一種延胡索的組織培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種延胡索的組織培養(yǎng)方法，其特征在于：包括下列步驟：1)對當(dāng)年生地下經(jīng)上的幼芽進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)、生根培養(yǎng)、煉苗后進(jìn)行移栽；2)對當(dāng)年生帶有芽點的塊莖部分進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗后進(jìn)行移栽，通過該方法可以對延胡索進(jìn)行快速增值，并實現(xiàn)大面積工業(yè)化種植，以解決野生延胡索產(chǎn)量低的短缺，以及供應(yīng)少和自然栽培周期長的問題。
【專利說明】一種延胡索的組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)方法，具體地說是延胡索的組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]延胡索:別名:延胡、玄胡索、元胡索、元胡，罌粟科紫堇屬多年生草本，中國傳統(tǒng)藥材。主要產(chǎn)于浙江和江蘇。其塊莖含紫堇堿、原阿片堿等多種生物堿，經(jīng)制成粉劑或醋制流浸膏等，主治心腹腰膝諸痛；月經(jīng)不調(diào)；癥瘕；崩中；產(chǎn)后血暈；惡露不盡；跌打損傷。有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠作用。高9~20厘米。塊莖球形。花瓣紫紅色；蒴果圓柱形，兩端漸狹。夏季開花。
[0003]植物的離體快速繁殖，是目前植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣泛、最有效的技術(shù)，尤其對于新引進(jìn)品種、脫毒苗、優(yōu)良單株、瀕危植物和基因工程植株等可實現(xiàn)離體快速增殖，且不受地區(qū)、氣候影響，繁殖速度比常規(guī)生產(chǎn)快數(shù)百萬倍，能迅速提供大量優(yōu)質(zhì)種苗。目前，人們對延胡索的研究主要集中在其成分測定、藥理作用以及人工栽培等方面，而關(guān)于組織培養(yǎng)方面的研究內(nèi)容較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種延胡索的組織培養(yǎng)方法，通過該方法可以對延胡索進(jìn)行快速繁殖，并實現(xiàn)大面積工業(yè)化種植，以解決野生延胡索產(chǎn)量低、供應(yīng)少和自然栽培周期長的問題。 [0005]本發(fā)明解決技術(shù)問題采用如下方案:
[0006](I)外植體的選擇與滅菌
[0007]選擇當(dāng)年生帶有芽點的塊莖部分，所述塊莖將其切成小塊，且每塊都帶有至少一個芽點；
[0008]將所述幼芽或塊莖用自來水快速沖去泥沙，并用洗滌劑液浸泡30min以除去表面污垢，然后自來水沖洗3h，再置于超凈工作臺用體積濃度75%酒精滅菌15s，無菌水沖洗3遍，再將其放入體積濃度0.2% HgCL2溶液中浸泡12-14min，所述HgCL2溶液中包含有體積濃度0.15%-0.2%的吐溫20，之后無菌水沖洗5遍，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中吸干水分，等待接入培養(yǎng)基;
[0009](2)幼芽叢生芽的誘導(dǎo)、塊莖叢生芽愈傷組織培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)
[0010]A、將經(jīng)過步驟(1)處理的幼芽轉(zhuǎn)入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為:MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L，pH = 5.8 ;培養(yǎng)條件為溫度:23±1°C、光照1500-2000LX ;光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)時間為20-30天；然后直接轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)；
[0011]B、①將經(jīng)過步驟(1)處理的帶有芽點的塊莖接種MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH = 5.8培養(yǎng)基上，23±1°〇、光照1500_2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)時間為20-30天；中間剔除污染的塊莖外植體；②在塊莖組織分化形成愈傷組織后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基為:MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH5.8 ;培養(yǎng)條件為溫度23土1°C、光照1500-2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)時間為10-20天；愈傷組織進(jìn)行增殖，將增殖后的愈傷組織切成1.0cm*1.0cm*1.0cm大小然后轉(zhuǎn)入原先的誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L，pH = 5.8 培養(yǎng)基上，23土 1°C、光照1500-2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)時間為15-25天;
[0012](3)生根的培養(yǎng)
[0013]將經(jīng)過步驟(2)處理的外植體轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基的配方為:1/2MS、ΝΑΑ0.2-0.5mg/L、瓊脂 6_8g/L、蔗糖 20_30g/L ;培養(yǎng)條件為溫度 23土 1°C、光照1500-2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)時間為35-50天；
[0014](4)煉苗和移栽
[0015]將經(jīng)過煉苗的延胡索根莖從接種瓶中取出，用清水洗掉培養(yǎng)基，在質(zhì)量濃度0.1 %高錳酸鉀溶液中消毒lmin，用清水沖洗干凈后，假植在腐殖質(zhì)土:沙子=I: 1(V: V)的基質(zhì)上，保持空氣濕度95%以上，用遮陽網(wǎng)遮蔭；根據(jù)成苗的時間安排栽植，在春季以后成苗則選擇秋栽即9-10月下旬，在春季之前成苗則選擇春栽即3月下旬，將假植的延胡索根莖栽種到整好的露地畦內(nèi)，將根莖段芽眼向上，每隔10-15cm平放I個根莖，行距20-25cm，覆土 4-6cm，澆足水；在土壤封凍前，畦面上蓋一層有機(jī)肥或薄膜，以利保暖越冬。
[0016]本發(fā)明方法中，采用不同營養(yǎng)體作為材料，既保證了遺傳的穩(wěn)定性，又增加了原材料利用的可能性。利用芽直接分化成葉片，然后進(jìn)行成苗階段，縮短了原先用芽經(jīng)過誘導(dǎo)愈傷組織再分化成苗階段的 時間，同時利用塊莖分化并增殖，大大提高繁殖的效率和數(shù)量，而對于不同部位消毒方法的不同，不僅降低了污染率也保證了較高的成活率，從而滿足大規(guī)模推廣和工廠化生產(chǎn)的要求。
【具體實施方式】
[0017]以下通過具體實施例對本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步說明。
[0018]以下實施例MS培養(yǎng)基配方:每升培養(yǎng)基中含KN03(1900mg/L)，NH4NO3(1650mg/L)，MgSO4.7H20 (370mg/L)，KH2PO4 (170mg/L)，CaCL2 (330mg/L)，KI (0.83mg/L)，H3BO3 (6.2mg/L)，Mn2SO4.H2O (16.9mg/L)，ZnSO4.4H20(8.6mg/L)，CuSO4、.5H20(0.025mg/L)，CoCL2.6H20(0.025mg/L)，Na2MoO4.2H20(0.25mg/L)，F(xiàn)eSO4.7H20 (27.85mg/L)，Na2EDTA (37.25mg/L)，甘氨酸(2.0mg/L)，煙酸 B3 (0.5mg/L)，鹽酸硫胺素 BI (0.4mg/L)，鹽酸批口多醇 B6 (0.5mg/L),肌醇(100mg/L)。
[0019]實施例1
[0020](I)外植體的選擇與滅菌
[0021]選擇地藏延胡索的當(dāng)年生地下莖上的幼芽，將幼芽從土中挖出切取幼芽，自來水快速沖去泥沙，可用牙刷輔助沖洗，洗滌劑液(市售常規(guī)洗衣粉)浸泡30min并用軟刷輕輕刷去表面污垢，將外層苞片去除，留下最內(nèi)層乳白色幼芽，自來水沖洗3h，置于超凈工作臺上:體積濃度75%酒精溶液滅菌15s，之后無菌水沖洗3遍，體積濃度0.2% HgCL2,HgCL2溶液中包含有體積濃度0.15%的吐溫20，浸泡12min，無菌水沖洗5遍，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中吸干水分等待接入培養(yǎng)基；混合了吐溫20后的HgCL2溶液消毒效果比原先沒有混合的溶液無菌率提高了 10倍。[0022](2)莖段芽的誘導(dǎo)分化
[0023]將莖上幼芽接種MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L，pH = 5.8培養(yǎng)基上，23± I°C、光照1500-2000LX ;光照時間為10-12小時/天，5周后直接分化形成葉片。
[0024](3)生根的培養(yǎng)
[0025]從中選取生長健壯，葉片展開，長度適中的誘導(dǎo)分化幼芽，轉(zhuǎn)入以1/2MS+NAA0.6mg/L+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L，pH5.8 ;培養(yǎng)條件為溫度 23± I °C、光照1500-2000LX ;光照時間為10-12小 時/天，培養(yǎng)時間為7-10天；在3次重復(fù)處理，每次處理3組，每組9株的實驗中，平均每個外植體生根7.9條。
[0026](4)煉苗與移栽
[0027]將生根后的成苗每隔25-30天重新轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，如此反復(fù)2-3次，這樣的成苗質(zhì)量優(yōu)良，能經(jīng)受外界環(huán)境帶來的影響。將壯苗后的成苗瓶口打開，在培養(yǎng)室半遮光放置2-3日，期間適時補(bǔ)充水分，使組培苗逐步適應(yīng)外界環(huán)境，達(dá)到煉苗的目的。
[0028]將經(jīng)過煉苗的延胡索從接種瓶中取出，用清水洗掉培養(yǎng)基，在質(zhì)量濃度0.1 %高錳酸鉀溶液中消毒lmin，用清水沖洗干凈后，假植在基質(zhì){V(腐殖質(zhì)土): V(沙子)=I: 1}上，保持空氣濕度95%以上，用遮光率75%遮陽網(wǎng)遮蔭。30d后假植成活率達(dá)90%以上。以后每隔7d噴施I次MS營養(yǎng)液。為了縮短培育時間,根據(jù)成苗的時間安排栽植,在春季以后成苗則選擇秋季即9-10月下旬，在春季之前成苗則選擇春栽即3月下旬，將假植的延胡索根莖栽種到整好的露地畦內(nèi)，將根莖段芽眼向上，每隔10-15cm平放I個根莖，行距20-25cm，覆土 4-6cm，澆足水；在土壤封凍前，畦面上蓋一層有機(jī)肥或薄膜，以利保暖越冬；成活率達(dá)80%。
[0029]綜合以上各實驗步驟，本發(fā)明的方法，在現(xiàn)有延胡索、地藏延胡索組織培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上添加了莖段芽直接誘導(dǎo)分化和塊莖組織培養(yǎng)過程。在增加的材料的利用率的同時對于不同的材料選擇不同的處理方法，能夠提高誘導(dǎo)率的同時增加增殖數(shù)量和質(zhì)量，從而適合大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)，解決原材料稀缺的問題，縮短的培育周期，使材料可以發(fā)揮更大的藥用和經(jīng)濟(jì)價值。
【權(quán)利要求】
1.一種延胡索的組織培養(yǎng)方法，其特征在于:包括下列步驟: (1)外植體的選擇與滅菌 選擇帶有地上莖的幼芽塊莖部分，將其切成小塊，且每塊都帶有至少一個芽點； 將所述帶有芽點的塊莖用自來水洗凈，沖洗到表面沒有污垢，再置于超凈工作臺用體積濃度75%的酒精滅菌20s，然后用無菌水沖洗干凈，再將其放入到體積濃度為0.2%HgCL2浸泡15min，然后用無菌水沖洗干凈，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中吸干水分，等待接入培養(yǎng)基； (2)幼芽叢生芽的誘導(dǎo)、塊莖叢生芽愈傷組織培養(yǎng)和增殖培養(yǎng) A、將經(jīng)過步驟(1)處理的幼芽轉(zhuǎn)入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為:MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L，pH = 5.0 ~6.0 ;培養(yǎng)條件為溫度25~30°C、光照1500-2000LX ;光照時間為12~15小時/天，培養(yǎng)時間為20~30天；然后直接轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)； B、①將經(jīng)過步驟(1)處理的帶有芽點的的塊莖接種MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH = 5.0~6.0 ;培養(yǎng)條件為溫度25~30°C、光照1500-2000Lx ;光照時間為12~15小時/天，培養(yǎng)時間為20-30天；中間剔除污染的塊莖外植體；②在塊莖組織分化形成愈傷組織后，將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH = 5.0~6.0 ;培養(yǎng)條件為溫度25~30°C、光照1500_2000Lx ;光照時間為12~15小時/天，培養(yǎng)時間為10-20天；愈傷組織進(jìn)行增殖，然后將增殖后的愈傷組織切成1.0cm*1.0cm*1.0cm大小，再轉(zhuǎn)入原先的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L ，pH = 5.0~6.0培養(yǎng)條件為溫度25~30。。、光照1500_2000Lx ；光照時間為12~15小時/天，培養(yǎng)時間為20-30天； (3)生根的培養(yǎng) 將經(jīng)過步驟(2)處理的外植體轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基的配方為:1/2MS+NAA0.2-0.5mg/L+ 瓊脂 6_8g/L+ 蔗糖 20_30g/L ;培養(yǎng)條件為溫度 25 ~30°C、光照1500-2000LX ;光照時間為12~15小時/天，培養(yǎng)時間為30-40天； (4)煉苗和移栽 將經(jīng)過煉苗的延胡索根莖從接種瓶中取出，用清水洗掉培養(yǎng)基，在質(zhì)量濃度為0.1%高錳酸鉀溶液中消毒lmin，用清水沖洗干凈后，假植在腐殖質(zhì)土:沙子=I: l(v: V)的基質(zhì)上，保持空氣濕度95%以上，用遮陽網(wǎng)遮蔭；根據(jù)成苗的時間安排栽植，在春季以后成苗則選擇秋栽即9-10月下旬，在春季之前成苗則選擇春栽即3月下旬，將假植的延胡索根莖栽種到整好的露地畦內(nèi)，將根莖段芽眼向上，每隔10-15cm平放I個根莖，行距20-25cm，覆土 4-6cm，澆足水；在土壤封凍前，畦面上蓋一層有機(jī)肥或薄膜，以利保暖越冬。
【文檔編號】A01H4/00GK104012403SQ201310061779
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月28日
【發(fā)明者】毛健, 姬中偉, 張敏, 牟穰, 陽志銳, 郭燕飛, 黎衛(wèi), 馮東陽, 鞏丹, 劉蕓雅 申請人:江南大學(xué)