使用脂肪酶制備水凝膠的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的用于制備水凝膠，例如藻酸鹽水凝膠的方法。本發(fā)明的水凝膠特別用于生物材料，例如細(xì)胞材料，如精子的固定和保存。
【專利說明】使用脂肪酶制備水凝膠的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的用于制備水凝膠，特別是藻酸鹽水凝膠的方法。本發(fā)明的 水凝膠具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，并且特別用于生物材料的固定化，更具體而言，用于細(xì)胞物質(zhì) 例如精子的固定化和保存。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 水凝膠由形成親水性的含水網(wǎng)絡(luò)的聚合物鏈構(gòu)成，其在多個工業(yè)領(lǐng)域，特別是生 物技術(shù)和制藥業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用。例如，水凝膠被用于固定生物材料（例如細(xì)胞）以用 于移植或作為例如藥物活性成分或營養(yǎng)成分的遞送系統(tǒng)。水凝膠也可以用作傷口敷料。此 夕卜，水凝膠，特別是藻酸鹽水凝膠，被廣泛地用作增稠劑。
[0004] 廣泛使用的用于形成水凝膠的聚合物為藻酸鹽。藻酸鹽為天然存在的陰離子 多糖，其由1,4-聯(lián)-β-D-甘露糖醛酸（M)和α-L-葡萄糖醛酸（G)構(gòu)成（Smidsr0d and Skj&k-Braek, 1990, Trends in biotechnology,第8卷，第 3 期，第 71-78頁）。市售的 藻酸鹽提取自海藻，例如褐藻（Ascophyllum nodosum)、巨藻（Macrocystis pyrifera)和北 極海帶（Laminaria hyperborea)，部分提取自扎掌狀海帶（Laminaria digitata)、福建種 海帶（Laminaria japonica)、Eclonia maxima、Lesonia negrescens 和馬尾藻（Sargassum sp)。
[0005] 藻酸鹽還可由一些藻酸鹽產(chǎn)生菌制備，例如由一些假單胞菌屬（Pseudomonas species)以及由棕色固氮菌制備（Azotobacter vinelandii) ( Smidsr0d and Skjak-Braek, 1990, supra)〇
[0006] 藻酸鹽通常尤其用于食品工業(yè)，例如作為用于粘度控制的穩(wěn)定劑，或作為增稠劑。 藻酸鹽還可廣泛地用于制藥業(yè)和化妝品業(yè)，同樣作為穩(wěn)定劑、增稠劑或分解劑?；诓煌?目的，可分別獲得富含古羅糖醒酸（guluronic acid)或甘露糖醒酸的藻酸鹽（Mancini 等（1999)，Journal of Food Engineering39, 369-378、W08603781、US 4, 990, 601、US 5, 639, 467)。
[0007] 由于在二價(jià)陽離子例如鈣離子的存在下藻酸鹽的生物相容性和凝膠能力，藻酸 鹽通常還可用于細(xì)胞的膠囊化（Nebel，R.L.，Balme，J.，Saacke，R.G.和 Lim.F. (1985)， J.Anim.Sci. 60:1631-1639 ;Lim，F(xiàn) 和 Sun,A.Μ·，（1980)Science210:908-9100 ;W0 2006/106400 ;EP0922451;US6596310;Torre 等（1998)，S.T.P. Pharma Sciences，8 (4)， 第 233-236 頁；Torre 等，（2000)，Biomaterials，21，第 1493-1498 頁；Torre 等（2002)， Journal of Controlled Release，85,第 83-89 頁；Faustini 等，（2004)，Theriogenology, 61，第 173-184 頁；Weber 等（2006)，Journal of Biotechnology，123,第 155-163 頁。
[0008] 藻酸鹽凝膠還用于固定各種材料。例如，W02008/004890記載用于保存精子的生 物聚合物顆粒，并且其中生物材料被包埋在呈固態(tài)的聚合物顆粒中，并貫穿在整個顆粒的 直徑中。通過將精子包埋在藻酸鹽水凝膠中而不是將精子膠囊化，使得精子保存于膠囊的 流體芯中，細(xì)胞被固定在藻酸鹽凝膠網(wǎng)絡(luò)中，因此限制了細(xì)胞在存儲過程中的運(yùn)動性。
[0009] 藻酸鹽水凝膠，例如用于各種材料的膠囊化或圈閉（entrapment)的藻酸鹽凝膠， 可以通過以下方法制備：將待圈閉的材料的溶液與海藻酸鈉的溶液混合，然后將該溶液加 入到含有多價(jià)陽離子的溶液中，所述多價(jià)陽離子通常為二價(jià)陽離子例如鈣離子（例如CaCl 2 的溶液）（Sn丨idsred and Skjak-Braek, 1990,supra)〇
[0010] US6, 497, 902公開了另一種制備生物相容性水凝膠（例如藻酸鹽水凝膠）的方法， 其包含將待包埋的細(xì)胞、藻酸鹽和鈣釋放劑彼此混合，之后將鈣釋放化合物加入到所述混 合物中形成交聯(lián)凝膠。根據(jù)US專利6, 497, 902,所述鈣釋放劑可以是D-葡萄糖-δ -內(nèi)酯 ^DL)。
[0011] 在US專利6, 497, 902中公開的方法可用來固定用于人工授精的精子（例如，用于 制備公開于W0 2008/004890的藻酸鹽水凝膠）。例如，稀釋并冷卻（4°C)的精子可被加入 到包含溶解的海藻酸鈉和懸浮的碳酸鈣以及任選地冷凍保護(hù)劑（例如甘油）的溶液中，然 后通過加入包含GDL的溶液引發(fā)膠凝并獲得所需的藻酸鹽水凝膠。GDL的加入導(dǎo)致葡萄糖 酸的形成，葡萄糖酸將與水反應(yīng)而形成H 30+。H30+的增加，以及碳酸鈣的存在導(dǎo)致了 C02和 Ca2+的釋放。通過加入GDL而提供的Ca2+導(dǎo)致含有包埋的精子的藻酸鹽水凝膠的形成。
[0012] 在凝膠已發(fā)生之后，充滿包埋在藻酸鹽中的精子的容器可冷藏保存在液氮中，由 此提供了具有特別長的保質(zhì)期的精子的冷藏保存。
[0013] 然而，本發(fā)明人已體驗(yàn)到在根據(jù)US專利6, 497, 902中公開的方法制備藻酸鹽水凝 膠中使用⑶L包括一些缺陷。當(dāng)根據(jù)上述方法制備包含固定的精子的藻酸鹽凝膠時(shí)，在制 備GDL溶液后立即將其加入溶液以避免自發(fā)的膠凝是關(guān)鍵的。GDL必須以溶解的形式加入 而不是粉末的形式，從而避免最初局部區(qū)域/層區(qū)具有高濃度的葡萄糖酸，這將對精子不 利。此外，在GDL加入之后，膠凝反應(yīng)開始后將伴隨一段粘度升高的時(shí)期。由于粘度的增加， 用于形成水凝膠的容器必須相當(dāng)快地被充滿。在將溶解的GDL轉(zhuǎn)化葡萄糖醛酸的累積時(shí)間 中，溶液因此被轉(zhuǎn)移到適合的容器（例如，頂V，L' Aigle，F(xiàn)rance提供的微型吸管）以使所 需的生物材料進(jìn)一步膠凝和固定化。因此，現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法確實(shí)導(dǎo)致制備包含所需 生物材料的水凝膠的時(shí)間安排相當(dāng)短且不靈活并且從工業(yè)的角度來看是主要的缺點(diǎn)。
[0014] 由于上述方法的缺點(diǎn)，需要改進(jìn)水凝膠的制備方法，特別是適合在工業(yè)規(guī)模上制 備水凝膠的方法。
[0015] 在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)記載制備水凝膠的各種其他方法。各種報(bào)道公開了一種酶的 利用，所述酶在接觸特定底物時(shí)提供了不同的反應(yīng)，所述反應(yīng)最終導(dǎo)致各種類型聚合物的 交叉聯(lián)（crossbinding)。
[0016] 例如，CN 101439206公開了尤其是在酶催化方法中使用包含酚羥基單元和二氧化 酶的聚合物以制備聚合物凝膠。
[0017] Johnsen 等（2010)在 ACS Applied Materials & Interfaces，2 (7)，第 1963-1972 頁中報(bào)道了使用葡萄糖氧化酶進(jìn)行聚合的基于PEG的水凝膠的制備。葡萄糖氧化酶催化 β -D-葡萄糖的氧化，隨后使用氧氣來產(chǎn)生黃素腺嘌呤二核苷酸酶輔助因子，導(dǎo)致H202的生 成。通過亞鐵離子與這些酶催化的H 202產(chǎn)物的結(jié)合，產(chǎn)生伯羥基基團(tuán)物質(zhì)，其進(jìn)一步與丙烯 酸酯單體反應(yīng)。
[0018] 還已報(bào)道了 H202和辣根過氧化物酶在水凝膠制備中的用途，參見例如 Kurisawa 等，（2010)，J. of Materials Chemistry，20 (26),第 5371-5375 頁；Sakai 等， (2009), Biomaterials, 30 (20),第 3371-3377 頁；Sakai and Kawakami (2006)，Acta Biomaterialia，20017, 3,第 495-501 頁；Lee 等（2009)，J. of Controlled Release，134,第 186-193 頁；Wang 等（2010)，Biomaterials，31，第 1148-1157 頁。
[0019] 由于H202是強(qiáng)氧化劑，通過使用氧化酶和H20 2制備的水凝膠并不適合某些應(yīng)用。
[0020] 因此，仍需要改進(jìn)且簡化的用于制備藻酸鹽水凝膠，特別是適合于固定化生物材 料的水凝膠的方法。
[0021] 發(fā)明概述
[0022] 本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的用于制備藻酸鹽水凝膠的方法，其不具有現(xiàn)有技 術(shù)的方法的缺點(diǎn)。
[0023] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種簡化的用于制備藻酸鹽水凝膠的方法，該藻酸鹽 水凝膠適合于固定生物材料。
[0024] 因此，本發(fā)明涉及一種藻酸鹽水凝膠，其中其膠凝是通過以下方法進(jìn)行引發(fā)：利用 水解酶和可被水解酶水解的底物來形成H 30+、并隨后由于二價(jià)陽離子釋放劑的存在而釋放 二價(jià)陽離子。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種制備藻酸鹽水凝膠的方法，所述方法包括將 含有水解酶的溶液與含有可被水解酶水解的底物的溶液混合，其中所述含有水解酶的溶液 或含有可被水解酶水解的底物的溶液另外地包含藻酸鹽和二價(jià)陽離子釋放化合物。在兩種 溶液混合時(shí)，底物與水解酶結(jié)合導(dǎo)致所述底物的水解并隨后形成H 30+。此外，H30+的產(chǎn)生導(dǎo) 致二價(jià)陽離子的釋放，由此引發(fā)了水凝膠的形成。
[0026] 根據(jù)一個實(shí)施方案，二價(jià)陽離子釋放化合物和藻酸鹽存在于包含水凝膠的溶液 中。根據(jù)另一個實(shí)施方案，二價(jià)陽離子釋放化合物和藻酸鹽存在于包含所述底物的溶液中。
[0027] 所述水解酶可以是酯酶，例如脂肪酶。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，本發(fā)明的方法 中使用水解酶為三?；视椭久?。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的又一個實(shí)施方案，二價(jià)陽離子釋放化合物釋放選自Ca2+、Ba 2+、和Sr2+ 的二價(jià)陽離子。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案，二價(jià)陽離子釋放化合物為鈣釋放化合物，例如碳 酸鈣。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的又一個實(shí)施方案，底物為有機(jī)酸的酯。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的又一個實(shí)施方案，提供一種方法，其包含以下步驟：將含有三?；?油脂肪酶的溶液與包含可被所述水解酶水解的底物的溶液進(jìn)行混合，其中底物為式I的化 合物：
[0032]
【權(quán)利要求】
1. 水解酶和可被該水解酶水解的底物在制備藻酸鹽水凝膠中的用途。
2. 權(quán)利要求1的用途，其中所述酶為酯酶。
3. 權(quán)利要求2的用途，其中所述酯酶為脂肪酶。
4. 權(quán)利要求3的用途，其中所述脂肪酶為三?；视椭久浮?br> 5. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述水解酶的底物的水解導(dǎo)致成0+的產(chǎn)生。
6. 權(quán)利要求5的用途，其中所述酶為脂肪酶并且所述底物為式I的化合物：
其中Ri、R2和R3獨(dú)立地相同或不同并代表直鏈或支鏈、取代或未取代的Q-Cu-烷基羰 基鏈。
7. 權(quán)利要求2的用途，其中^、馬和馬選自甲酮、乙酮、丙酮、丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛 酮、壬酮、癸酮、十二烷酮。
8. 權(quán)利要求6的用途，其中Rp R2和R3獨(dú)立地相同或不同并代表Ci-Q-烷基羰基鏈。
9. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述底物選自三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯和 三丁酸甘油酯，優(yōu)選三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
10. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述酶和底物用于制備包埋生物材料、優(yōu)選精 子的藻酸鹽水凝膠。
11. 一種制備藻酸鹽水凝膠的方法，包含以下步驟： 將含有水解酶的溶液與含有可被該水解酶水解的底物的溶液混合，并且其中含有所述 水解酶的溶液或含有所述底物的溶液另外地包含藻酸鹽和二價(jià)陽離子釋放化合物。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中包含水解酶的溶液含有二價(jià)陽離子釋放化合物和藻酸 鹽。
13. 權(quán)利要求11的方法，其中包含底物的溶液含有二價(jià)陽離子釋放化合物和藻酸鹽。
14. 權(quán)利要求11的方法，其中所述水解酶為酯酶。
15. 權(quán)利要求11的方法，其中所述酯酶為脂肪酶，優(yōu)選三?；视椭久浮?br> 16. 權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述底物為有機(jī)酸的酯。
17. 權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的方法，用于制備藻酸鹽水凝膠，包含以下步驟：將含有 三?；视椭久傅娜芤号c包含可被該水解酶水解的底物的溶液混合，其中所述底物為式 I的化合物：
其中Ri、R2和R3獨(dú)立地相同或不同并代表直鏈或支鏈、取代或未取代的Q-Cu-烷基羰 基鏈，并且其中包含所述脂肪酶的溶液或包含式I化合物的溶液另外地包含藻酸鹽和二價(jià) 陽離子釋放化合物。
18. 權(quán)利要求14的方法，其中^、馬和馬選自甲酮、乙酮、丙酮、丁酮、戊酮、己酮、庚酮、 辛酮、壬酮、癸酮、十二烷酮。
19. 權(quán)利要求14的方法，其中RpRjP R3獨(dú)立地相同或不同并代表烷基羰基鏈。
20. 權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述底物選自三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯 和三丁酸甘油酯，優(yōu)選三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
21. 權(quán)利要求11-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述二價(jià)陽離子釋放化合物釋放選自Ca2+、 Ba2+、和Sr2+的二價(jià)陽離子。
22. 權(quán)利要求18的方法，其中所述二價(jià)陽離子釋放化合物為鈣釋放化合物。
23. 權(quán)利要求19的方法，其中所述陽離子釋放化合物為碳酸鈣。
24. 權(quán)利要求11-21中任一項(xiàng)的方法，其中第一溶液還包含待包埋在藻酸鹽水凝膠中 的目標(biāo)物。
25. 權(quán)利要求22的方法，其中待包埋在藻酸鹽凝膠中的目標(biāo)物為生物材料。
26. 權(quán)利要求23的方法，其中所述生物材料為精子。
27. 權(quán)利要求20的方法，其中所述方法包含以下步驟： i) 通過用包含三?；视椭久傅娜芤合♂尵佣纬傻谝蝗芤?； ii) 將包含藻酸鹽、二價(jià)陽離子釋放化合物和式I化合物的第二溶液加入到在步驟i) 中獲得的第一溶液中，引發(fā)膠凝：
其中Ri、R2和R3獨(dú)立地相同或不同并代表直鏈或支鏈、取代或未取代的Q-Cu-烷基羰 基鏈； iii) 將步驟ii)中獲得的溶液轉(zhuǎn)移到用于藻酸鹽水凝膠膠凝的容器中； iv) 任選地將iii)的藻酸鹽水凝膠冷藏保存。
28. 權(quán)利要求20的方法，其中所述方法包含以下步驟： i) 通過用包含式I化合物的溶液稀釋精子而形成第一溶液：
其中Ri、R2和R3獨(dú)立地相同或不同并代表直鏈或支鏈、取代或未取代的Q-Cu-烷基羰 基鏈； ii) 將包含藻酸鹽、二價(jià)陽離子釋放化合物和三酰基甘油脂肪酶的第二溶液加入到步 驟i)中獲得的溶液中，引發(fā)膠凝； iii) 將ii)中獲得的溶液轉(zhuǎn)移到用于藻酸鹽水凝膠膠凝的容器中； iv) 任選地將iii)的藻酸鹽水凝膠冷藏保存。
29. 權(quán)利要求25和26中任一項(xiàng)的方法，其中所述底物選自三乙酸甘油酯、三丙酸甘油 酯和三丁酸甘油酯，優(yōu)選三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
30. 權(quán)利要求14和15中任一項(xiàng)的方法，其中對iii)中獲得的溶液冷藏保存，并且其中 i)和ii)的第一溶液和第二溶液分別包含冷凍保護(hù)劑。
31. 權(quán)利要求14-16的方法，其中所述藻酸鹽為富含古羅糖醛酸的藻酸鹽。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)制備的藻酸鹽水凝膠。
33. -種藻酸鹽水凝膠，其包含： a) 藻酸鹽； b) 任選地待包埋在所述藻酸鹽水凝膠中的目標(biāo)物； c) 所述藻酸鹽水凝膠制備中所使用的水解酶。
34. -種藻酸鹽水凝膠試劑盒，其包含一個含有水解酶的容器和另一個含有可被該水 解酶水解的底物的容器。
35. 權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述可被水解酶水解的底物為式I的化合物：
其中Ri、R2和R3獨(dú)立地相同或不同并代表烷基羰基鏈。
36. 權(quán)利要求23的試劑盒，其中所述試劑盒另外地包含藻酸鹽和二價(jià)陽離子釋放化合 物。
37. 權(quán)利要求28的試劑盒，其包含一個容器，其包括含有水解酶的溶液；以及另一個容 器，其包括含有藻酸鹽、二價(jià)陽離子釋放化合物和可被該水解酶水解的底物的溶液。
38. 權(quán)利要求28的試劑盒，其包含一個容器，其包括含有可被水解酶水解的底物的溶 液；以及另一個容器，其包括含有藻酸鹽、二價(jià)陽離子釋放化合物和水解酶的溶液。
【文檔編號】A01N1/02GK104126015SQ201280067668
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月24日
【發(fā)明者】G·科林肯博格, K·多馬斯約瑟芬, E·科米斯拉德 申請人:斯博姆維透公司