(gè)人源V β區(qū)段。
55.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述未經(jīng)重排的人源化的TCRa可變基因基因座包含完整的人源Ja區(qū)段庫(kù)和完整的人源Va區(qū)段庫(kù)，并且其中所述未經(jīng)重排的人源化的TCRii可變基因基因座包含完整的人源Ji3區(qū)段庫(kù)、完整的人源Di3區(qū)段庫(kù)和完整的人源νβ區(qū)段庫(kù)。
56.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物是小鼠。
58.一種基因修飾的小鼠，在其基因組中包含: 未經(jīng)重排的T細(xì)胞受體(TCR) α可變基因基因座，其包含與小鼠TCRa恒定基因序列可操作地連接的完整的人源Jα區(qū)段庫(kù)和完整的人源Vα區(qū)段庫(kù)，以及 未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座，其包含與小鼠TCRii恒定基因序列可操作地連接的完整的人源JP區(qū)段庫(kù)、完整的人源D β區(qū)段庫(kù)和完整的人源V β區(qū)段庫(kù)。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的小鼠，其中所述未經(jīng)重排的TCRa可變基因基因座取代內(nèi)源性小鼠TCRa可變基因基因座，并且其中所述未經(jīng)重排的TCRii可變基因基因座取代內(nèi)源性小鼠TCRii可變基因基因座。
60.根據(jù)權(quán)利要求58所述的小鼠，其中所述內(nèi)源性小鼠Va和Ja區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的Va/Ja序列，并且其中所述內(nèi)源性小鼠和Ji3區(qū)段無(wú)法重排以形成經(jīng)重排的V β/D β/JP序列。
61.根據(jù)權(quán)利要求58所述的小鼠，其中所述人源Va和Ja區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的人源Va/Ja序列，并且所述人源Vi3、Di3和Ji3區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的人源V β/D β / 序列。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的小鼠，其中所述小鼠在T細(xì)胞表面表達(dá)包含人源可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的T細(xì)胞受體。
63.根據(jù)權(quán)利要求58所述的小鼠，其中所述小鼠的T細(xì)胞經(jīng)歷胸腺T細(xì)胞發(fā)育以產(chǎn)生⑶4和⑶8單陽(yáng)性T細(xì)胞。
64.根據(jù)權(quán)利要求58所述的小鼠，其中所述小鼠包含正常的脾臟CD3+T細(xì)胞與總脾臟細(xì)胞的比率。
65.根據(jù)權(quán)利要求58所述的小鼠，其中所述小鼠生成針對(duì)目的抗原的中心和效應(yīng)記憶T細(xì)胞群。
66.根據(jù)權(quán)利要求58所述的小鼠，其中所述小鼠在人源化的TCRa基因座進(jìn)一步包含完整的人源V δ區(qū)段庫(kù)、完整的人源DS區(qū)段庫(kù)和完整的人源JS區(qū)段庫(kù)。
67.根據(jù)權(quán)利要求58所述的小鼠，其中所述小鼠保留內(nèi)源性小鼠TCRa和TCRi^可變基因基因座，并且其中所述基因座是無(wú)功能的基因座。
68.一種產(chǎn)生針對(duì)目的抗原的人源T細(xì)胞受體的方法，其包括: 使用目的抗原對(duì)權(quán)利要求1所述的非人動(dòng)物進(jìn)行免疫； 使所述動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答； 從所述動(dòng)物中分離對(duì)目的抗原產(chǎn)生反應(yīng)的T細(xì)胞； 確定所述T細(xì)胞表達(dá)的人源TCR可變區(qū)的核酸序列； 將所述人源TCR可變區(qū)克隆至包含人源TCR恒定區(qū)的核酸序列的核苷酸構(gòu)建體，其中所述人源TCR可變區(qū)可操作地與人源TCR恒定區(qū)連接；以及 在細(xì)胞中表達(dá)人源T細(xì)胞受體。
【文檔編號(hào)】A01K67/027GK104011071SQ201280064216
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月28日
【發(fā)明者】L·麥克唐納, A·J·莫菲, J·麥克沃克, N·圖, V·沃羅寧那, C·古雷爾, K·梅格爾, S·史蒂文斯 申請(qǐng)人:瑞澤恩制藥公司