Wrky轉(zhuǎn)錄因子多肽基因應(yīng)用的載體和方法
【專利摘要】本發(fā)明揭示了分離的多聚核苷酸和多肽，用于提高植物耐旱性的重組DNA載體，含有這些重組DNA載體的植物或種子，以及利用這些重組DNA載體的方法。重組DNA載體含有植物中有功能的啟動子和與之連接的多聚核苷酸，其中，所述的多聚核苷酸編碼轉(zhuǎn)錄因子WRKY多肽。
【專利說明】WRKY轉(zhuǎn)錄因子多肽基因應(yīng)用的載體和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物育種和遺傳學(xué)，特別是，涉及用于提高植物耐旱性能的重組DNA載體。
_2] 發(fā)明背景
[0003]非生物脅迫是世界范圍內(nèi)引起作物減產(chǎn)的主要原因，每年會造成主要作物減產(chǎn)50% 以上(Boyer, J.S.(1982) Science218:443-448 ；Bray,E.A.等(2000) In Biochemistryand Molecular Biology of Plants, edited by Buchannan, B.B.等，Amer.Soc.PlantBiol.，pp.1158-1249)。干旱是所有非生物脅迫中影響作物產(chǎn)量最主要的因素，在植物生長發(fā)育階段，干 旱會激活植物各種不同生理和發(fā)育變化。近年來，盡管對非生物脅迫響應(yīng)的分子機制和植物耐旱性的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行了廣泛的研究(Valliyodan, B.和Nguyen,H.T.(2006)Curr.0pin.Plant Biol.9:189-195 ；ffang, ff.等(2003)Planta218:1-14 ;Vinocur, B.和 Altman, A.(2005) Curr.0pin.Biotechnol.16: 123-132 ；Chaves, Μ.M.和Oliveira, Μ.M.(2004) J.Exp.Bot.55:2365-2384 ；Shinozaki, K.等(2003) Curr.0pin.Plant Biol.6:410-417 ;Yamaguchi_Shinozaki, K.和 Shinozaki, K.(2005) Trends PlantSc1.10:88-94),但是植物如何感受、傳導(dǎo)干旱脅迫信號和其耐旱性的生物化學(xué)和分子機制仍然是生物學(xué)研究中面臨的一個主要挑戰(zhàn)。
[0004]早期非生物脅迫響應(yīng)分子方面的研究主要借助差異和/或加減法分析(Bray，E.A.(1993)PIantPhysio1.103: 1035-1040 ；Shinozaki, K.和 Yamaguch1-Shinozaki,K.(1997)PlantPhysiol.115:327-334 ；Zhu, J.-K.等(1997) Crit.Rev.Plant Sc1.16:253-277 ；Thomashow, M.F.(1999)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mo 1.Biol.50:571-599);和其它的方法，如分離候選基因，分析脅迫條件下該基因的表達或活性產(chǎn)物，或進行特定脅迫條件下功能互補分析(Xiong, L.和Zhu, J.-K.(2001)PhysiologiaPlantaruml 12:152-166)。另外，用于鑒定和分離調(diào)控基因突變體的正向和反向遺傳學(xué)研究為脅迫條件下基因表達的變化提供了證據(jù)(Xiong，L.和Zhu，J.-K.(2001)PhysiologiaPlantaruml12: 152-166)。
[0005]激活標簽可以用于鑒定影響植物性狀的基因，這一方法已經(jīng)用于模式植物擬南芥的研究中(Weigel, D.等(2000)PlantPhysiol.122:1003-1013)。轉(zhuǎn)錄增強子序列的插入主要激活和/或提高鄰近內(nèi)源基因的表達，因此該方法可以用于分離具有重要農(nóng)藝性狀表型的基因，包括提高非生物脅迫如耐旱性的基因。
[0006]WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中發(fā)現(xiàn)的N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它能夠與(T) (T)TGAC(C/T)序列(W-box)發(fā)生特異性作用，調(diào)節(jié)啟動子中含w-box元件的調(diào)芐基因和/或功能基因的表達，從而參與植物的各種防衛(wèi)反應(yīng)，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。作為WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子66 (0sWRKY66)也含有保守的WRKYGQR氨基酸序列。
[0007]發(fā)明概沭
[0008]本發(fā)明包括以下具體實施例:[0009]1.分離的多聚核苷酸包括(a)編碼一個多肽的核酸序列，其中，該多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列一致性至少為90% ； (b)序列表中SEQ ID NO:3所示的序列;(c)序列表中SEQ ID NO:4所示的序列；(d)與核酸序列(a)、(b)或(c)的全長核苷酸一致性大于等于85%的核酸序列；(e)上述核酸序列(a)、(b)、(C)或(d)的全長互補核酸序列，其中全長互補序列與核酸序列含有相同的核苷酸數(shù)目，并100%的互補；多肽包括序列表中的SEQ ID NO:5的氨基酸序列，核酸序列包括序列表中的SEQ ID NO:3和4的核苷酸序列。
[0010]2.重組DNA載體包括實例I中分離的多聚核苷酸，其與至少一個可操作的調(diào)控序列連接。
[0011]3.基因組中含有與至少一個調(diào)控元件連接的多聚核苷酸構(gòu)建的重組DNA載體的植物，其中，所述多聚核苷酸編碼WRKY66轉(zhuǎn)錄因子(WRKY66)多肽，通過本發(fā)明中所述的GAP參數(shù)測定，可知上述WRKY66多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5的氨基酸序列的一致性至少為85% ;所述植物與對照植物相比具有較高的耐旱性。
[0012]4.基因組中整合有與至少一個調(diào)控元件連接的多聚核苷酸構(gòu)建的重組DNA載體的植物，其中，所述多聚核苷酸編碼一個多肽，通過本發(fā)明中所述的GAP參數(shù)測定，可知其氨基酸序列與序列表中SEQ IDNO:5的氨基酸序列的一致性至少為85%;與對照植物相比，所述植物顯示至少一個農(nóng)藝性狀的變化；可選的，在水分限制條件下，與對照植物相比，所述植物顯示所述至少一個農(nóng)藝性狀的變化；所述農(nóng)藝性狀可以是籽粒產(chǎn)量或者生物量；所述的變化可以是增加。
[0013]5.上述實例3和4中所述的植物，可以是水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜猜、棉花、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
[0014]6.上述實例3、4或5的植物種子，所述植物種子的基因組中整合有與至少一個調(diào)控元件連接的多聚核苷酸構(gòu)建的重組DNA載體，其中，所述的多聚核苷酸編碼一個多肽，其氨基酸序列與序列表SEQ ID NO:5的氨基酸序列的一致性至少為85%;所述種子長出的植物與對照植物相比，具有較高的耐旱性，或至少一個農(nóng)藝性狀的變化，或兩者；所述至少一個農(nóng)藝性狀可以是籽粒產(chǎn)量、生物量或其組合；所述的變化可以是增加。
[0015]7.提高植物耐旱性的方法包括(a)使用與至少一個調(diào)控序列連接的多聚核苷酸構(gòu)建的重組DNA載體轉(zhuǎn)化植物再生細胞，其中，所述多聚核苷酸編碼一個多肽，其氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5氨基酸序列的一致性至少為85% ； (b)由步驟(a)的植物再生細胞再生基因組中含有構(gòu)建的重組DNA載體的轉(zhuǎn)基因植物；(c)獲得由步驟(b)獲得的再生植物的子代植物，其中，所述子代植物的基因組中含有構(gòu)建的重組DNA載體，且與野生型植物相比，所述子代植物具有較高的耐旱性。
[0016]8.提高植物耐旱性的方法還包括(a)將實例3、4或5的植物與另一植物雜交，生產(chǎn)子代種子；(b)收獲并種植子代種子，生產(chǎn)下一個子代的植物；(c)將子代植物與該另一植物雜交，獲得至少一個回交的子代種子；可選的，(d)多次重復(fù)步驟(b)和(C)，獲得比該另一植物具有較高耐旱性的植物。
[0017] 9.評價植物耐旱性的方法包括(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中，轉(zhuǎn)基因植物的基因組中整合有與至少一個調(diào)控元件連接的多聚核苷酸構(gòu)建的重組DNA載體，所述多聚核苷酸編碼一個多肽，其氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5的氨基酸序列的一致性至少為85% ;(b)獲得轉(zhuǎn)基因植株的子代植物，其中，子代植物的基因組中含有構(gòu)建的重組DNA載體；(c)與對照植物相比，評價子代植物的耐旱性。
[0018]10.確定植物中至少一個農(nóng)藝性狀變化的方法:(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其基因組中含有與至少一個調(diào)控元件連接的多聚核苷酸構(gòu)建的重組DNA載體，其中，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5的氨基酸序列的一致性至少為85%; (b)獲得轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中，子代植物基因組中含有構(gòu)建的重組DNA載體:(c)與對照植物對比，確定子代植物是否具有所述的至少一個農(nóng)藝性狀的變化；可選的，步驟(c)包括在水分限制條件下確定轉(zhuǎn)基因植物是否具有至少一個農(nóng)藝性狀的變化；所述的至少一個農(nóng)藝性狀可以是籽粒產(chǎn)量、生物量或者其組合；所述的變化可以是增加。
[0019]11.上述7-11所述的任一方法，其中，植物可以是水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜猜、棉花、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
[0020]12.含有能夠增強內(nèi)源多聚核苷酸表達的重組轉(zhuǎn)錄激活子元件的水稻植株，其中，多聚核苷酸編碼的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5的氨基酸序列一致性為90%。
[0021]13.提高田間種植水稻耐旱性的方法包括(a)在水稻中表達編碼水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子的重組核酸；(b)在作物的生長季節(jié)，田間種植水稻，且水稻置于干旱條件下；和(C)提高水稻的耐旱性。
[0022]14.提高田間種植水稻的產(chǎn)量的方法包括(a)在水稻中表達編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子的重組核酸；(b)在作物生長季節(jié)，田間種植水稻，且水稻植株遭受干旱脅迫；和(C)提高水稻的籽粒產(chǎn)量。
[0023]15.鑒定增加0sWR KY66多肽表達或活性的0sWRKY66等位基因的方法包括(a)進行T-DNA插入水稻突變體庫的篩選；(b)鑒定一個或多個突變體，其顯示增強的0sWRKY66多肽或者其同族體的表達或者活性；和(c)從突變體中鑒定0sWRKY66等位基因或者其同族體。
[0024]16.篩選0sWRKY66等位基因的方法包括(a)使用0sWRKY66的寡核苷酸引物序列測定從一個或者多個突變體中分離的一個或多個基因組DNA片段序列；(b)分析0sWRKY66基因的調(diào)控區(qū)或者編碼區(qū)DNA序列的不同；和(c)確定0sWRKY66等位基因與植物耐旱性或桿粒廣量提聞的關(guān)系。
[0025]17.基因組中含有提高0sWRKY66多肽表達的重組載體的水稻，其中，多肽序列包括序列表中SEQ ID NO:5的序列。
[0026]在其他具體實施例中，本發(fā)明主要揭示了與至少一個調(diào)控序列連接的本發(fā)明中分離的多聚核苷酸構(gòu)建的重組DNA載體，和含有該重組DNA載體的細胞、植物或種子；所述細胞可以是酵母、昆蟲或植物細胞等真核細胞，也可以是細菌細胞等原核細胞。
[0027]附圖和序列表的簡要i兌明
[0028]下面的詳細說明、附圖和序列表有助于全面了解本發(fā)明。
[0029]圖1.轉(zhuǎn)基因水稻葉片中0sWRKY66基因表達水平的real-time PCR分析。因未檢測到0sWRKY66基因在對照水稻(DP0005)中表達，故設(shè)DP0010.13水稻葉片中0sWRKY66基因表達水平為1.00，其他轉(zhuǎn)基因事件中的0sWRKY66基因表達水平如圖數(shù)字所示。
[0030]圖2.海南省干旱試驗期間實驗地中水稻不同發(fā)育期的土壤含水量。
[0031]圖3.過表達水稻0sWRKY66基因提高了擬南芥(AtDPOO 10_6、AtDPOOlO-1O和DP0010-13)的耐旱性。A.擬南芥中OsWRKY66基因的半定量PCR分析；B.復(fù)水第三天時擬南芥的存活率；C.復(fù)水第三天時擬南芥的生長狀況。WT代表野生型Columbia，VC代表DP0009轉(zhuǎn)化株。
[0032]表1.序列表中核苷酸序列和氨基酸序列編號
[0033]表2.AHO1460水稻株系在溫室條件下的耐旱性能分析
[0034]表3.TO代CaMV35S Pro:0sffRKY66水稻株系在溫室條件下的耐旱性能分析
[0035]表4.T2代CaMV35S Pro:0sffRKY66水稻株系在溫室條件下的耐旱性能分析
[0036]表5.T2代CaMV35S Pro:0sffRKY66水稻株系在田間干旱脅迫后籽粒產(chǎn)量分析
[0037]表1.序列表中核苷酸序列和氨基酸序列編號
[0038]
【權(quán)利要求】
1.分離的多聚核苷酸包括(a)序列表中SEQID NO:3所示的序列，(b)序列表中SEQID NO:4所示的序列，(c)編碼如序列表中SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列多肽的核酸序列，(d)與核酸序列(a)、(b)或(C)的核苷酸序列一致性大于或等于85%的核酸序列，(e)編碼與序列表中SEQ ID NO:5氨基酸序列一致性至少為85%多肽的核酸序列，(f)上述核酸序列(a)、(b)、(C)、(d)或(e)全長互補的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，所述多肽的氨基酸序列包括序列表中SEQID NO:50
3.根據(jù)權(quán)利要求1,所述核苷酸序列包括序列表中SEQID NO:3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1,所述核苷酸序列包括序列表中SEQID NO:4。
5.權(quán)利要求1中分離的核酸序列和至少一個調(diào)控序列構(gòu)建的重組DNA載體。
6.含有重組DNA載體的植物或種子，其中，重組DNA載體包括權(quán)利要求1的多聚核苷酸，和與之相連的調(diào)控序列。
7.基因組中含有重組DNA載體的植物，其中，重組DNA載體包括至少一個調(diào)控元件，和與之相連的多聚核苷酸；根據(jù)GAP比對方法，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的一致性至少為85% ;與對照植物相比，所述植物顯示增強的耐旱性。
8.基因組中含有重組DNA載體的植物，其中，重組DNA載體包括至少一個調(diào)控元件，和與之相連的多聚核苷酸；根據(jù)GAP比對方法，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5所示 氨基酸序列的一致性至少為90% ;與對照植物相比，所述植物顯示增加的籽粒產(chǎn)量、生物量或兩者。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8，與所述對照植物相比，在水分限制條件下，所述植物顯示所述增加的籽粒產(chǎn)量、生物量或兩者。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8，所述植物選自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、大麥、粟、甘蔗和柳枝稷。
11.權(quán)利要求7或8植物收獲的種子，其中，所述種子的基因組中含有重組DNA載體，重組DNA載體包括至少一個調(diào)控元件，和與之相連多聚核苷酸；根據(jù)GAP比對方法，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的一致性至少為90% ;與對照植物相比，由所述種子長出的植物顯示至少一個增加的性狀，如耐旱性、籽粒產(chǎn)量和生物量。
12.提高植物耐旱性的方法，其包括(a)將重組DNA載體轉(zhuǎn)入植物再生細胞，其中，重組DNA載體包括至少一個調(diào)控元件，和與之相連的多聚核苷酸，根據(jù)GAP比對方法，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的一致性至少為90%;(b)由步驟(a)的植物再生細胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物的基因組中含有重組DNA載體；(c)獲得步驟(b)轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物的基因組中含有重組DNA載體，與對照植物相比，所述子代植物顯示增強的耐旱性。
13.改善植物耐旱性的方法，其包括(I)將權(quán)利要求7或8任意植物與另一個植物進行雜交，產(chǎn)生的子代種子；(b)收獲和種植子代種子以獲得至少一個子代植株；(c)將子代植物與另一個植物品種雜交，產(chǎn)生至少一個回交子代種子；可選的，(d)多次重復(fù)步驟(b)和(C)，產(chǎn)生比所選植物品種具有更高耐旱性植物。
14.評價植物耐旱性的方法，其包括(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中，轉(zhuǎn)基因植物的基因組中含有重組DNA載體，所述的重組DNA載體包括至少一個調(diào)控元件，和與之相連的多聚核苷酸，根據(jù)GAP比對方法，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID N0:5所示氨基酸序列的一致性至少為90% ；(b)獲得轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中，子代植物的基因組中含有重組DNA載體；(c)以不含有所述重組DNA載體的植物為對照，評價子代植物的耐旱性。
15.確定植物籽粒產(chǎn)量、生物量或兩者變化的方法，其包括(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中，轉(zhuǎn)基因植物的基因組中含有重組DNA載體，所述重組DNA載體包括至少一個調(diào)控元件，和與之相連的多聚核苷酸，根據(jù)GAP比對方法，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的一致性至少為90% ； (b)獲得轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中，所述子代植物的基因組中含有重組DNA載體；(c)測定子代植物的籽粒產(chǎn)量和/或生物量，并將所述測定與對照植物的籽粒產(chǎn)量和/或生物量進行比較。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，轉(zhuǎn)基因子代植物和對照植物的籽粒產(chǎn)量和/或生物量是在水分限制條件下測定的。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的方法，與對照植物相比，轉(zhuǎn)基因子代植物的所述籽粒產(chǎn)量和/或生物量增加了。
18.根據(jù)權(quán)利要求12-16的任一方法，所述植物選自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜猜、棉花、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
19.含有能夠增強內(nèi)源多聚核苷酸表達的重組轉(zhuǎn)錄增強子的水稻，其中，多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5的氨基酸序列的一致性為90%。
20.提高田間種植水稻耐旱性的方法，其包括(a)在水稻中表達編碼水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子的重組核酸；(b)在作物的生長季節(jié)，田間種植水稻，其中，并使水稻置于干旱條件下；和(C)提高水稻的耐旱性。
21.提高田間種植水稻的產(chǎn)量的方法，其包括(a)在水稻中表達編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子的重組核酸；(b)在作物生長季節(jié)，田間種植水稻，其中水稻植株遭受干旱脅迫；和(C)提高水稻的籽粒產(chǎn)量。
22.鑒定提高OsWRKY66多肽表達或活性的OsWRKY66等位基因的方法，其包括(a)進行T-DNA插入水稻突變體庫的篩選；(b)鑒定一個或多個突變體，其顯示增強的OsWRKY66多肽或者其同族體的表達或者活性；和(c)從突變體中鑒定OsWRKY66等位基因或者其同族體。
23.篩選OsWRKY66等位基因的方法，包括(a)使用OsWRKY66的寡核苷酸引物序列測定從一個或者多個突變體中分離的一個或多個基因組DNA片段序列；(b)分析OsWRKY66基因的調(diào)控區(qū)或者編碼區(qū)DNA序列的不同；和(c)確定OsWRKY66等位基因與植物耐旱性或籽粒廣量提聞的關(guān)系。
24.基因組中含有提高OsWRKY66多肽表達的重組載體的水稻，其中，多肽序列包括序列表中SEQ ID NO:5的序列。
25.獲得耐旱性提高的水稻植株的方法，包括獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株，其與對照水稻相t匕，具有增加的OsWRKY66基因表達水平；并使轉(zhuǎn)基因水稻植株在干旱條件下生長。
【文檔編號】A01H5/00GK104004767SQ201310058304
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月25日
【發(fā)明者】高陽, 劉軍華, 呂貴華, 毛冠凡, 王昌貴, 王喜萍, 夏勉, 于昆 申請人:先鋒海外公司, 北京凱拓迪恩生物技術(shù)研發(fā)中心有限責(zé)任公司