專利名稱：一種小鼠異基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種小鼠異基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法。建立具有模擬臨床異基因造血干細(xì)胞移植后慢性移植物抗宿主病特點(diǎn)的疾病模型，可為慢性移植物抗宿主病的發(fā)生機(jī)制和診治方法提供研究平臺(tái)。
背景技術(shù)：
慢性移植物抗宿主病是異基因造血干細(xì)胞移植后的主要并發(fā)癥和死亡原因，成為影響患者生活質(zhì)量和長(zhǎng)期生存的關(guān)鍵因素。進(jìn)一步明確cGVHD發(fā)生機(jī)制，研究積極有效的治療方法，降低或減輕其發(fā)生及病程，具有重要的實(shí)際意義。因此，cGVHD動(dòng)物模型的建立，是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。目前大部分cGVHD動(dòng)物模型建立在H-2抗原半相合或微小不合的小鼠間移植，主要表現(xiàn)為狼瘡樣(SLE-cGVHD)，受累靶器官主要為皮膚、腎臟、肝臟和小腸；及硬皮樣(Scl-cGVHD)，受累靶器官主要為皮膚。肺部cGVHD的模型曾有個(gè)別報(bào)道，因需要在預(yù)處理過(guò)程中使用環(huán)磷酰胺，考慮到藥物本身對(duì)肺部的損害作用，該模型還有待進(jìn)一步優(yōu)化。本研究使用H-2抗原半相合小鼠，供鼠、受鼠均來(lái)源于國(guó)內(nèi)常用的小鼠品系，方法簡(jiǎn)便；并且本研究中供受鼠配對(duì)模式與國(guó)內(nèi)外相似研究報(bào)道不同，輸注脾細(xì)胞數(shù)量較少，成模時(shí)間及癥狀符合臨床異基因造血干細(xì)胞移植后慢性移植物抗宿主病的發(fā)生發(fā)展特點(diǎn)，肺部及皮膚cGVHD的表現(xiàn)非常典型，肝臟亦有部分cGVHD的表現(xiàn)。本方法提供了研究cGVHD的新模型，為國(guó)內(nèi)大多數(shù)研究中心能夠開(kāi)展cGVHD發(fā)病機(jī)制、藥物試驗(yàn)、細(xì)胞免疫治療等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種小鼠異基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn):
(I)以 C57BL/6 雌鼠(H_2b)與 BALB/c 雄鼠(H_2d)雜交出的 CB6F1 (H_2bxd)代雄性小鼠作為供鼠；(2)以BALB/c (H_2d)雌性小鼠作為受鼠；(3 )受鼠接受全身照射預(yù)處理后，將獲自供鼠的骨髓細(xì)胞BMC懸液及脾細(xì)胞SpC懸液注射至受鼠。優(yōu)選地，所述供鼠及受鼠均采用8周齡小鼠。具體地來(lái)說(shuō)，所述步驟(3)中，供鼠骨髓細(xì)胞BMC懸液的制備如下:以頸椎脫臼法處死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡3 5min，無(wú)菌剝離股骨和脛骨，用RPMI1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集含有骨髓的沖洗液制成單細(xì)胞懸液，過(guò)濾后用紅細(xì)胞裂解液破除紅細(xì)胞，RPMI1640洗滌若干次，計(jì)數(shù)并用RPMI1640重懸細(xì)胞，調(diào)整至5X 10~7/mL細(xì)胞濃度備用。具體地來(lái)說(shuō)，所述步驟(3)中，供鼠脾細(xì)胞SpC懸液的制備如下:以頸椎脫臼法處死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡3飛min，無(wú)菌取出脾臟，去除脾臟周圍系膜組織，移入平皿內(nèi)用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌若干次，碾磨，收集細(xì)胞沖洗液制成單細(xì)胞懸液，過(guò)濾后用紅細(xì)胞裂解液破除紅細(xì)胞，用RPMI1640洗滌若干次，計(jì)數(shù)并用RPMI1640重懸細(xì)胞，調(diào)整至
2.5X10~7/mL細(xì)胞濃度備用。具體地來(lái)說(shuō)，所述步驟(3)中，移植當(dāng)日受鼠接受直線加速器700cGy單次全身照射預(yù)處理，照射后立即補(bǔ)充飲水，休息4飛小時(shí)后經(jīng)尾靜脈注射終體積為0.4mL的骨髓細(xì)胞BMC懸液及脾細(xì)胞SpC懸液。優(yōu)選地，所述步驟(3)中，注射給受鼠的骨髓細(xì)胞BMC懸液的用量為1X10~7BMC，脾細(xì)胞SpC懸液的用量為5X10~6。本發(fā)明通過(guò)應(yīng)用H-2抗原半相合子代小鼠的骨髓及脾細(xì)胞，移植給致死劑量輻照后的父代但不同性別的小鼠，建立一種異基因骨髓移植后cGVHD模型。其具有如下特點(diǎn):(O該模型具有模擬臨床上異基因造血干細(xì)胞移植后慢性移植物抗宿主病的特點(diǎn)；(2)建模型效率高，重復(fù)性好；(3)造模所需小鼠容易獲得，過(guò)程簡(jiǎn)單易行；(4)肺部、皮膚、肝臟等多器官同時(shí)發(fā)生典型病理改變；(5)移植后的小鼠存活時(shí)間長(zhǎng)，更接近人類cGVHD的病征表現(xiàn)，為在活體動(dòng)物內(nèi)進(jìn)行防治人類cGVHD的研究提供新的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。


圖1是cGVHD實(shí)驗(yàn)組小鼠的臨床評(píng)分示意圖(圖例中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，η = 5)圖2是cGVHD實(shí)驗(yàn)組小鼠臨床表現(xiàn)；圖3是空白對(duì)照組和cGVHD實(shí)驗(yàn)組小鼠移植后+135d染色體圖；圖4是移植對(duì)照組和cGVHD實(shí)驗(yàn)組小鼠135d處死后分離的肺、皮膚和肝臟的病理活檢HE染色圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。本實(shí)驗(yàn)所用小鼠均購(gòu)自廣州市中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)施例一本例為本發(fā)明的小鼠異基因骨髓移植后慢性移植物抗宿主病模型的建立例，按以下步驟操作:一、供鼠準(zhǔn)備1、無(wú)特定病原體(Specefic pathogen Free, SPF)級(jí) C57BL/6 雌性小鼠(H_2b)8 —10周齡與SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠(H_2d) 8—10周齡，2:1比例交配。2、選擇雜合子Fl代，雄性，飼養(yǎng)至8周齡，作為供鼠備用。二、受鼠準(zhǔn)備SPF級(jí)BALB/c小鼠(H_2d),雌性,8周齡,作為受鼠。將受鼠隨機(jī)分為4組,每組5只;其中，A、正常對(duì)照組:同步飼養(yǎng)，無(wú)干預(yù)；B、放射對(duì)照組:TB I+RPMI1640，即對(duì)組內(nèi)小鼠進(jìn)行全身照射(TBI)處理，經(jīng)尾靜脈注射PRMI1640培養(yǎng)液；C、移植對(duì)照組:TBI+1X 10~7BMC，即對(duì)組內(nèi)小鼠進(jìn)行全身照射(TBI)處理，經(jīng)尾靜脈注射經(jīng)PRMI1640培養(yǎng)液處理的骨髓細(xì)胞BMC懸液；D、cGVHD組:TBI+1 X 10~7BMC + 5X 10~6SpC，即對(duì)組內(nèi)小鼠進(jìn)行全身照射(TBI)處理，經(jīng)尾靜脈注射經(jīng)PRMI1640培養(yǎng)液處理的骨髓細(xì)胞BMC懸液及脾細(xì)胞SpC懸液。三、根據(jù)以上分組，采用下述步驟進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)操作:1、異基因骨髓移植前一周對(duì)各組受鼠在層流動(dòng)物房?jī)?nèi)接受添加抗生素(紅霉素250mg/L，慶大霉素32萬(wàn)U/L)的滅菌飲水進(jìn)行腸道準(zhǔn)備，并維持至移植后3周。2、移植當(dāng)日(0d)，對(duì)B、C、D組受鼠接受直線加速器700cGy單次全身照射(TBI)預(yù)處理。照射后立即補(bǔ)充飲水，休息4飛小時(shí)后經(jīng)尾靜脈注射終體積為0.4mL的移植細(xì)胞懸液。對(duì)照組B組小鼠中每只從尾靜脈輸注RPMI1640培養(yǎng)液0.4mL ；對(duì)照組C組小鼠中每只從尾靜脈輸注RPMI1640細(xì)胞懸液0.4mL,包括1X10~7BMC ；D組小鼠中每只從尾靜脈輸注RPMI1640細(xì)胞懸液0.4mL，包括I X 10~7BMC和5X10~6SpC。其中，骨髓細(xì)胞(BMC)懸液制備操作如下:采用頸椎脫臼法處死供鼠，立即放入75%乙醇中浸泡3 5min ;超凈工作臺(tái)中無(wú)菌剝離股骨和脛骨，用RPMI1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集含有骨髓的沖洗液通過(guò)4號(hào)針頭制成單細(xì)胞懸液，過(guò)濾，用紅細(xì)胞裂解液破除紅細(xì)胞，RPMI1640洗滌3次，計(jì)數(shù)并用RPMI1640重懸細(xì)胞，調(diào)整至5X 10~7/mL細(xì)胞濃度備用。脾細(xì)胞(SpC)懸液制備操作如下:無(wú)菌取出脾臟，小心去除脾臟周圍系膜組織，移入平皿內(nèi)用RPM I1640培養(yǎng)液洗滌3遍，然后置于200目不銹鋼篩網(wǎng)中用2mL注射器內(nèi)芯輕輕碾磨，收集細(xì)胞沖洗液通過(guò)4號(hào)針頭制成單細(xì)胞懸液，過(guò)濾，用紅細(xì)胞裂解液破除紅細(xì)胞，用RPMI1640洗滌3次，計(jì)數(shù)并用RPMI1640重懸細(xì)胞，調(diào)整至2.5 X 10~7/mL細(xì)胞濃度備用。移植后每天觀察小鼠一般狀態(tài)，包括體重、皮疹、脫毛、結(jié)痂、弓背、腹瀉等，移植14天后每3天進(jìn)行一次臨床評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)表I ;瀕死小鼠處死取材，其存活時(shí)間記至處死次日；實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)為移植后+135d。外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù):每組小鼠于+7d、+10d和+14d計(jì)數(shù)WBC監(jiān)測(cè)造血重建情況。計(jì)數(shù)方法:斷尾取血10 μ L，加入190 μ L白細(xì)胞稀釋液中混勻，然后滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，水平靜置Imin后計(jì)數(shù)4個(gè)大方格中細(xì)胞數(shù)(N)，WBC= (Ν+20)Χ10~9/L0移植觀察記錄表明:Α組小鼠正常存活至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)；Β組小鼠中位存活12.5天，14天內(nèi)全部死亡；C、D組小鼠存活至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。以上記錄表明C、D組均移植成功，且存活時(shí)間達(dá)到100天以上，比現(xiàn)有的類似疾病動(dòng)物模型建立的存活時(shí)間長(zhǎng)。實(shí)施例2本例為小鼠異基因骨髓植入檢測(cè)例。取移植后+135d的受鼠進(jìn)行檢測(cè)，按以下步驟進(jìn)行:1、秋水仙素處理:在做實(shí)驗(yàn)前3 4小時(shí)，向小鼠腹腔注射0.1 %的秋水仙素(2-4yg/g)。2、取股骨:實(shí)驗(yàn)時(shí)，用頸椎脫臼法迅速將小鼠處死，立即用剪刀剪去后肢的皮膚和肌肉，連同關(guān)節(jié)一起取下兩側(cè)股骨，剔凈其上肌肉。3、取骨髓細(xì)胞:用注射器吸取6ml生理鹽水，將注射器針頭插入骨髓腔的一端，用生理鹽水沖出骨髓細(xì)胞至離心管，反復(fù)沖洗直至骨腔變白。將收集到的骨髓細(xì)胞溶液平衡后放入離心機(jī)，以1000r/min離心IOmin,吸去上清液。4、低滲:根據(jù)細(xì)胞量多少，加入0.075mol/L KCl低滲液5_6ml，用吸管輕輕吹打混勻，在37 °C恒溫水浴箱內(nèi)低滲20-30分鐘。5、預(yù)固定:低滲完畢,立即加l_2ml新配制的Carnoy固定液,輕輕吹打之后，以2000r/min離心IOmin,小心吸管吸去上清液。6、固定:沿離心管壁緩慢加入固定液7ml，用吸管吹打成細(xì)胞懸液。2000rpm的速度離心10分鐘,傾去上清。7、再固定:重復(fù)步驟6的操作至上清基本無(wú)色清晰。8、制備細(xì)胞懸液:沉淀物中加入適量固定液，用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液。9、滴冰片:從冰箱里取出預(yù)冷的載玻片，手持吸管在載玻片上方約IOcm處向下滴片，2-3滴，使懸液均勻擴(kuò)散與玻片之上,多余的液體可小心傾去。10、干燥、火焰 固定:玻片于酒精燈外焰迅速來(lái)回幾下。11、玻片老化:置于37° C溫箱1-2天后，于65° C烤箱中24h。12、染色:低濃度胰酶消化,清水洗凈,Giemsa染液室溫下染色10分鐘左右。清水沖洗，在室溫下自然干燥。13、鏡檢:先用低倍鏡找到一好的分裂相區(qū)域，然后轉(zhuǎn)用高倍鏡觀察。如圖3所示，為來(lái)自于A組(空白對(duì)照組)和D組(cGVHD組)小鼠的染色體圖，箭頭所示為Y染色體。圖中染色體的改變也進(jìn)一步表明D組小鼠移植成功。實(shí)施例3本例為cGVHD組小鼠的臨床及病理檢測(cè)例。一、對(duì)D組小鼠進(jìn)行慢性GVHD的臨床評(píng)分，其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表I所示:表I慢性GVHD的臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
權(quán)利要求
1.一種小鼠異基因骨髓移植后CGVHD模型的建立方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)以C57BL/6小鼠(H-2b)與BALB/c小鼠(H_2d)雜交出的Fl代雄性小鼠作為供鼠； (2)以BALB/c(H-2d)雌性小鼠作為受鼠； (3)受鼠接受全身照射(TBI)預(yù)處理后，將獲自供鼠的骨髓細(xì)胞BMC懸液及脾細(xì)胞SpC懸液注射至受鼠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述供鼠及受鼠均采用8周齡小鼠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，供鼠骨髓細(xì)胞BMC懸液的制備如下:以頸椎脫臼法處死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡3 5min，無(wú)菌剝離股骨和脛骨，用RPMI1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集含有骨髓的沖洗液制成單細(xì)胞懸液，過(guò)濾后用紅細(xì)胞裂解液破除紅細(xì)胞，RPMI1640洗滌若干次，計(jì)數(shù)并用RPMI1640重懸細(xì)胞，調(diào)整至5X10~7/mL細(xì)胞濃度備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，供鼠脾細(xì)胞SpC懸液的制備如下:以頸椎脫臼法處死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡:T5min，無(wú)菌取出脾臟，去除脾臟周圍系膜組織，移入平皿內(nèi)用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌若干次，碾磨，收集細(xì)胞沖洗液制成單細(xì)胞懸液，過(guò)濾后用紅細(xì)胞裂解液破除紅細(xì)胞，用RPMI1640洗滌若干次，計(jì)數(shù)并用RPMI1640重懸細(xì)胞，調(diào)整至2.5X10~7/mL細(xì)胞濃度備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，移植當(dāng)日受鼠接受直線加速器700cGy單次全身照射預(yù)處理，照射后立即補(bǔ)充飲水，休息4飛小時(shí)后經(jīng)尾靜脈注射終體積為0.4mL的骨髓細(xì)胞BMC懸液及脾細(xì)胞SpC懸液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，注射給受鼠的骨髓細(xì)胞BMC懸液的用量為1X10~7BM C，脾細(xì)胞SpC懸液的用量為5X10~6。
全文摘要
本發(fā)明提供一種小鼠異基因骨髓移植后慢性移植物抗宿主病(cGVHD)模型的建立方法，通過(guò)制備異基因CB6F1(H-2bxd)雄性供鼠的骨髓和脾細(xì)胞，尾靜脈輸注給BALB/c(H-2d)雌性受鼠造模而實(shí)現(xiàn)。該模型造模方法具有模擬臨床上異基因造血干細(xì)胞移植后慢性移植物抗宿主病的發(fā)生發(fā)展特點(diǎn)；過(guò)程簡(jiǎn)單易行，建模效率高，重復(fù)性好，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相同報(bào)道；特別是肺部、皮膚的典型病理改變，為在活體動(dòng)物內(nèi)進(jìn)行防治人類cGVHD的研究提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
文檔編號(hào)A01K67/027GK103114074SQ20131005522
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者杜欣, 翁建宇, 黃欣, 吳萍, 耿素霞, 賴沛龍 申請(qǐng)人:廣東省人民醫(yī)院