專利名稱：一種鐵皮石斛試管開花及結實的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種鐵皮石斛試管開花及結實的方法。
背景技術：
鐵皮石斛又稱黑節(jié)草，屬蘭科附生蘭類，為多年生草本植物。鐵皮石斛是石斛中的極品，因其表皮呈鐵綠色而得名，是著名的觀賞兼藥用蘭花；現(xiàn)有技術中，對鐵皮石斛的培養(yǎng)階段中，大多對外植體原球莖進行誘導培養(yǎng)、增殖、分化、生根培養(yǎng)，得到小苗，但是對后期的試管開花及結實的研究比較少；鐵皮石斛對生境條件要求苛刻，難開花，在栽培條件下，從種子萌發(fā)到開花通常需要3 4年；因此，對鐵皮石斛開花的誘導對提高植物開花機理研究具有非常重要的意義；而現(xiàn)有的應用植物生物技術對鐵皮石斛進行誘導開花時，雖可獲得一定的開花誘導率，但是誘導率低，成本高，花朵小，且常出現(xiàn)不完整的花朵。并且，鐵皮石斛花屬蟲媒花，自然條件下授粉率低，一般均為人工授粉，現(xiàn)有的授粉方法一般是:在晴天選擇直徑為0.8^1.2cm的健壯植株且具正常結構的優(yōu)良花朵，拔出唇瓣用牙簽或者大頭針挑去花藥放入雌蕊腔，將授粉后花朵套袋。但是上述方法存在以下缺陷:受自然環(huán)境因素影響大，授粉成功率低；授粉后植株沒有得到單獨特殊的營養(yǎng)供應導致營養(yǎng)元素不充足，直接影響果實發(fā)育，造成果夾小，結實率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鐵皮石斛試管開花及結實的方法，誘導鐵皮石斛開花及結實，從而提高鐵皮石斛開花及結實率。為了達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案是:提供一種鐵皮石斛試管開花及結實的方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)原球莖誘導培養(yǎng)
選取健壯的生長良好的鐵皮石斛莖段或蒴果作為外植體，將外植體消毒后，接種于下列無菌誘導培養(yǎng)基中:MS+BA1.5 2.0mg/L+NAA0.2 0.6mg/L+白糖30 50g/L+瓊脂粉5.5 8g/L+ 土豆汁60 70ml/L+活性炭粉0.3 0.7g/L，在溫度為23 25°C、光照強度為1500 25001x、光照時間為9 11小時/天的條件下，培養(yǎng)45 60天，形成原球莖；
(2)原球莖增殖培養(yǎng)
將生長良好的原球莖轉接入下列增殖培養(yǎng)基中:MS+白糖30 50g/L+瓊脂粉5.5 8g/L+6-BA0.5 0.8mg/L+NAA0.1 0.8mg/L+ 土豆汁 30 50ml/L+ 紅薯汁 30 80ml/L+活性炭粉0.2 0.9g/L，進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)的環(huán)境條件為:溫度25 27°C，光照強度1800 30001x，光照時間10 12小時/天，培養(yǎng)周期45 60天；
(3)原球莖生根培養(yǎng)
將原球莖轉入下列生根培養(yǎng)基中:MS+白糖20 50g/L+瓊脂粉5.5 IOg/L+NAA0.4 0.9mg/L+IAA0.2 0.7mg/L+ 土豆汁 20 50ml/L+ 紅薯汁 60 80ml/L+ 活性炭粉0.5 1.0g/L,在溫度為23 27°C、濕度為40 60%、光照強度為2000 30001x、光照時間為11 13小時/天的條件下，培養(yǎng)70 100天，得到生根苗；
(4)生根苗誘導開花培養(yǎng)
將生根苗接種于下列誘導開花培養(yǎng)基中:MS+白糖30 60g/L+瓊脂粉5.5 llg/L+土 汁 30 50g/L+BA0.2 0.6mg/L+NAA0.1 0.9mg/L+PPP3330.3 0.8mg/L+Spml.0
6.0mmol/L+ZTl.5 6mg/L，進行誘導開花培養(yǎng)，培養(yǎng)的環(huán)境條件為:溫度22 25°C，濕度30 50%，光照強度2300 26001x，光照時間11 13小時/天，培養(yǎng)周期60 85天；
(5)授粉過程及結實培養(yǎng)
在經(jīng)誘導開花培養(yǎng)基培養(yǎng)后的植株中，選取具有完整花結構的健壯植株，在無菌環(huán)境中進行人工授粉，再將授粉后的植株轉接到下列授粉后培養(yǎng)基中:改良MS+白糖25 40g/L+ 瓊脂粉 5.5 10g/L+NAA0.2 0.5mg/L+ 土豆汁 30 50ml/L+ 紅薯汁 30 50ml/L+ 活性炭粉0.5 0.8g/L，在溫度為22 25°C，濕度為40 60%，光照強度為2500 32001x,光照時間為12 14小時/天的條件下，培養(yǎng)65 110天，得到鐵皮石斛蒴果；其中，改良MS培養(yǎng)基中KN03、KH2PO4和H3BO3用量為MS培養(yǎng)基中KN03、KH2PO4和H3BO3用量的三倍，其余組分含量不變。每升MS培養(yǎng)基中含有的組分及各組分的重量如下:NH4N03 165mg, KNO3 1900mg、CaCl2.2Η20 440mg、MgSO4.7Η20 370mg、KH2PO4 170mg、KI 0.83mg、H3BO3 6.2mg、MnSO4.H2O16.9mg、ZnSO4.7H20 8.6mg、Na2MoO4.2H20 0.25mg、CuSO4.5H20 0.025mg、CoCl2.6H20
0.025mg、FeSO4.7Η20 27.8mg、Na2-EDTA.2H20 37.3mg、肌醇 100 mg、煙酸 0.5 mg、鹽酸吡口多醇0.5 mg、鹽酸硫胺素0.1 mg、甘氨酸2 mg。所述鐵皮石斛為廣南紅桿軟腳鐵皮石斛；所選取的鐵皮石斛莖段的莖節(jié)間長為
1.5^3cm ;所選取的鐵皮石斛蒴果的長為1.0^2.5cm、寬為0.8 2cm。所述外植體為鐵皮石斛莖段，對該鐵皮石斛莖段進行消毒的過程為:將選取好的鐵皮石斛莖段流水沖洗lOmin，用手術刀從鐵皮石斛莖段的節(jié)間切割，得到帶有葉芽的莖段，并將該莖段置于無菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒lmin，再用0.1%的升汞浸泡6min，然后用無菌水沖洗:Γ5次。所述外植體為鐵皮石斛蒴果，對該鐵皮石斛蒴果進行消毒的過程為:將選取好的蒴果流水沖洗8min，用84消毒液擦拭果夾，放于無菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒lmin，再用0.1%的升汞浸泡6min，然后用無菌水沖洗3飛次；將消毒后的蒴果切開，取種子作為外植體備用。授粉時，選取高5cm以上、莖直徑為0.Γ0.8cm、具有至少八片葉子展開且具有完整花結構的健壯植株作為授粉體。本發(fā)明的鐵皮石斛試管開花及結實的方法，可以準確有效地調(diào)控鐵皮石斛試管開花率；在鐵皮石斛花芽形成的關鍵階段，通過光照、溫度、濕度及PPP333、Spm、土豆汁和ZT的共同協(xié)同調(diào)節(jié)作用，顯著激活鐵皮石斛試管苗開花的關鍵因子，從而提高鐵皮石斛成花率；并且，本發(fā)明采用在無菌環(huán)境中授粉及授粉后采用專用培養(yǎng)基進行結實培養(yǎng)，從而為鐵皮石斛提供豐富的氮、磷等營養(yǎng)元素，提高其結實率；本發(fā)明的方法可誘導植株健壯生長，果夾直徑可達0.8 lcm，授粉結實率高達90%。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述，但它們不是對本發(fā)明的進一步限制。實施例1
在5月份，選擇廣南紅桿軟腳鐵皮石斛，從該鐵皮石斛中選取生長良好無明顯病蟲害的莖節(jié)間長為1.5cm的鐵皮石斛莖段作為外植體，剪掉葉子在自來水下沖洗lOmin，取出放于超凈工作臺上的滅菌盤中；將槍形鑷、手術刀放置于接種器械滅菌器中加熱至300°C滅菌；用手術刀從該鐵皮石斛莖段的節(jié)間切割，得到帶有葉芽的莖段，并將該莖段置于無菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒lmin，倒出乙醇，再用手術刀切掉葉柄和葉鞘等多余組織，用0.1%的升汞浸泡6min，然后用無菌水沖洗3飛次；該消毒后的外植體接種于下列無菌誘導培養(yǎng)基中:MS+BAL 5mg/L +NAA0.2 mg/L+ 白糖 30g/L+ 瓊脂粉 5.5g/L+ 土豆汁 60 ml/L+ 活性炭粉0.3g/L，在溫度為25°C、光照強度為20001x、光照時間為10小時/天的條件下，培養(yǎng)50天，形成原球莖；
原球莖增殖培養(yǎng)
將生長良好的原球莖轉接入下列增殖培養(yǎng)基中:MS+白糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L+6-BA0.5mg/L+NAA0.lmg/L+土豆汁 30 ml/L+紅薯汁 30 ml/L+活性炭粉 0.2 g/L，在溫度為25°C，光照強度為25001x、光照為小時11/天，培養(yǎng)周期為55天的條件下進行增殖培養(yǎng)；
原球莖生根培養(yǎng)
將原球莖轉入下列生根培養(yǎng)基中:MS+白糖20g/L+瓊脂粉5.5g/L+NAA 0.4mg/L+IAA0.2mg/L+ 土豆汁20ml/L+紅薯汁60ml/L+活性炭粉0.5g/L，采用28瓦日光色燈管作為光源，光照強度為30001x，在溫度為24°C、濕度為40%、光照時間為12小時/天的條件下，培養(yǎng)90天，得到生根苗；
生根苗誘導開花培養(yǎng)
將生根苗接種于下列誘導開花培養(yǎng)基中:MS+白糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L+土豆汁30g/L+BA 0.2mg/L+NAA 0.lmg/L+PPP333 0.3mg/L+Spml.0mmoI/L+ ZT 1.5mg/L，采用 28 瓦日光色燈管作為光源，光照強度為25001x，在溫度為25°C，濕度為50%，光照時間12小時/天的條件下，培養(yǎng)60天，進行誘導開花；其中，表I為采用誘導開花培養(yǎng)基進行開花培養(yǎng)與采用生根培養(yǎng)基進行開花培養(yǎng)的植株生長狀態(tài)的對照:
表I
權利要求
1.一種鐵皮石斛試管開花及結實的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)原球莖誘導培養(yǎng) 選取健壯的生長良好的鐵皮石斛莖段或蒴果作為外植體，將外植體消毒后，接種于下列無菌誘導培養(yǎng)基中:MS+BA1.5 2.0mg/L +NAA0.2 0.6 mg/L+白糖30 50g/L+瓊脂粉5.5^8g/L+ 土豆汁6(T70 ml/L+活性炭粉0.3^0.7g/L，在溫度為23 25°C、光照強度為150(Γ25001χ、光照時間為9 11小時/天的條件下，培養(yǎng)45 60天，形成原球莖； (2)原球莖增殖培養(yǎng) 將生長良好的原球莖轉接入下列增殖培養(yǎng)基中:MS+白糖3(T50g/L+瓊脂粉5.5^8g/L+6-BA0.5 0.8mg/L+NAA0.Γθ.8mg/L+ 土豆汁 3(T50ml/L+ 紅薯汁 3(T80ml/L+ 活性炭粉0.2^0.9g/L，進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)的環(huán)境條件為:溫度25 27°C，光照強度180(Γ30001χ，光照時間1(Γ12小時/天，培養(yǎng)周期45 60天； (3)原球莖生根培養(yǎng) 將原球莖轉入下列生根 培養(yǎng)基中:MS+白糖2(T50g/L+瓊脂粉5.5 10g/L+NAA0.4 0.9mg/L+IAA 0.2 0.7mg/L+ 土豆汁 20 50ml/L+ 紅薯汁 60 80ml/L+ 活性炭粉 0.5 1.0g/L，在溫度為23 27°C、濕度為40 60%、光照強度為200(Γ30001χ、光照時間為11 13小時/天的條件下，培養(yǎng)7(Γ100天，得到生根苗； (4)生根苗誘導開花培養(yǎng) 將生根苗接種于下列誘導開花培養(yǎng)基中:MS+白糖3(T60g/L+瓊脂粉5.5 llg/L+ 土豆汁 3(T50g/L+BA0.2 0.6mg/L+NAA0.Γθ.9mg/L+PPP333 0.3 0.8mg/L+Spml.0 6.0mmoI/L+ZT1.5 6mg/L，進行誘導開花培養(yǎng)，培養(yǎng)的環(huán)境條件為:溫度22 25°C，濕度30 50%，光照強度230(Γ26001χ，光照時間11 13小時/天，培養(yǎng)周期60 85天； (5)授粉過程及結實培養(yǎng) 在經(jīng)誘導開花培養(yǎng)基培養(yǎng)后的植株中，選取具有完整花結構的健壯植株，在無菌環(huán)境中進行人工授粉，再將授粉后的植株轉接到下列授粉后培養(yǎng)基中:改良MS+白糖25 40g/L+ 瓊脂粉 5.5 10g/L+NAA 0.2 0.5mg/L+ 土豆汁 3(T50ml/L+ 紅薯汁 3(T50ml/L+ 活性炭粉0.5 0.8g/L，在溫度為22 25°C，濕度為40 60%，光照強度為250(Γ32001χ，光照時間為12 14小時/天的條件下，培養(yǎng)65 110天，得到鐵皮石斛蒴果；其中，改良MS培養(yǎng)基中ΚΝ03、KH2PO4和H3BO3用量為MS培養(yǎng)基中KNO3、KH2PO4和H3BO3用量的三倍，其余組分含量不變。
2.根據(jù)權利要求1所述的鐵皮石斛試管開花及結實的方法，其特征在于:每升MS培養(yǎng)基中含有的組分及各組分的重量如下=NH4NO3 165mg、KNO3 1900mg、CaCl2.2H20 440mg、MgSO4.7Η20 370mg, KH2PO4 170mg、KI 0.83mg, H3BO3 6.2mg、MnS04.H2O 16.9mg、ZnSO4.7H208.6mg、Na2MoO4.2H20 0.25mg、CuSO4.5H20 0.025mg、CoCl2.6H20 0.025mg、FeSO4.7H2027.8mg、Na2-EDTA.2H20 37.3mg、肌醇 100 mg、煙酸 0.5 mg、鹽酸吡哆醇 0.5 mg、鹽酸硫胺素0.I mg、甘氨酸2 mg ο
3.根據(jù)權利要求1所述的鐵皮石斛試管開花及結實的方法，其特征在于，所述鐵皮石斛為廣南紅桿軟腳鐵皮石斛；所選取的鐵皮石斛莖段的莖節(jié)間長為1.5^3cm ;所選取的鐵皮石斛蒴果的長為1.0^2.5cm、寬為0.8 2cm。
4.根據(jù)權利要求1所述的鐵皮石斛試管開花及結實的方法，其特征在于，所述外植體為鐵皮石斛莖段，對該鐵皮石斛莖段進行消毒的過程為:將選取好的鐵皮石斛莖段流水沖洗lOmin，用手術刀從鐵皮石斛莖段的節(jié)間切割，得到帶有葉芽的莖段，并將該莖段置于無菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒Imin,再用0.1%的升萊浸泡6min,然后用無菌水沖洗3 5次。
5.根據(jù)權利要求1所述的鐵皮石斛試管開花及結實的方法，其特征在于，所述外植體為鐵皮石斛蒴果，對該鐵皮石斛蒴果進行消毒的過程為:將選取好的蒴果流水沖洗8min，用84消毒液擦拭果夾,放于無菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒lmin，再用0.1%的升汞浸泡6min，然后用無菌水沖洗3飛次；將消毒后的蒴果切開，取種子作為外植體備用。
6.根據(jù)權 利要求1所述的鐵皮石斛試管開花及結實的方法，其特征在于:授粉時，選取高5cm以上、莖直徑為0.4^0.8cm、具有至少八片葉子展開且具有完整花結構的健壯植株作為授粉體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鐵皮石斛試管開花及結實的方法，該方法包括以下步驟采用鐵皮石斛莖段或蒴果作為外植體進行誘導培養(yǎng)，再經(jīng)原球莖增殖培養(yǎng)、原球莖生根培養(yǎng)、生根苗誘導開花培養(yǎng)及授粉過程及結實培養(yǎng)后，形成試管花及試管果實；該方法可以準確有效地調(diào)控鐵皮石斛試管開花率；并且，本發(fā)明采用在無菌環(huán)境中授粉及授粉后采用專用培養(yǎng)基進行結實培養(yǎng)，提高其結實率；所結果實的果夾直徑可達0.8～1cm，授粉結實率高達90%。
文檔編號A01H4/00GK103210842SQ201310041790
公開日2013年7月24日 申請日期2013年2月4日 優(yōu)先權日2013年2月4日
發(fā)明者林忠全 申請人:四川深達生物科技有限公司