專利名稱：十四酸乙酯在作為引誘雄性草地螟的性引誘劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病蟲(chóng)害防治領(lǐng)域，尤其涉及十四酸乙酯在作為引誘雄性草地螟的性引誘劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
草地螟(Loxostege sticticalis)是一種世界分布的遷飛性害蟲(chóng)，屬鱗翅目(Lepidoptera),螟蛾科(Pyralidae),野螟亞科(Pyraustinae),錐額野螟屬，別名甜菜網(wǎng)螟、黃綠條螟，主要分布于北緯34° 54°之間。草地螟幼蟲(chóng)食性較廣，可為害甜菜、苜蓿、大豆、馬鈴薯、亞麻、向日葵等多達(dá)80種以上的作物及牧草；并且幼蟲(chóng)具有暴食性，初齡幼蟲(chóng)取食葉肉組織，殘留表皮或葉脈，3齡后可食盡葉片，吃光一片作物以后再向其它地塊群集轉(zhuǎn)移危害，可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)農(nóng)作物造成毀滅性危害，前蘇聯(lián)、加拿大、美國(guó)、蒙古等數(shù)十個(gè)國(guó)家和地區(qū)都對(duì)其有嚴(yán)重危害的報(bào)道。草地螟在我國(guó)主要分布在華北、東北和西北地區(qū)，是北方農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的重大害蟲(chóng)，建國(guó)后已有三次爆發(fā)成災(zāi)，其中2008年草地螟I代成蟲(chóng)從俄羅斯及蒙古大量遷入我國(guó)，導(dǎo)致2代幼蟲(chóng)成為新中國(guó)成立以來(lái)發(fā)生面積最大、危害程度最重的一個(gè)世代。我國(guó)科研工作者針對(duì)草地螟作了大量的研究工作，在草地螟的生長(zhǎng)發(fā)育、遷飛規(guī)律、繁殖生物學(xué)等方面掌握了大量的數(shù)據(jù)資料，為草地螟的防治提供了依據(jù)。但由于草地螟具有遷飛性、間歇性爆發(fā)成災(zāi)的特點(diǎn)，給測(cè)報(bào)和防治帶來(lái)極大難度。尋找準(zhǔn)確、實(shí)效、便捷的蟲(chóng)情監(jiān)測(cè)和治理方法，成為防控我國(guó)草地螟爆發(fā)成災(zāi)亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。早在上世紀(jì)70年代，加拿大的Struble和Lilly就開(kāi)始探索草地螟的性信息素，他們最終確定Ell-14:Ac (反11-十四碳烯醋酸酯)為草地螟的引誘劑，添加與其相近的化合物El 1-14: OH (15%)、12: OH (6%)或者12: Ac (6%)能增加El 1-14: Ac的引誘效果，但這些化合物的增效作用在1974至1975年的田間誘集試驗(yàn)中并沒(méi)有得到很好的重復(fù)；同時(shí)，Ell-14: Ac、Ell-14:Ac與異構(gòu)體(5-10%)的混合物能誘到另外兩種雄蛾Hysterosia cartwrightana 和 Lymnaecia phragmitella。其他研究者的結(jié)果證實(shí)，除草地螟外，Ell-14:Ac對(duì)許多蛾類具有誘引作用，包括二化螟蛾(Archips podana)、玉米螟蛾(Ostrinia nubilalis)、云杉色卷蛾(Choristoneura fumiferana)以及其它多種有害蛾類。近年來(lái)，草地螟在我國(guó)北方連續(xù)爆發(fā)成災(zāi)，國(guó)內(nèi)研究者嘗試應(yīng)用人工合成Ell-14:Ac引誘雄蛾，但誘集效果均不理想，其原因可能是同一物種不同地理種群的雌蛾性信息素存在差異，這種差異可導(dǎo)致該信息素在我國(guó)的應(yīng)用失敗。因此，利用性信息素對(duì)我國(guó)北方草地螟進(jìn)行預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，防止草地螟爆發(fā)成災(zāi)，急需科研人員對(duì)我國(guó)草地螟的性信息素進(jìn)行鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供十四酸乙酯在作為引誘草地螟(Loxostegesticticalis)的性引誘劑中的應(yīng)用。所述草地螟(Loxostege sticticalis)為雄性草地螟。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種引誘草地螟(Loxostege sticticalis)的性引誘劑。本發(fā)明所提供的引誘草地螟(Loxostege sticticalis)的性引誘劑,其活性成分為十四酸乙酯。所述草地螟(Loxostege sticticalis)為雄性草地螟。十四酸乙酯在防治草地螟(Loxostege sticticalis)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。結(jié)合使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)、氣相色譜-觸角電位測(cè)量系統(tǒng)(GC-EAD)以及系列行為試驗(yàn)，對(duì)我國(guó)草地螟種群的性信息素進(jìn)行化學(xué)鑒定，并對(duì)雄蛾進(jìn)行野外誘引試驗(yàn)。研究結(jié)果證實(shí)，十四酸乙酯(Ethyl myristate)為草地螟雌蛾釋放的性引誘劑，雌蛾羽化后第3日(即3日齡)暗期便可進(jìn)入求偶(Calling)狀態(tài)，性腺?gòu)母共磕┒松斐?，釋放性信息素，吸引·雄蛾前?lái)交配。該研究成果將為應(yīng)用性信息素對(duì)我國(guó)草地螟進(jìn)行蟲(chóng)情監(jiān)測(cè)和防控提供理論依據(jù)，以期有效防止草地螟對(duì)北方農(nóng)牧業(yè)造成災(zāi)害。


圖1為用于行為試驗(yàn)的雙向選擇盒裝系統(tǒng)。系統(tǒng)由三個(gè)透明的食品塑料盒組成，釋放盒的兩端及備選盒的一側(cè)各打一直徑約4cm圓孔，釋放盒底部朝上置于中間、備選盒頂部朝上置于兩側(cè)，使圓孔兩兩相接緊湊形成一個(gè)封閉的系統(tǒng)。被測(cè)化合物和空白誘芯分別放入左右兩側(cè)備選盒中，氣味物質(zhì)在這一封閉系統(tǒng)中擴(kuò)散時(shí)形成濃度梯度；被試雄蛾引入中間的釋放盒內(nèi)，可自由選擇進(jìn)入左右兩個(gè)方向的備選盒。圖2為草地螟雌、雄蛾腹部末端粗提液的總離子流圖。非極性色譜柱HP5-MS(0.25mmx30mx0.25 μ m)分離提取，其中在色譜柱中保留時(shí)間為26.87分鐘的色譜峰為雌蛾粗提液中特有的化合物。圖3為草地螟雌蛾特有化合物色譜峰的質(zhì)譜特征圖(a)與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品十四酸乙酯的質(zhì)譜特征圖(b)通過(guò)譜庫(kù)檢索(NIST，2002)初步確定雌蛾特有色譜峰對(duì)應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)，經(jīng)非極性柱(HP5-MS)和極性柱(DB-Wax)分離檢測(cè)人工合成標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品十四酸乙酯，對(duì)比人工標(biāo)準(zhǔn)品與雌蛾提取液中特有化合物的保留時(shí)間和離子譜，最終確定該雌蛾特有的化合物為十四酸乙酯。圖4為草地螟雄蛾對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品十四酸乙酯的觸角電位反應(yīng)。草地螟雄蛾觸角對(duì)合成化合物十四酸乙酯有顯著和可重復(fù)的電位反應(yīng)，F(xiàn)ID (Flame ionization detector)的縱軸放大倍數(shù)為10mV/div, EAD (Eectroantennographic detector)的縱軸放大倍數(shù)為ImV/div0圖5為草地螟雄蛾對(duì)十四酸乙酯的雙向選擇試驗(yàn)結(jié)果。雙向選擇盒裝系統(tǒng)的其中一個(gè)備選盒放入滴有十四酸乙酯溶液(50ng/ μ LX 10 μ L)的橡膠誘芯，另一個(gè)備選盒(對(duì)照盒)放入滴有等量二氯甲烷的誘芯。被試雄蛾引入釋放盒后會(huì)在兩個(gè)備選盒中作出選擇，少數(shù)雄蛾在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)選擇行為。樣本量為40頭雄蛾，對(duì)照與處理之間差異顯著(卡方檢驗(yàn)，P=0.012)。圖6為2011年6月河北省康?？h北關(guān)村檸條地誘引試驗(yàn)。單個(gè)誘捕器最多誘到草地螟雄蛾17頭，橡膠誘芯內(nèi)性誘劑為十四酸乙酯IyL (50ng/yLX20yL)。圖7為野外生測(cè)誘蛾數(shù)量對(duì)比。2011年與2012年各進(jìn)行一次野外誘引，2011年使用的誘捕器為深綠色船形，2012年使用的為白色三角形誘捕器。處理組誘捕器內(nèi)置性誘劑誘芯(劑量為50ng/ μ LX 20 μ L)，對(duì)照組誘芯僅有20 μ L 二氯甲烷，每組6個(gè)誘捕器。兩次誘引處理組與對(duì)照組的誘蛾量差異均達(dá)到顯著(單因素方差分析，P值分別為0.010和
0.047)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)施例1、十四酸乙酯在作為引誘雄性草地螟的性引誘劑中的應(yīng)用一、供試蟲(chóng)源2010年冬季從河北省康?？h北關(guān)村采集草地螟蛹，帶回實(shí)驗(yàn)室置于人工氣候箱(RXZ-268B，寧波江南儀器廠)，設(shè)定溫度為22±1°C，濕度70±5%，光周期16L:8D。待其羽化后交配產(chǎn)卵進(jìn)行人工飼養(yǎng)。幼蟲(chóng)用玻璃瓶(直徑8cm，高IOm)以30頭/瓶的密度分裝，尼龍紗布封口，飼以灰藜(Chenopodium album);雌、雄成蟲(chóng)用透明塑料罩(直徑8cm,高20m)分開(kāi)飼養(yǎng),尼龍紗布封口，飼以10%葡萄糖水。二、樣品制備草地螟雌雄成蟲(chóng)的交配行為發(fā)生于暗期后4 8h之間，其交配高峰期在暗期最后2h。雌蛾的性腺位于腹部末端的8-9節(jié)間膜的腹面，未求偶時(shí)第9腹節(jié)套縮在第8腹節(jié)之內(nèi)，雌蛾在進(jìn)入暗期一段時(shí)間后，腹部開(kāi)始向上翹起，產(chǎn)卵器外伸，性腺外露以釋放性信息素，保持姿勢(shì)以等待雄蛾前來(lái)交配。我們將雌、雄蛾進(jìn)行一一配對(duì)，在暗期觀察求偶和交配行為。當(dāng)雌、雄蛾進(jìn)入預(yù)交尾階段時(shí)，即用手術(shù)剪將雌(N=77)、雄(N=99)蛾的腹部末端剪下放入樣品瓶，加入400 μ L 二氯甲烷(純度>99.5%，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司)浸沒(méi)，密封提取2h后將浸提液保存 于-20° C冰箱備用。三、化學(xué)分析(GC-MS)利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Gaschromatography-mass spectrometry, GC-MS,Agilent 6890N GC-5973MS，)分別對(duì)草地螟雌、雄蛾浸提液進(jìn)行分離和檢測(cè)，通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)(NIST Mass Spectral Library, 2002 version,安捷倫科技有限公司，美國(guó))對(duì)分離出的化合物進(jìn)行定性分析。GC-MS測(cè)試條件:色譜柱為HP5-MS(長(zhǎng)30m，內(nèi)徑0.25mm,膜厚0.25 μ m，Agilent 19091S-433);載氣為高純He (99.999 % )，載氣流速為1.0ml/min ;進(jìn)樣口溫度220°C，進(jìn)樣量2μ 1，無(wú)分流進(jìn)樣模式；程序升溫50°C開(kāi)始，以5°C /min升至260°C，保留8min ；電離方式EI，電離能量70eV，四極桿溫度150°C，離子源溫度230°C，掃描質(zhì)量范圍30-450amu。人工合成標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品十四酸乙酯(Ethyl myristate,純度彡98%,北京百靈威科技有限公司)。標(biāo)準(zhǔn)品分別經(jīng)非極性柱(HP5-MS)和極性柱(DB-Wax，長(zhǎng)30m，內(nèi)徑0.25mm,膜厚0.25 μ m)分離檢測(cè)，以確定提取液中相應(yīng)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。性誘劑候選組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定(GC-MS)結(jié)果:通過(guò)GC-MS的分離和分析，我們?cè)诓莸孛?、雄蛾腹部末端的粗提液中共檢測(cè)到20多種化合物(圖2)，大部分是直鏈的脂肪族化合物，包括醛、酮、酸、烯和烷。其中在色譜柱中保留時(shí)間為26.87分鐘的色譜峰為雌蛾粗提液中特有的峰，而雄蛾的粗提液中無(wú)此對(duì)應(yīng)峰。因此，我們認(rèn)為該化合物可能為雌蛾性腺釋放的性引誘物質(zhì)。根據(jù)該化合物在色譜柱的保留時(shí)間以及離子譜特征，在GC-MS譜庫(kù)中進(jìn)行檢索，初步確定此色譜峰相應(yīng)化合物為十四酸乙酯。人工合成標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品十四酸乙酯經(jīng)非極性柱(HP5-MS )和極性柱(DB-Wax )進(jìn)行分離檢測(cè)，對(duì)比人工標(biāo)準(zhǔn)品和雌蛾提取液中特有化合物的保留時(shí)間和離子譜，最終確定雌蛾特有的化合物為十四酸乙酯(圖3)。四、電生理活性測(cè)試(GC-EAD)使用氣相色譜-觸角電位測(cè)量系統(tǒng)(gas chromatographic-electroantennographic detection, GC-EAD)測(cè)定草地螟雄蛾觸角對(duì)雌蛾性腺粗提液及人工標(biāo)準(zhǔn)化合物十四酸乙酯的電生理反應(yīng)。GC型號(hào)為6890 (美國(guó)安捷倫科技有限公司)，色譜柱為HP5-MS(30!1^0.2511111^0.25 4111，美國(guó)安捷倫科技有限公司)。氣相色譜程序設(shè)置同以上化學(xué)分析過(guò)程。雄蛾觸角被剪下并切除末端，用導(dǎo)電膠粘至兩個(gè)電極(PRG-2探針，荷蘭Syntech公司)。雌蛾粗提液、濃度為50ng/μ L的十四酸乙酯進(jìn)樣量均為2 μ L。吹向觸角的氣流速度為250mL/min，調(diào)節(jié)刺激時(shí)間為0.2S。觸角電位儀(EAG)由荷蘭公司的智能化數(shù)據(jù)獲取控制器IDAC-4、刺激氣流控制器(CS-55)、微動(dòng)操作儀(MN-151)及Syntech EAG軟件處理系統(tǒng)四部分組成，跗節(jié)上感受器的電位反應(yīng)經(jīng)放大后在計(jì)算機(jī)上顯示。雌蛾粗提液和十四酸乙酯的GC-EAD試驗(yàn)分別測(cè)試6個(gè)來(lái)自不同雄蛾的觸角樣品。性誘劑候選組分的電生理活性測(cè)定(GC-EAD)結(jié)果:草地螟雄蛾觸角對(duì)人工合成的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品十四酸乙酸有顯著可重復(fù)的電位反應(yīng)峰(圖4)，說(shuō)明該化合物與天然存在于雌蛾性腺攝取液中的化合物具有同樣的電生理活性，能夠激發(fā)雄蛾的電生理反應(yīng)。五、室內(nèi)行為活性測(cè)定人工合成的性引誘劑十四酸乙酯的行為測(cè)定裝置為自制的雙向選擇盒裝系統(tǒng)(圖1)，該系統(tǒng)由三個(gè)透明的食品塑料盒組成(盒頂部:16.5Xllcm,盒底部:14.5X9cm,盒高:
5.5cm)，盒內(nèi)壁用解剖針劃 出一些痕跡便于草地螟蛾在盒內(nèi)攀爬。釋放盒的兩端及備選盒的一側(cè)各打一直徑約4cm圓孔，釋放盒底部朝上置于中間、備選盒頂部朝上置于兩側(cè)，使圓孔兩兩相接緊湊形成一個(gè)封閉的系統(tǒng)。加入十四酸乙酯的誘芯(50ng/y LXlOyL)與空白誘芯分別放入左右兩側(cè)備選盒中，氣味物質(zhì)在這一封閉系統(tǒng)中擴(kuò)散時(shí)形成濃度梯度；草地螟雄蛾被引入中間的釋放盒內(nèi)，可自由選擇進(jìn)入左右兩個(gè)方向的備選盒。每次試驗(yàn)之前以無(wú)水乙醇(95%)擦拭塑料盒內(nèi)壁并自然風(fēng)干，被測(cè)雄蛾共40頭，均只使用I次。數(shù)據(jù)分析:雙向選擇試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)(ch1-square goodness-of-fittest)對(duì)試驗(yàn)觀測(cè)值與預(yù)期值之間的差異性進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。草地螟雄蛾對(duì)十四酸乙酯的趨向行為測(cè)定結(jié)果:草地螟雄蛾對(duì)十四酸乙酯的室內(nèi)雙向選擇試驗(yàn)結(jié)果顯示，雄蛾對(duì)十四酸乙酯表現(xiàn)出明顯的選擇偏好性(圖5)，選擇處理盒(即含性誘劑十四酸乙酯的備選盒)的雄蛾多于選擇空白對(duì)照盒的雄蛾，差異達(dá)到顯著水平(卡方檢驗(yàn)，p=0.012)。說(shuō)明十四酸乙酯對(duì)雄蛾具有顯著的吸引作用。六、野外生測(cè)野外生測(cè)地點(diǎn)設(shè)在河北省康保縣北關(guān)村的一片朽1條(Caragana intermedia)地塊(約300mX800m)。2011年6月與2012年6月各進(jìn)行一次野外誘引，2011年使用誘捕器為深綠色船形(25cm LX 15cm BXlOcm H)，2012年為白色三角形誘捕器(21cm LX 14cmBX 12cm.H)，均購(gòu)自北京中捷四方生物科技有限公司。分別設(shè)處理組和對(duì)照組，每組6個(gè)誘捕器。處理組誘捕器內(nèi)置性誘劑誘芯(劑量為50ng/ μ LX 20 μ L)，對(duì)照組誘芯僅有20 μ L 二氯甲烷。誘捕器懸掛于檸條的枝條上，距地面高度為50cm左右，組間距離10m，組內(nèi)距離5m，各處理和對(duì)照隨機(jī)分布其中。誘捕器放置時(shí)間為傍晚7時(shí)左右，次日早晨6點(diǎn)左右收集，統(tǒng)計(jì)誘引草地螟雄蛾的數(shù)量。數(shù)據(jù)分析:野外生測(cè)處理組與對(duì)照組誘蛾數(shù)量的差異比較采用單因素方差分析(one-way AN0VA)。所有數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。野外生測(cè)結(jié)果:2011年6月的野外誘引單個(gè)誘捕器最多誘到雄蛾17頭(另有雌蛾I頭)，其余均僅誘到雄蛾(圖6)，2012年 6月的野外誘引單個(gè)誘捕器最多誘到雄蛾15頭，均未誘到雌蛾；兩次誘弓I處理組與對(duì)照組之間差異均達(dá)到顯著(圖7 )。以上研究結(jié)果證實(shí),十四酸乙酯(Ethyl myristate)為我國(guó)草地螟雌蛾釋放的性引誘劑，雌蛾羽化后第3日(即3日齡)暗期便可進(jìn)入求偶(Calling)狀態(tài)，性腺?gòu)母共磕┒松斐?，釋放性信息素，吸弓I雄蛾前來(lái)交配。19世紀(jì)70年代加拿大學(xué)者的Struble和Lilly鑒定草地螟雌蛾釋放的性信息素為Ell-14:Ac，并在田間試驗(yàn)了其他的一些增效成分，但效果不穩(wěn)定。我國(guó)草地螟研究者采用Ell-14:Ac及可能的增效成分進(jìn)行野外誘引，其效果不佳，即使在草地螟蛾密度高達(dá)百步驚蛾量500-1500頭的田間仍然無(wú)法誘到雄蛾，這說(shuō)明Ell-14:Ac并不是我國(guó)草地螟雌蛾性信息素的主要成分。我們?cè)谥袊?guó)草地螟雌蛾的性腺提取液里面分離出的主要化合物中，包括多種烯、醇、酸和酯，但未發(fā)現(xiàn)Ell-14:Ac，因此，Ell-14:Ac可能不是發(fā)生在我國(guó)北方的草地螟雌蛾性腺的主要釋放物質(zhì)。
權(quán)利要求
1.十四酸乙酯在作為引誘草地螟(Loxostegesticticalis)的性引誘劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述草地螟(Loxostegesticticalis)為雄性草地螟。
3.—種引誘草地螟(Loxostege sticticalis)的性引誘劑,其活性成分為十四酸乙酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引誘草地螟(Loxostegesticticalis)的性引誘劑,其特征在于:所述草地螟(Loxostege sticticalis)為雄性草地螟。
5.十四酸乙酯在防 治草地螟(Loxostegesticticalis)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了十四酸乙酯在作為引誘雄性草地螟的性引誘劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種引誘草地螟(Loxostege sticticalis)的性引誘劑，其活性成分為十四酸乙酯。結(jié)合使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)、氣相色譜-觸角電位測(cè)量系統(tǒng)(GC-EAD)以及系列行為試驗(yàn)，對(duì)我國(guó)草地螟種群的性信息素進(jìn)行化學(xué)鑒定，并對(duì)雄蛾進(jìn)行野外誘引試驗(yàn)。研究結(jié)果證實(shí)，十四酸乙酯(Ethyl myristate)為草地螟雌蛾釋放的性引誘劑，雌蛾羽化后第3日暗期便可進(jìn)入求偶(Calling)狀態(tài)，性腺?gòu)母共磕┒松斐觯尫判孕畔⑺?，吸引雄蛾前?lái)交配。該研究成果將為應(yīng)用性信息素對(duì)我國(guó)草地螟進(jìn)行蟲(chóng)情監(jiān)測(cè)和防控提供理論依據(jù)，以期有效防止草地螟對(duì)北方農(nóng)牧業(yè)造成災(zāi)害。
文檔編號(hào)A01P19/00GK103109809SQ201310057649
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月25日
發(fā)明者肖永紅, 羅禮智 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所