專利名稱：一種煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物抗病性鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法。
背景技術(shù)：
煙草黑胚病(Phytophthora parasitica var.nicotiane)是煙草生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一，是制約我國各煙區(qū)煙葉生產(chǎn)的最重要因素，可以危害烤煙、晾煙、曬煙、白肋煙、香料煙等所有的栽培煙草。1896年，Bred de Haan在爪哇首次發(fā)現(xiàn)煙草黑脛病。1924年，Cook在波多黎再吃觀察到這個病害。此后，世界各主要產(chǎn)煙區(qū)陸續(xù)報道了煙草黑脛病發(fā)生為害情況，現(xiàn)該病已遍布溫帶、亞熱帶和熱帶各煙區(qū)。20世紀(jì)40年代，病區(qū)擴(kuò)大到黃河流域、長江流域及珠江流域的各產(chǎn)煙省，在這些地區(qū)煙草黑脛病均已造成嚴(yán)重?fù)p失。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國煙草黑脛病平均每年發(fā)病面積高達(dá)76373hm2，產(chǎn)量損失2869.26萬kg，產(chǎn)值損失超過1.23億元，僅次于煙草病毒病。生產(chǎn)實(shí)踐表明，防治黑脛病最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的措施就是選育抗病品種，抗性鑒定自然成為抗源挖掘利用、抗病育種、抗性監(jiān)測等工作中重要的一環(huán)。因此，準(zhǔn)確有效的抗性鑒定方法對煙草抗性材料的鑒定和抗病品種的選育是至關(guān)重要的。在以往黑脛病抗性材料的鑒定中，一般采用苗期接種鑒定和/或病圃抗性鑒定，主要根據(jù)黑脛病的發(fā)病特征——植株的萎蔫率來確定材料的抗性水平。其中，病圃抗性鑒定主要應(yīng)用于煙草成株鑒定，其鑒定結(jié)果易受地塊菌落濃度的均勻性及其氣候影響，導(dǎo)致不同年份之間的鑒定結(jié)果存在一定的差異，而且病圃鑒定也因面積有限，無法同期對大批量的材料進(jìn)行抗性鑒定；苗期接種鑒定在一定程度上克服了病圃鑒定的局限性，但在應(yīng)用過程中由于接種苗齡、接種方法、病菌株系以及培養(yǎng)環(huán)境的不同，鑒定結(jié)果往往也不一致。上述兩種方法的鑒定結(jié)果只是反映了煙草苗期或成株期對黑脛病菌的耐受能力，而并非是該品種或材料的真正抗性水平，原因在于:在煙草的種植過程中往往存在潛性感染現(xiàn)象，即黑脛病菌通過植株根部傷口，入侵植株后在莖桿等維管束內(nèi)不斷擴(kuò)繁延伸，只有當(dāng)植株體內(nèi)菌落數(shù)達(dá)到一定時，植株才表現(xiàn)出萎蔫癥狀；同時，不同抗性材料對抑制黑脛病菌擴(kuò)繁延伸的能力也是不同的，故單純依靠植株病癥表現(xiàn)來判斷，還無法真實(shí)評價出不同材料的抗性水平。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、成本低、速度快、準(zhǔn)確性高、適宜煙草育種研究中的黑脛病抗性鑒定方法，以加速煙草抗黑脛病新品種的選育或突變基因的篩選與推廣應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技 術(shù)方案是:一種煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，包括如下步驟:(I)取待鑒定的煙草種子表面消毒；
(2)煙草黑脛病菌的培養(yǎng)及其分生孢子懸浮液的制備；這里的煙草黑脛病菌為煙草黑胚病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae (vom Breda de Hean) Tuker) (0號小種)。(3)煙草黑脛病菌毒素液的提取:將步驟(2)制備的分生孢子懸浮液稀釋為I X IO5 5 X IO6個孢子含量，濾紙過濾，濾液高速離心，取上清液用0.45Mm微孔濾膜過濾，得無菌的煙草黑脛病菌毒素液；(4)將步驟(I)表面消毒后的煙草種子用步驟(3)提取的毒素液浸泡4-8h，然后將煙草種子移到瓊脂水培養(yǎng)基上，保持在相對濕度90%-95%、光照強(qiáng)度為10001χ-20001χ、溫度在18°C _25°C的條件下，7-10d后開始觀察發(fā)芽情況，根據(jù)發(fā)芽率判斷供試材料的抗性:發(fā)芽抑制率> 50%為感病品種，15% <發(fā)芽抑制率在> 50%為中抗品種，發(fā)芽抑制率< 15%為抗病品種。上述的煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，其中步驟(I)按如下方法操作:取待鑒定的煙草種子置于無菌培養(yǎng)皿中，用1% (質(zhì)量體積百分比)硫酸銅溶液浸種5min，然后用無菌水沖洗3次。上述的煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，其中步驟(2)按如下方法操作:將煙草黑脛病菌接種于燕麥固體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)7-14d，待菌絲長滿整個培養(yǎng)皿后，取菌塊加入到燕麥液體培養(yǎng)基中28°C振蕩7-14d，得煙草黑脛病菌分生孢子懸浮液。上述的煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，其中所述的燕麥固體培養(yǎng)基的制作方法為:在IOOOmL無菌水中加入33g燕麥片，煮至燕麥片開花狀，加18g瓊脂粉，定容lOOOmL，分裝入500mL三角瓶中高壓120°C滅菌20mi n。上述的煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，其中所述的燕麥液體培養(yǎng)基的制作方法為:在IOOOmL無菌水中加入33g燕麥片，煮至燕麥片開花狀，定容IOOOmL,分裝入500mL三角瓶中高壓120°C滅菌20min。上述的煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，其中步驟(3)中所述分生孢子懸浮液被稀釋至9 X IO5孢子含量。上述的煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，其中步驟(4)中所述的瓊脂水培養(yǎng)基的制作方法為:在IOOOmL無菌水中加入18g瓊脂粉，定容IOOOmL,分裝入500mL三角瓶中高壓 12CTC 滅菌 20min。目前對煙草黑脛病抗性鑒定常用方法為移栽后接種鑒定，這種方法存在的不足為:歷時周期長，田間鑒定往往一年只能完成一批次；自然條件下溫度濕度不易控制，年代不同時鑒定結(jié)果有所差異；占地面積大；試驗費(fèi)用高等。本發(fā)明涉及的煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法克服了以上不足，鑒定一批次只需10-14天即可完成；且在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，對溫度、濕度進(jìn)行控制，即發(fā)病條件不存在差異；大大節(jié)省了人力物力。該方法完全實(shí)現(xiàn)了高通量、快速鑒定煙草黑脛病的目的。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例形式對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
煙草突變品種對黑脛病抗性鑒定與評價:以下實(shí)施例中供試材料為紅大和中煙100經(jīng)EMS (甲基磺酸乙酯)誘變獲得(表I),所用的黑胚病菌(Phytophthora parasiticavar.nicotianae (vom Breda de Hean) Tuker) (0號小種)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供，其余試劑均為市售產(chǎn)品。所用儀器光學(xué)顯微鏡、光照培養(yǎng)箱、人工氣候箱均為普通配置。燕麥固體培養(yǎng)基的制作方法:在IOOOmL無菌水中加入33g燕麥片，煮至燕麥片開花狀，加18g瓊脂粉，定容IOOOmL,分裝入500mL三角瓶中高壓滅菌20min (120°C)。燕麥液體培養(yǎng)基的制作方法:在IOOOmL無菌水中加入33g燕麥片，煮至燕麥片開花狀，定容IOOOmL,分裝入500mL三角瓶中高壓滅菌20min (120°C )。瓊脂水培養(yǎng)基的制作方法:在IOOOmL無菌水中加入18g瓊脂粉，定容lOOOmL，分裝入500mL三角瓶中高壓滅菌20min (120°C)。(I)煙草種子表面消毒:取待鑒定的煙草種子置于無菌培養(yǎng)皿中，用I %硫酸銅浸種5min，然后用無菌水沖洗3次。(2)煙草黑胚病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae (vom Breda deHean) Tuker) (0號小種)培養(yǎng)及其分生孢子懸浮液的制備:用燕麥固體培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草黑脛病菌，將田間采集純化保存的黑脛病菌于超凈工作臺接種于固體培養(yǎng)基中，28°C燕麥固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7-14d，待菌絲 長滿整個培養(yǎng)皿后，取Icm X Icm菌塊加入到燕麥液體培養(yǎng)基中 28°C振蕩 7-14d。( 3 )將步驟(2 )獲得的分生孢子貯備液于電子顯微鏡下觀察孢子濃度，將其稀釋為9 X IO5個孢子含量,用濾紙過濾,將濾液10000rpm/min離心IOmin,取上清液用0.45μηι微孔濾膜過濾，得無菌的毒素液；(4)分別用5mL毒素液、5mL無菌水浸25粒煙草種子4_8h后移到瓊脂水培養(yǎng)基上，將該材料保持在相對濕度90%-95%、光照強(qiáng)度為10001x-20001x、溫度在18°C _25°C的條件下，7-10d后開始觀察發(fā)芽情況，根據(jù)發(fā)芽率和長勢判斷供試材料的抗性，發(fā)芽抑制率^ 50%為感病品種，15%<發(fā)芽抑制率在> 50%為中抗品種，發(fā)芽抑制率< 15%為抗病品種。通過上述毒素液浸泡后對發(fā)芽率的影響程度得出19個不同抗性材料的鑒定結(jié)果，結(jié)果為MZE2-195在19個材料中抗性水平最低，MZE2_574、MZE2_436和MZE2-512次之，為高感材料。認(rèn)為MZE2-901在19個材料中抗性水平最高，MZE2-134和MZE2-77次之，為高抗材料。表1供試材料經(jīng)處理后發(fā)芽數(shù)及發(fā)芽抑制率
權(quán)利要求
1.一種煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，其特征在于包括如下步驟: (1)取待鑒定的煙草種子表面消毒； (2)煙草黑脛病菌的培養(yǎng)及其分生孢子懸浮液的制備； (3)煙草黑脛病菌毒素液的提取:將步驟(2)制備的分生孢子懸浮液稀釋為IXlO5 5 X IO6個孢子含量，濾紙過濾，濾液高速離心，取上清液用0.45Mfli微孔濾膜過濾，得無菌的煙草黑脛病菌毒素液； (4)將步驟(I)表面消毒后的煙草種子用步驟(3)提取的毒素液浸泡4-8h，然后將煙草種子移到瓊脂水培養(yǎng)基上，保持在相對濕度90%-95%、光照強(qiáng)度為10001χ-20001χ、溫度在18°C _25°C的條件下，7-10d后開始觀察發(fā)芽情況，根據(jù)發(fā)芽率判斷供試材料的抗性:發(fā)芽抑制率> 50%為感病品種，15% <發(fā)芽抑制率在> 50%為中抗品種，發(fā)芽抑制率< 15%為抗病品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，其特征在于:步驟(I)按如下方法操作:取待鑒定的煙草種子置于無菌培養(yǎng)皿中，用1% ( /V)硫酸銅溶液浸種5min，然后用無菌水沖洗3次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，其特征在于:步驟(2)按如下方法操作:將煙草黑脛病菌接種于燕麥固體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)7-14d，待菌絲長滿整個培養(yǎng)皿后，取菌塊加入到燕麥液 體培養(yǎng)基中28°C振蕩7-14d，得煙草黑脛病菌分生孢子懸浮液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，其特征在于:所述的燕麥固體培養(yǎng)基的制作方法為:在IOOOmL無菌水中加入33g燕麥片,煮至燕麥片開花狀,加18g瓊脂粉，定容IOOOmL,分裝入500mL三角瓶中高壓120°C滅菌20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，其特征在于:所述的燕麥液體培養(yǎng)基的制作方法為:在IOOOmL無菌水中加入33g燕麥片，煮至燕麥片開花狀,定容IOOOmL,分裝入500mL三角瓶中高壓120°C滅菌20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，其特征在于:步驟(3)中所述的分生孢子懸浮液被稀釋至9 X IO5孢子含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，其特征在于:步驟(4)中所述的瓊脂水培養(yǎng)基的制作方法為:在IOOOmL無菌水中加入18g瓊脂粉，定容lOOOmL，分裝入500mL三角瓶中高壓120°C滅菌20min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙草黑脛病抗性的快速鑒定方法，包括如下步驟(1)取待鑒定的煙草種子表面消毒；(2)煙草黑脛病菌的培養(yǎng)及其分生孢子懸浮液的制備；(3)煙草黑脛病菌毒素液的提??；(4)毒素液浸種后進(jìn)行種子萌發(fā)，統(tǒng)計種子發(fā)芽率并進(jìn)行抗性評價。本發(fā)明的方法操作簡單、成本低、速度快、準(zhǔn)確性高、適宜煙草育種研究中的黑脛病抗性鑒定。
文檔編號A01G1/00GK103081678SQ20131001191
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者馮超, 孔凡玉, 張成省, 王靜, 楊舉田, 李乃會, 張永春 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所