專利名稱：一種多絲量且抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家蠶品種的選育方法，更具體地說，是涉及一種采用分子標(biāo)記輔助選擇法選育多絲量且抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的育種方法。
背景技術(shù)：
養(yǎng)蠶繅絲在我國已經(jīng)有五千多年的歷史，是我國的傳統(tǒng)優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)之一，也是我國能夠主導(dǎo)國際市場的少數(shù)產(chǎn)品之一，目前，我國的蠶繭和生絲產(chǎn)量均居世界第一，分別占世界總產(chǎn)量的70%左右。蠶絲業(yè)不僅對增加農(nóng)民收入和擴大勞動就業(yè)方面具有重要的作用，而且蠶的食物一桑樹在環(huán)境保護、退耕還林等方面也具有重要的作用和意義，因此，許多地區(qū)在生態(tài)保護和退耕還林中，把發(fā)展蠶桑業(yè)作為首選和重點項目。家蠶新品種選育是蠶絲業(yè)科技進步的基礎(chǔ)和核心之一，在新中國成立后，我國的家蠶品種選育取得了巨大的成就，在全國范圍內(nèi)先后進行了 4-5次蠶品種的更新?lián)Q代，極大地促進了蠶絲業(yè)的發(fā)展。然而，隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，勞動力成本也隨之增加，環(huán)境污染尤其是氟化物污染嚴重危害蠶業(yè)生產(chǎn)，選育經(jīng)濟性狀優(yōu)良，抗性強的家蠶品種已經(jīng)是迫在眉睫，也是穩(wěn)定蠶絲業(yè)的重要舉措之一。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，本課題組先后篩選了家蠶對濃核病鎮(zhèn)江株不感染基因nsd-Z 的 SSR 分子標(biāo)記(Muwang Li 等，Genome, 2006,49:397-402)和家香耐主基因 Def 的SSR分子標(biāo)記(白會釵等，蠶業(yè)科學(xué)，2008,34:191-196)，并篩選了家蠶繭絲性狀相關(guān)的數(shù)量性狀位點(Quantitative trait locus, QTL)的分子標(biāo)記(Shuai Zhan等，BMC Genomics,2009Aug21 ;10:389 ;王修業(yè)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院碩士論文，2010年)。本研究小組已經(jīng)申報了 “一種 選育兼抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的方法”(200810195255.2)的發(fā)明專利，到目前為止，還沒有結(jié)合使用QTL位點和抗性性狀分子標(biāo)記進行家蠶品種選育的報道。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題:本發(fā)明的目的是為了解決分子標(biāo)記用于家蠶多絲量多抗性品種選育的技術(shù)問題，提供一種采用分子標(biāo)記輔助選擇法選育多絲量且抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的育種方法。技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明的一種抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法，其技術(shù)方案包括如下步驟:(I)以“菁松”為多絲量中系親本，多化性品種“蘭10”為抗?jié)夂瞬?yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本進行雜交，得雜交I代；再用雜交I代與耐氟優(yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本“T6”雜交，獲得雜交2代；雜交2代再次與“菁松”回交，獲得回交3代后自交繼代，進行系統(tǒng)選育；對每一世代在飼育過程中進行農(nóng)藝性狀選擇，留種個體采用分子標(biāo)記選擇其其多絲量、抗?jié)夂瞬　⒛头蛐?，獲得遺傳背景中多絲量等性狀與“菁松”相同，且對家蠶濃核病毒鎮(zhèn)江株不感染并全齡耐氟100mg/kg的目標(biāo)材料；
(2)以“皓月”為多絲量日系親本，多化性品種“蘭10”為抗?jié)夂瞬?yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本進行雜交，得雜交I代；再用雜交I代與耐氟優(yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本T6雜交，獲得雜交2代；雜交2代再次與皓月回交，獲得回交3代后自交繼代，進行系統(tǒng)選育；對每一世代在飼育過程中進行農(nóng)藝性狀選擇，留種個體采用分子標(biāo)記選擇其其多絲量、抗?jié)夂瞬?、耐氟基因型，獲得遺傳背景中多絲量等性狀與“皓月”相同，且對家蠶濃核病毒鎮(zhèn)江株不感染并全齡耐氟100mg/kg的目標(biāo)材料；(3)將步驟I所得材料雜交，獲得中系交原種；將步驟2所得材料雜交，獲得曰系交原種；(4)將中系交原種和日系交原種進行雜交，獲得的四元雜交種即為多絲量且抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種。 有益效果:本發(fā)明所提供的一種多絲量且抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法與傳統(tǒng)的雜交回交育種技術(shù)相比具有如下優(yōu)點:傳統(tǒng)的雜交育種技術(shù)存在工作量大，選擇可靠性差，特別是對于抗性選育必須累代或隔代添食病源或氟化物的方法來保證目標(biāo)性狀不丟失，不僅選育周期長，而且在添食病源時有可能造成環(huán)境污染，而本發(fā)明通過分子標(biāo)記輔助選擇多絲量性狀的遺傳背景和抗性親本的目標(biāo)性狀，可在3-4年內(nèi)快速高效培育出多絲量且兼抗?jié)夂瞬〖澳头募倚Q新品系。本發(fā)明方法育成的中系目標(biāo)材料主要特征為，中系二化性四眠品種，幼蟲為素斑，蠶體粗壯，食桑旺盛，發(fā)育整齊，老熟齊涌，體質(zhì)強健，不感染濃核病鎮(zhèn)江株，全齡耐氟100mg/kg (桑葉含氟量)。催青經(jīng)過10日，幼蟲期經(jīng)過23-24天，蛹期經(jīng)過14-15天，繭形橢圓，繭色潔白，縮皺中等，全繭量1.9-2.lg，繭層率24%左右，繭絲長1350米左右，解舒好。羽化集中，雄蛾活潑、交配性能好,雌蛾產(chǎn)卵性能良好,單蛾卵數(shù)500-600粒，中系目標(biāo)材料的交原種與日系目標(biāo)材料的交原種對交需推遲2日開始飼養(yǎng)。育成的日系目標(biāo)材料；主要特征為，日系二化性四眠品種，幼蟲為普斑，蠶體粗壯，食桑旺盛，發(fā)育整齊，老熟較齊，體質(zhì)強健，不感染濃核病鎮(zhèn)江株，全齡耐氟100mg/kg (桑葉含氟量)。催青經(jīng)過10日，幼蟲期經(jīng)過24-25天，蛹期經(jīng)過15-16天，繭形淺束腰，繭色潔白，縮皺中等，全繭量1.8-2.0g，繭層率23.5%左右，繭絲長1300米左右，解舒好。羽化集中，雄蛾活潑、交配性能好’雌蛾產(chǎn)卵性能良好，單蛾卵數(shù)500-600粒，日系目標(biāo)材料的交原種與中系目標(biāo)材料的交原種對交需提前2日開始飼養(yǎng)。


圖1.分子標(biāo)記F10316在中系材料選育過程中的擴增選擇效果圖1.蘭10 ；2 (菁松X蘭10)雜交1代；3.菁松；4-6.(菁松X蘭10) XT6雜交2代；7-9.菁松回交3代；10-28.自交后選擇的各代基因型；圖2.分子標(biāo)記S1214在中系材料選育過程中的擴增選擇效果圖1.T6 ；2 (菁松X蘭10)雜交1代；3.菁松；4_6.(菁松X蘭10) XT6雜交2代；7-9.菁松回交3代；10-28.自交后選擇的各代基因型；
圖3.分子標(biāo)記S0106在中系材料選育過程中的擴增選擇效果圖1.菁松；2 (菁松X蘭10)雜交I代；3.T6 ;4_6.(菁松X蘭10) XT6雜交2代；7-9.菁松回交3代；10-28.自交后選擇的各代基因型。
具體實施例方式實施例1:一、對采用材料的說明已有的研究結(jié)果表明，家蠶繭絲性狀有多基因控制，目前已經(jīng)篩選到多個位點的分子標(biāo)記(王修業(yè).家蠶繭絲相關(guān)性狀QTL和無鱗毛基因nlw的定位.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院碩士論文，2010 年 5 月；Shuai Zhan,等.An integrated geneticlinkage map forsilkworms with three parental combinations and its application to the mappingof single genes and QTL.BMC Genomics2009，10:389)。家香對濃核病鎮(zhèn)江株的不感染性由隱性單基因nsd-Z控制，只有在·基因純合情況下才能表現(xiàn)對濃核病鎮(zhèn)江株的不感染(完全抵抗)(胡雪芳，錢元駿，王紅林.家蠶濃核病毒(DNV)對不同蠶品種的侵染抵抗性.蠶業(yè)科學(xué)，1984，10 (2) =87^90);家蠶對氟化物的耐受性由顯性主效基因Def控制(耐氟閾值為200mg/kg)(林昌麟，糜懿殿，姚勤，等.家蠶耐氟顯性主效基因的發(fā)現(xiàn)，蠶業(yè)科學(xué)，1997，23(4):237-239)，只要該基因存在，無論是雜合型還是純合型，都表現(xiàn)出對氟化物的耐受性。(一)、多絲量親本菁松、皓月菁松X皓月是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所選育，在我國使用最為廣泛的一對家蠶雜交組合，它的產(chǎn)量高、絲質(zhì)優(yōu)、體質(zhì)強健，但是對濃核病敏感并且耐氟能力差。(二)、對濃核病鎮(zhèn)江株不感染親本家蠶品種蘭10 (公知公用，《中國家蠶品種志》農(nóng)業(yè)出版社，1987年5月，第193頁)；1、來源:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所收集保存的家蠶品種。2、主要特征特性:中國系統(tǒng)、有滯育多化性四眠品種，幼蟲素斑，蠶體細小，發(fā)育整齊，體質(zhì)強，老熟齊涌，多營上層繭。催青經(jīng)過10日，幼蟲期經(jīng)過17日8小時，蛹期經(jīng)過12日，繭形束腰、淺束腰，繭色潔白，縮皺細，全繭量0.77g左右，繭層率11%左右，繭絲長343米左右，解舒良好，羽化集中，單蛾產(chǎn)卵粒數(shù)300粒左右，對濃核病鎮(zhèn)江株不感染。(三)、家蠶耐氟親本品種T6(公知公用，見參考文獻:林昌麟，糜懿殿，姚勤，等.家蠶耐氟顯性主效基因的發(fā)現(xiàn)，蠶業(yè)科學(xué)，1997，23 (4): 237-239)，1、來源:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院收集保存的家蠶品種，并對外合作共享。2、主要特征特性:日本系統(tǒng)二化性四眠品種，幼蟲普斑，蠶體細長，食?？?，發(fā)育整齊，體質(zhì)強，老熟齊涌，多營上層繭。催青經(jīng)過10日，幼蟲期經(jīng)過26天左右小時，蛹期經(jīng)過15-16天，繭形長筒淺束，繭色白，縮皺中等，全繭量1.6-1.8g，繭層率24%左右，羽化集中，單蛾產(chǎn)卵粒數(shù)500粒左右，高度耐氟(閾值200mg/kg)。二、具體實施步驟:(I)、用菁松為中國系統(tǒng)多絲量親本，蘭10為濃核病不感染基因供體，T6為耐氟主效基因供體，用菁松與蘭10進行雜交后，得其Fl再與T6雜交，S卩(菁松X蘭10) XT6，之后用菁松再次回交，之后進行自交，進行系統(tǒng)選育，飼育過程中對品種的農(nóng)藝性狀進行綜合篩選，采用分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀進行篩選，獲得多絲量且對濃核病鎮(zhèn)江株不感染并高度耐氣的中系目標(biāo)材料。(2)用皓月為日本系統(tǒng)多絲量親本，蘭10為濃核病不感染基因供體，T6為耐氟主效基因供體，用皓月與蘭10進行雜交后，得其Fl再與T6雜交，S卩(皓月X蘭10) XT6，之后用皓月再次回交，之后進行自交，進行系統(tǒng)選育，飼育過程中對品種的農(nóng)藝性狀進行綜合篩選，采用分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀進行篩選，獲得遺傳背景與皓月相同，且對濃核病鎮(zhèn)江株不感染并高度耐氟的日系目標(biāo)材料。(3)將中系目標(biāo)材料進行雜交，獲得中系交原種；將日系目標(biāo)材料進行雜交，獲得日系交原種，(4)將中系交原種和日系交原種進行雜交，獲得的四元雜交種即為多絲量且抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種。三、對多絲量、濃核病不感染基因及耐氟主基因的PCR的檢測提取待檢測的家蠶蛾的基因組DNA，取20-50ng作模板，用與繭絲性狀主效QTL連鎖的SSR或STS標(biāo)記C232S1、S0106、S2304、S2324 (4對引物均為公知公用，分別見文獻王修業(yè).家蠶繭絲相關(guān)性狀QTL和無鱗毛基因nlw的定位.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院碩士論文，2010年5月；Shuai Zhan, Jianhua Huang,Qiuhong Guo,Yunpo Zhao,Weihua Li,XuexiaMiao, Marian R Goldsmith, Muwang Li and Yongping Huang.An integrated geneticlinkage map for silkworms with three parental combinations and its applicationto the mapping of single genes and QTL.BMC Genomics2009,10:389),用與nsd_Z基因連鎖的SSR標(biāo)記引物F10316和F10568進行擴增(2對引物均為公知公用，見文獻MuwangLi 等，Linkage and mapping analyses of the densonucleosis non-susceptible genensd-Z in the silkworm Bombyx mori using SSR markers.Genome,2006,49:397-402)；用與Def基因連鎖的SSR標(biāo)記引物S1214和S121201進行擴增(2對引物均為公知公用，見文獻白會釵等，利用SSR 標(biāo)記對家蠶耐氟基因進行連鎖定位分析蠶業(yè)科學(xué)，2008，34:191-196)。SO106引物序列:左端引物序列:5'-GCAITCAAACCTAAGTCAAATCAAA-3'右端引物序列:5'-TGGCACAGTCTTTATGITTGGCT-3'C232S1 引物序列:左端引物序列:5'-GTCCGGTATACGCGAACAIT-3'右端引物序列:5'-GGCGATACCGITGTITCAIT-3'S2304引物序列:左端引物序列:5'-ATGACAATACGCTTTATCACCAGG-3'右端引物序列:5'-ATGGGTTAGITCGCTCGTCG-3'S2324引物序列:左端引物序列:5'-CGITTATACCATCGCACCGC-3'右端引物序列:5'-TTATGGGTACGCATACAGTCCAA-3'F10316 引物序列:左端引物序列:5'-GCGATAAGACCGCCTAITGAAC-3'
右端引物序列:5-GTGTATTAGGCACGAGAACTGACG-3'F10568 引物序列:左端引物序列:5'-TCGTCCTACACTTGCGGGIT-3'右端引物序列:5-TGTITCGTCAAGTCTGCTCGGT-3'S121201 引物序列:左端引物序列:5'-AGirCTTGCTTGITTCCGITCT-3'右端引物序列:5-CGCCGTATGTAITTAITCCTCA-3'S1214引物序列:左端引物序列:5'-AATGGATGCGTGCCAGITTG-3'右端引物序列:5-CGTTAGITGCTCTACGCTITTGG-3'PCR反應(yīng)程序按照4篇文獻的程序:95 °C變性3min，63 °C退火40s，72 °C延伸Imin ; 16 個 Touchdown 循環(huán)，94°C、45s,退火溫度依次遞減 0.5°C直到 56°C 40s, 72°C Imin ；94°C 40s, 56°C 40s, 72°C lmin，24 個循環(huán)；72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物用 eGene 的 HAD-GT12 全自動毛細管核酸分析系統(tǒng)檢測。在雜交過程中選擇的個體PCR產(chǎn)物經(jīng)HAD-GT12全自動毛細管核酸分析系統(tǒng)檢測為2條帶的，為雜合型，表現(xiàn)I條帶的為純合型。育種開始時，(菁松X蘭10)F1和(皓月X蘭10) Fl所有個體均為雜合型，無需檢測。(菁松X蘭10) XT6、(皓月X蘭10) XT6個體中耐氟基因在所有個體中均為雜合型，無需檢測；用繭絲性狀QTL的分子標(biāo)記和抗DNV的分子標(biāo)記進行檢測，留表現(xiàn)2條帶(雜合型)的個體再次與菁松或皓月雜交。選擇后代的個體繭絲性狀的分子標(biāo)記表現(xiàn)為與菁松或皓月一致的純合型(一條帶)，抗DNV以及耐氟表現(xiàn)為雜合型(2條帶)的個體進行自交，進入系統(tǒng)選育過程，在系統(tǒng)選育中，選擇繭絲性狀選擇與菁松一致的帶型(純合型)、抗DNV性狀選擇與蘭10 —致的帶型、耐氟性狀選擇與T6 —致的帶型的個體繼代，表明該個體攜帶的目標(biāo)基因已經(jīng)純合，可以使用，淘汰帶型與雜合型(2條帶)的個體。SEQUENCE LISTING〈110〉江蘇科技大學(xué)〈120〉一種多絲量且抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法〈130〉<160>16<170>PatentIn version3.3<210>1<211>25<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉Igcattcaaac ctaagtcaaa tcaaa25<210>2
<211>23<212>DNA
〈213〉人工序列<400>2tggcacagtc tttatgtttg get23<210>3<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<400>3gtccggtata cgcgaacatt20<210>4<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<400>4
ggcgataccg ttgtttcatt20<210>5<211>24<212>DNA〈213〉人工序列<400>5atgacaatac gctttatcac cagg24<210>6<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<400>6atgggttagt tcgctcgtcg20<210>7<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<400>7cgtttatacc atcgcaccgc20<210>8<211>23<212>DNA〈213〉人工序列<400>8ttatgggtac gcatacagtc caa23
<210>9<211>22<212>DNA〈213〉人工序列<400>9gcgataagac cgcctattga ac22<210>10<211>24<212>DNA〈213〉人工序列<400>10gtgtattagg cacgagaact gacg24<210>11<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉11tcgtcctaca cttgcgggtt20<210>12<211>22<212>DNA〈213〉人工序列<400>12tgtttcgtca agtctgctcg gt22<210>13<211>22<212>DNA〈213〉人工序列

<400>13agttcttgct tgtttccgtt ct22<210>14<211>22<212>DNA〈213〉人工序列<400>14cgccgtatgt atttattcct ca22<210>15<211>20<212>DNA
〈213〉人工序列<400>15aatggatgcg tgccagtttg20<210>16<211>23<212>DNA〈213〉人工序列<400>16cgttagttgc tctacgcttt tgg23·
權(quán)利要求
1.一種多絲量且抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)以“菁松”為多絲量中系親本，多化性品種“蘭10”為抗?jié)夂瞬?yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本進行雜交，得雜交I代；再用雜交I代與耐氟優(yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本“T6”雜交，獲得雜交2代；雜交2代再次與“菁松”回交，獲得回交3代后自交繼代，進行系統(tǒng)選育；對每一世代在飼育過程中進行農(nóng)藝性狀選擇，留種個體采用分子標(biāo)記選擇其多絲量、抗?jié)夂瞬?、耐氟基因型，獲得遺傳背景中多絲量等性狀與“菁松”相同，且對家蠶濃核病毒鎮(zhèn)江株不感染并全齡耐氟100mg/kg的目標(biāo)材料； (2)以“皓月”為多絲量日系親本，多化性品種“蘭10”為抗?jié)夂瞬?yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本進行雜交，得雜交I代；再用雜交I代與耐氟優(yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本T6雜交，獲得雜交2代；雜交2代再次與皓月回交，獲得回交3代后自交繼代，進行系統(tǒng)選育；對每一世代在飼育過程中進行農(nóng)藝性狀選擇，留種個體采用分子標(biāo)記選擇其其多絲量、抗?jié)夂瞬　⒛头蛐?，獲得遺傳背景中多絲量等性狀與“皓月”相同，且對家蠶濃核病毒鎮(zhèn)江株不感染并全齡耐氟100mg/kg的目標(biāo)材料； (3)將步驟I所得中系目標(biāo)材料雜交，獲得中系交原種；將步驟2所得日系目標(biāo)材料雜交，獲得日系交原種； (4)將中系交原種和日系交原種進行雜交，獲得的四元雜交種即為多絲量且抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q 品種。
全文摘要
一種多絲量且抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法，包括如下步驟以“菁松”為多絲量中系親本，多化性品種“蘭10”為抗?jié)夂瞬?yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本進行雜交，獲得中系目標(biāo)材料；以“皓月”為多絲量日系親本，多化性品種“蘭10”為抗?jié)夂瞬?yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本進行雜交，日系目標(biāo)材料；將上步所得中系目標(biāo)材料雜交，獲得中系交原種；將上步所得日系目標(biāo)材料雜交，獲得日系交原種；將中系交原種和日系交原種進行雜交，獲得的四元雜交種即為多絲量且抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種。本發(fā)明通過分子標(biāo)記輔助選擇多絲量性狀的遺傳背景和抗性親本的目標(biāo)性狀，可在3-4年內(nèi)快速高效培育出多絲量且兼抗?jié)夂瞬〖澳头募倚Q新品系。
文檔編號A01K67/033GK103070138SQ201310043960
公開日2013年5月1日 申請日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者侯成香, 李木旺, 黃勇平, 譚安紅, 郭錫杰 申請人:江蘇科技大學(xué)