專(zhuān)利名稱(chēng)：一種白及多倍體植株的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種白及多倍體植株的培育方法。
背景技術(shù)：
白及為蘭科植物白及(Bletilla sfriata(Thunb.)Reiehb.f.)的干燥塊莖，具有收斂止血，消腫生肌等功效，用于治療咯血，吐血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂等癥。白及不僅藥用價(jià)值高，而且極具觀賞價(jià)值，是我國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)和化妝品工業(yè)的重要原材料。近年來(lái)，隨著我國(guó)中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，白及在臨床上的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，白及的用藥需求急劇增加。但白及種子非常細(xì)小且無(wú)胚乳，因此在自然條件下很難萌發(fā)和生長(zhǎng)，實(shí)生苗的栽培較為困難，僅靠分株繁殖，而白及分株繁殖周期長(zhǎng)，繁殖效率低，而且耗種量大，很難滿足大量栽培的需要。白及正面臨著資源難以滿足市場(chǎng)的嚴(yán)峻現(xiàn)實(shí)。白及種質(zhì)的好壞是影響白及產(chǎn)量重要的因素。因此，加強(qiáng)白及優(yōu)良品種的選育至關(guān)重要。多倍體植物在自然界中是普遍存在的，由于它們?cè)谏砩陷^普通植物有更強(qiáng)的適應(yīng)性和遺傳上有較大的可塑性，使得育種學(xué)家自20世紀(jì)30年代開(kāi)始就熱衷于多倍體誘導(dǎo)育種的研究。目前多倍體誘導(dǎo)育種工作在農(nóng)作物、果樹(shù)、蔬菜、花卉等領(lǐng)域廣泛開(kāi)展，取得了很好的成績(jī)，如目前多倍體馬鈴薯、西瓜等都已經(jīng)投入到生產(chǎn)應(yīng)用中，已經(jīng)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。藥用植物多倍體育種工作開(kāi)展得也比較早，自從1937年布萊克斯里用秋水仙素處理曼佗羅獲得多倍體，半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，育種學(xué)家對(duì)多種藥用植物進(jìn)行了多倍體育種的研究，培育了許多高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種，現(xiàn)今，已在卷葉貝母、青蒿、金銀花、羅勒、丹參、紫錐菊、黃芪等藥用植物上誘導(dǎo)成功。藥用植物多倍體具有以下的優(yōu)點(diǎn):1.生物廣量提聞藥用植物大多以收獲根、莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官為主，具有巨大性的特點(diǎn)，藥用植物可以利用其優(yōu)勢(shì)來(lái)提高藥材產(chǎn)量。川黃柏同源四倍體較原植物葉子寬大而厚實(shí)，莖桿粗壯；四倍體決明種子比二倍體決明種子增重70% ；S.Amiri等研就表明多倍體曼陀羅葉片寬大，植株干重、葉綠素含量較原植物聞。2.抗逆性提高多數(shù)的多倍體對(duì)外界環(huán)境條件具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，多倍體植株莖桿粗壯故能較好的抗倒伏有的還有抗旱、抗病、抗寒等特性。例如張笑藝對(duì)不同倍性的盾葉薯蕷進(jìn)行高溫抗性研究，測(cè)定葉片內(nèi)與高溫脅迫相關(guān)的各項(xiàng)生理指標(biāo)，表明四倍體盾葉薯蕷對(duì)高溫脅迫具有更好的耐受性。3.藥用活性成分含量高藥用植物的多倍體育種一方面要提高產(chǎn)量，另一方面應(yīng)使藥用植物內(nèi)的化學(xué)藥效成分含量明顯增加，并且可增添新的藥效成分。例如，有研究表現(xiàn)盾葉薯蕷的同源四倍體中有效成分薯蕷皂苷的含量比原植物高1.2倍左右；隨著生物技術(shù)的發(fā)展，藥用植物的多倍體育種工作也取得了較大的進(jìn)展，獲得了一些多倍體新品種，以其速 生、優(yōu)質(zhì)、高抗逆性等特性在生產(chǎn)上取得了較好效果。藥用植物多倍體育種拓寬了種質(zhì)資源，防止了由于長(zhǎng)期的栽培而導(dǎo)致的藥用植物品種退化?？梢灶A(yù)見(jiàn)，生物技術(shù)在中藥材品種改良方面具有很好的應(yīng)用前景，將隨著人類(lèi)對(duì)其應(yīng)用價(jià)值認(rèn)識(shí)的提高，以及有關(guān)新技術(shù)方法的應(yīng)用，從而帶動(dòng)未來(lái)藥用植物的可持續(xù)、高效發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的提供一種白及多倍體植株的制備方法，利用該方法可以獲得具有四倍體特征的白及植株，且操作簡(jiǎn)單，適合規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種白及多倍體植株的培育方法，所述方法包括:(I)將消毒后的白及種子抖入秋水仙素溶液中，黑暗條件下培養(yǎng)6 8d后，離心、洗漆去除秋水仙素；所述秋水仙素溶液中秋水仙素濃度為0.1 0.4%(w/w),pH5.8 6.2,溶劑為1/2MS或MS培養(yǎng)液，其中還可添加0.lmg/L-1.0mg/L的6-芐氨基嘌呤；白及種子可直接對(duì)蒴果進(jìn)行消毒，也可將蒴果中的種子取出后進(jìn)行消毒；(2)將秋水仙素處理過(guò)的白及種子轉(zhuǎn)接到白及種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，先于培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)5 6d，再移至培養(yǎng)室， 培養(yǎng)溫度23 27°C，光照度2000 25001x，光照12h/d，培養(yǎng)三個(gè)月得到多倍體白及幼苗；所述白及種子萌發(fā)培養(yǎng)基組成如下:1-萘乙酸0.2 0.5mg/L, pH5.8 6.2，溶劑為 1/2MS 或 MS 培養(yǎng)液；(3)將上述培養(yǎng)得到的白及幼苗，挑選出莖變粗、葉片加厚、葉色加深的植株，轉(zhuǎn)接到白及增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行穩(wěn)定擴(kuò)繁，選取2 3代性狀穩(wěn)定的植株進(jìn)行多倍體的鑒定；所述白及增殖培養(yǎng)基組成如下:6_節(jié)氨基嘌呤1.0 2.0mg/L, 1-萘乙酸0.1 0.5mg/L,pH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養(yǎng)液；(4)鑒定為多倍體的植株轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，即獲得白及多倍體植株的幼苗；所述生根壯苗培養(yǎng)基組成如下:1-萘乙酸0.5 0.6mg/L，香蕉汁(香蕉去皮切片加水煮，按照重量最后定容后過(guò)濾即為香蕉汁，約300g香蕉定容至1L)5 10%(v/v)，PH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養(yǎng)液。幼苗在生根壯苗培養(yǎng)基中待根長(zhǎng)到2cm以上時(shí)，打開(kāi)瓶蓋，至于室溫下培養(yǎng)2 4天后，取出小苗，洗去根部培養(yǎng)基，栽入營(yíng)養(yǎng)土中，澆透水，并用塑料薄膜覆蓋一周后去除地膜，定期進(jìn)行澆水施肥等管理，直至長(zhǎng)成白及四倍體植株，塊莖巨大，故稱(chēng)為巨莖白及(參見(jiàn)圖5)。步驟(I)所述消毒方法可如下:取白及蒴果，用洗衣粉浸泡8 lOmin，自來(lái)水沖洗5 5min,然后用75%乙醇消毒2 3min,無(wú)菌水沖洗,0.1%升萊消毒15 20min,無(wú)菌水沖洗，無(wú)菌吸水紙將蒴果表面殘留的水吸干，消毒后的白及蒴果切開(kāi)即獲得消毒后的白及種子。步驟(I)所述消毒方法如下:白及蒴果切開(kāi)，取白及種子，加入75%乙醇，IOs后立即加入無(wú)菌水，離心或過(guò)濾，取白及種子加入0.1%升汞溶液，5min后加入無(wú)菌水，離心或過(guò)濾，取白及種子用無(wú)菌吸水紙上吸干，即得消毒后的白及種子。具體可如下:直接取白及種子，每100 200mg的種子中加入0.5 Iml的75%乙醇，IOs后立即加入30 50ml的無(wú)菌水，1000 1500rpm離心2 5min使種子沉淀,去除液體,或者用無(wú)菌濾膜過(guò)濾出白及種子，之后加入0.5 Iml的0.1%升萊溶液,5min后加入,30 50ml的無(wú)菌水，1000 1500rpm離心2 5min使種子沉淀，去除液體，或者用無(wú)菌濾膜過(guò)濾出白及種子，無(wú)菌吸水紙上將殘留的水吸凈，可得無(wú)菌白及種子。多倍體的鑒定方法如下:于上午8 9時(shí)取組培苗植株的根尖，立即將材料放進(jìn)
0.002mol/L8-0H喹啉溶液，在4°C下預(yù)處理4 6h，蒸餾水清洗3遍，在4°C下，卡諾氏液(冰醋酸:無(wú)水乙醇體積比=1:3，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配)在4°C下固定24h，蒸餾水漂洗3次，每次lOmin，用l.0mol/L的鹽酸常溫解離15 20min，至除根尖外根段透明呈黃色時(shí)為宜，將根尖置于蒸餾水中低滲處理約30min或更長(zhǎng)時(shí)間，用改良苯酚品紅溶液和醋酸洋紅溶液進(jìn)行染色，30min后壓片，壓至根尖分開(kāi)成云霧狀，鏡檢觀察2n=4X=64 (圖1)，作為普通白及2n=2X=32，故可確定獲得的植株為四倍體植株。多倍體的鑒定染色體中流式分析的具體內(nèi)容如下:(a)細(xì)胞核提取液的配制組成為15mM Tris ；80mM KCl ；20mM NaCl ；20mMEDTA-Na2巰基乙醇；4mMMgCl2.6H20 ；0.l%TritonX-100 ；PH7.5。(b)制備RNA酶及染色液將RNA 酶 A 溶于 lOmmol/L Tris-HCl (pH7.5)、15mmol/L NaCl 中，配成 lOmg/mL的溶液，于100°c水浴中加熱15min，緩慢冷卻至室溫后分裝成小份，保存于-20°c中。碘化丙錠(propidium iodide, PI)及RNase (DNase-free)加入到細(xì)胞核提取液中，使其終濃度為lOOiig/ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。(C)處理材料及結(jié)果分析取白及多倍體葉片以及普通白及葉片各Ig左右，加入1.8ml冰浴預(yù)冷的細(xì)胞核提取液，在培養(yǎng)皿里用銳利的眼 科剪快速將其剪碎，以二倍體白及葉片作對(duì)照。然后經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過(guò)濾至1.5ml離心管中，4°C條件下，IOOOrpm離心5min,吸取上清液200 300 U I,加入等體積上述染色液，懸起，暗處染色5-15min,進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)及軟件分析,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組即普通白及含2C DNA，多倍體白及含4C DNA (圖2)，進(jìn)一步表明本發(fā)明所得到的白及多倍體植株為四倍體植株。按照本發(fā)明方法得到的白及四倍體幼苗，其特征如下:與二倍體白及相比，葉片明顯變厚，顏色變深，整個(gè)植株形態(tài)上明顯比二倍體白及粗大(圖3)，4X 100倍鏡下單個(gè)視野氣孔數(shù)目為5±0.907 (二倍體14±4.90)，保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)和寬分別為2.111±0.231、1.867±0.239 (二倍體白及保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)和寬分別為1.414±0.408、1.083±0.427)(圖4)。在本發(fā)明中，MS培養(yǎng)液配方舉例如下:大量元素母液:NH4N0316.5g ；MgS04 7H203.7g ；KH2PO41.7g ；KN0319g,加水溶解，定容至500ml ；鈣鹽母液:CaCl23.32g，加水溶解，定容至500ml ；微量元素母液:K10.0415g ;Na2Mo04 2H200.0125g ;H3B030.31g ;CuSO4 5H200.00125g ；MnS04 H2O0.845g ；CoCl2 6H200.00125g ；ZnSO4 7H200.43g，加水溶解，定容至500ml ；鐵鹽母液:EDTA二鈉 3.725g，加 100ml 水加熱溶解，F(xiàn)eSO4 7H202.785g，加 100ml水溶解后兩者混勻，加水配成500ml ；維生素母液:鹽酸吡哆醇(VB6) 0.025g ;鹽酸硫胺素(VBl) 0.025g ;煙酸0.025g,甘氨酸0.lg，加水溶解，定容至500ml ；
配ILMS培養(yǎng)液:取大量元素母液50ml，鈣鹽母液50ml，微量元素母液10ml，維生素母液IOml,鐵鹽母液5ml,加肌醇0.1g,鹿糖或白砂糖20 30g,蒸懼水定容至1L。1/2MS指溶液中所含的大量元素和鈣鹽為MS的一半，其他不變。本發(fā)明所獲得的多倍體白及植株具有能顯著提高單個(gè)塊莖的重量，植株形態(tài)特征為:株高40 70cm，花葶長(zhǎng)35 50cm，葉5片，葉距3 7cm，頂葉長(zhǎng)40 _55cm，寬7 IOcm,最寬葉寬8 12cm, 45 55cm?；ㄐ蛑〝?shù)13 17枚,蒴果長(zhǎng)3 5cm,直徑0.7
1.5cm。蒴果平均重1200 1800mg,最大蒴果重2300mg,單個(gè)塊莖重50 120g,直徑5 15cm0本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明利用白及種子為材料獲得的白及多倍體植株，具有顯著的多倍體特征，且制備方法簡(jiǎn)單，對(duì)白及新品種的培育工作具有重要的指導(dǎo)意義，本發(fā)明獲得的白及多倍體具有較高的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為實(shí)施例1步驟4)染色體計(jì)數(shù)結(jié)果，a為二倍體白及，b為四倍體白及(即本發(fā)明制備的多倍體植株)，4X 100倍鏡下觀察并拍照；圖2為實(shí)施例1步驟4)流式分析結(jié)果，a為二倍體白及，b為本發(fā)明所制備的四倍體植株；圖3為實(shí)施例1步驟5)生 根壯苗后得到的植株，a為本發(fā)明所制備的植株，b為二倍體白及植株；圖4為實(shí)施例1步驟5)得到的白及多倍體幼苗的氣孔大小結(jié)果，左邊為二倍體白及，右邊為本發(fā)明得到的多倍體白及植株，4X40倍鏡下單個(gè)視野中的氣孔數(shù)目和大小。圖5為實(shí)施例1步驟6 )中的白及塊莖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:實(shí)施例1:I)取白及蒴果一個(gè),用洗衣粉浸泡IOmin,用自來(lái)水沖洗5min。然后用75%乙醇消毒2min，無(wú)菌水沖洗，0.1%升汞消毒15min，無(wú)菌水將殘留的升汞沖洗干凈，無(wú)菌吸水紙將蒴果表面殘留的水吸干；2)將白及蒴果切開(kāi)，取蒴果中的種子接入0.1%秋水仙素溶液中(以1/2MS為溶劑)，黑暗條件下培養(yǎng)7d。處理完畢后，IOOOrpm離心Imin使種子沉淀，取種子，用無(wú)菌蒸餾水洗滌三次，得到初步萌發(fā)的白及種子；3)將上述秋水仙素處理過(guò)的白及種子轉(zhuǎn)接到MS+0.2mg/Ll-萘乙酸的培養(yǎng)基中，放在培養(yǎng)箱進(jìn)行暗培養(yǎng)5d，再移至培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度(25±2)°C，光照度2000 25001x，光照12h/d，培養(yǎng)三個(gè)月得到多倍體白及幼苗；4)將上述培養(yǎng)得到的白及幼苗，挑選出莖變粗、葉片加厚、葉色加深等外觀形態(tài)特征的植株，轉(zhuǎn)接到MS+1.0mg/L6-節(jié)氨基嘌呤+0.lmg/Ll-萘乙酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行穩(wěn)定擴(kuò)繁，相同培養(yǎng)基中續(xù)代培養(yǎng)2 4代，2 3代后若性狀仍穩(wěn)定，則進(jìn)行多倍體的鑒定；
具體步驟為:于上午8 9時(shí)取多倍體以及普通白及組培苗植株的根尖，立即將材料放進(jìn)0.002mol/L8-0H喹啉溶液，在4°C下預(yù)處理4 6h，蒸餾水清洗3遍，在4°C下，卡諾氏液(冰醋酸:無(wú)水乙醇=1:3，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配)在4°C下固定24h，蒸餾水漂洗3次，每次lOmin，用1.0mol/L的鹽酸常溫解離15 20min，至除根尖外根段透明呈黃色時(shí)為宜，將根尖置于蒸餾水中低滲處理約30min或更長(zhǎng)時(shí)間，用改良苯酚品紅溶液和醋酸洋紅溶液進(jìn)行染色，30min后壓片，壓至根尖分開(kāi)成云霧狀，鏡檢觀察多倍體植株2n=4X=64，普通白及植株2n=2X=32，確定所得到的為四倍體植株。進(jìn)一步進(jìn)行流式分析，主要方法步驟為:取白及多倍體葉片以及普通白及葉片各Ig左右，加入1.8ml冰浴預(yù)冷的細(xì)胞核提取液，在培養(yǎng)皿里用銳利的眼科剪快速將其剪碎，以二倍體白及葉片作對(duì)照。然后經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過(guò)濾至1.5ml離心管中，4°C條件下，IOOOrpm離心5min,吸取上清液200 300 U I,加入等體積上述染色液，懸起，暗處染色5 15min,進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)及軟件分析,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組即普通白及含2C DNA，多倍體白及含4C DNA (圖2)，進(jìn)一步表明本發(fā)明所得到的白及多倍體植株為四倍體植株。5)將四倍體白及轉(zhuǎn)接到MS+0.5mg/Ll-萘乙酸+10%香蕉汁的培養(yǎng)基中，待根長(zhǎng)到2cm以上時(shí)，打開(kāi)瓶蓋，至于室溫下2 4天，取出小苗，洗去根部培養(yǎng)基，栽入營(yíng)養(yǎng)土中，澆透水，并用塑料薄膜覆蓋一周；6)上述白及苗在地膜覆蓋一周后去除地膜，定期進(jìn)行澆水施肥等管理，三年后長(zhǎng)成白及四倍體植株，取其中一棵植株，測(cè)得株高:66cm，塊莖直徑分別為:10X9X4cm (長(zhǎng)X寬X厚);13X9X5cm。葉片5片，葉距3 7cm，頂葉長(zhǎng)41cm，寬3.5 5cm，中間葉片長(zhǎng)33cm,寬5 8cm,塊莖重93.0lg,整個(gè)植株重138g,蒴果長(zhǎng)2.5cm,直徑0.7cm。實(shí)施例2:`
具體步驟如實(shí)施例1所述，不同的是步驟2中的秋水仙素濃度為0.20%,處理時(shí)間為9d，變異率為41.07 ± 1.34%。最后，還需注意的是，以上實(shí)施例子僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例子，本發(fā)明不限于上述的實(shí)施例，還有許多變形，本領(lǐng)域相關(guān)的人員能從本發(fā)明內(nèi)容中直接導(dǎo)出或者聯(lián)想出的所有變形，均認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種白及多倍體植株的培育方法，所述方法包括: (1)將消毒后的白及種子抖入秋水仙素溶液中，黑暗條件下培養(yǎng)6 8d后，離心、洗滌去除秋水仙素；所述秋水仙素溶液濃度為0.1 0.4%，pH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養(yǎng)液； (2)將秋水仙素處理過(guò)的白及種子轉(zhuǎn)接到白及種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，先于培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)5 6d，再移至培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度23 27°C，光照度2000 25001x，光照12h/d，培養(yǎng)三個(gè)月得到多倍體白及幼苗；所述白及種子萌發(fā)培養(yǎng)基組成如下:1-萘乙酸0.2 0.5mg/L，pH5.8 6.2，溶劑為 1/2MS 或 MS 培養(yǎng)液； (3)將上述培養(yǎng)得到的白及幼苗，挑選出莖變粗、葉片加厚、葉色加深的植株，轉(zhuǎn)接到白及增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行穩(wěn)定擴(kuò)繁，選取2 3代性狀穩(wěn)定的植株進(jìn)行多倍體的鑒定；所述白及增殖培養(yǎng)基組成如下:6_節(jié)氨基嘌呤1.0 2.0mg/L, 1-萘乙酸0.1 0.5mg/L, pH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養(yǎng)液； (4)鑒定為多倍體的植株轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，即獲得白及多倍體植株的幼苗；所述生根壯苗培養(yǎng)基組成如下:1-萘乙酸0.5 1.0mg/L,香蕉汁5 10%，PH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養(yǎng)液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)所述消毒方法如下:取白及蒴果，用洗衣粉浸泡8 IOmin,自來(lái)水沖洗5 5min,然后用75%乙醇消毒2 3min,無(wú)菌水沖洗，0.1%升汞消毒15 20min，無(wú)菌水沖洗，無(wú)菌吸水紙將蒴果表面殘留的水吸干，消毒后的白及蒴果切開(kāi)即獲得消毒后的白及種子。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)所述消毒方法如下:白及蒴果切開(kāi)，取白及種子，加入75%乙醇，IOs后立即加入無(wú)菌水，離心或過(guò)濾，取白及種子加入0.1%升汞溶液，5min后加入無(wú)菌水 ，離心或過(guò)濾，取白及種子用無(wú)菌吸水紙上吸干，即得消毒后的白及種子。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種白及多倍體植株的培育方法，所述方法包括秋水仙素處理白及種子、白及種子萌發(fā)培養(yǎng)、白及幼苗增殖培養(yǎng)等步驟，鑒定為多倍體的植株再轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，即獲得白及多倍體植株的幼苗；本發(fā)明利用白及種子為材料獲得的白及多倍體植株，具有顯著的多倍體特征，且制備方法簡(jiǎn)單，對(duì)白及新品種的培育工作具有重要的指導(dǎo)意義，本發(fā)明獲得的白及多倍體具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103168685SQ20131008525
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月15日
發(fā)明者蔣福升, 丁志山, 呂迪, 李偉平, 金波, 丁濱, 高承賢 申請(qǐng)人:浙江中醫(yī)藥大學(xué)