專利名稱：一株抑制植物病原真菌的花域芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株花域芽孢桿菌。
背景技術(shù)：
隨著綠色農(nóng)業(yè)的興起和生物防治的特殊作用，從土壤中篩選拮抗微生物用于防治病害已被人們持續(xù)關(guān)注。生物防治被認(rèn)為是最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒ǎ@得高效廣譜的拮抗菌株并掌握其基本功能特性是這一研究的基礎(chǔ)。花域芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)是1996年Robert等人從土壤中首先分離得到并報(bào)道，又名死谷芽孢桿菌，它與枯草芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育親緣關(guān)系較近，只是在脂肪酸含量，DNA序列上有所差異。2006年Kyungseok等報(bào)道一株花域芽孢桿菌EXTN-1對(duì)馬鈴薯Y病毒和X病毒有誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性的作用。2007年Jae等發(fā)現(xiàn)花域芽孢桿菌具有纖溶酶活性，且對(duì)鏈球菌具有 溶菌活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一株花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)菌株,可高效抑制植物
病原真菌。本發(fā)明抑制植物病原真菌的花域芽孢桿菌為花域芽孢桿菌(Bacillusvallismortis) HWyb 1112,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2012年11月19日，保藏號(hào)為 CGMCCN0.6838。本發(fā)明花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2為革蘭氏陽性菌,長桿狀，細(xì)胞大小為(1.8“!11 2.(^111)\(0.74 111 0.84 111)，有芽孢(如圖1所示)，呈橢圓型端生；在PDA培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)24h，菌落直徑3 5mm，不透明，呈花瓣型，邊緣不整齊，表面不光滑有褶皺，顏色為淡粉色。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)花域芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)HWyblll2 進(jìn)行生理生化鑒定:花域芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2革蘭氏染色試驗(yàn)呈陽性，接觸β-半乳糖苷酶、吡咯烷基芳胺酶、β-木糖苷酶、酪氨酸芳胺酶呈陽性，接觸L-脯氨酸芳胺酶、β -N-乙酰葡萄糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶呈陰性，能夠利用D-甘露醇、D-甘露糖、古老糖、β -葡萄糖苷酶、a-葡萄糖、D-海藻糖、D-葡萄糖，不能利用D-塔格糖。本發(fā)明的花域芽抱桿菌(Bacillusvallismortis) HWyblll2 通過 16S rDNA 序列比對(duì)分析，與芽孢桿菌屬(Bacillus)的16S rDNA序列的同源性最高，保守區(qū)相似性為99%，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定花域芽孢桿菌HWybl112屬于芽抱桿菌屬(Bacillus),為花域芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)菌株。本發(fā)明的花域芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2可在PDA培養(yǎng)基上生長?；ㄓ蜓挎邨U菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2的最適生長溫度為28°C,最適生長環(huán)境的pH為7.5。本發(fā)明的花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)菌株,可高效抑制植物病原真菌，尤其是對(duì)甜菜根腐病病原菌、腐皮鐮孢霉菌、絲核菌(例如，立枯絲核菌、內(nèi)蒙葵花菌核菌)、尖孢鐮刀菌、大豆根腐病以及禾谷鐮刀菌等一系列作物根部土傳病害菌具有較為高效的拮抗作用，并具有廣泛的溫度、酸堿適應(yīng)性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，適于作為農(nóng)業(yè)生防菌加以開發(fā)利用。本發(fā)明的花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC),保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2012年11月19日，保藏號(hào)為CGMCCN0.6838。


圖1為本發(fā)明花域芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2放大8000倍的TEM圖片；圖2為通過花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis) HWyb1112和相近菌株的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；圖3為未加入花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2的立枯絲核菌的平板培養(yǎng)狀況圖；圖4為加入花域芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2的立枯絲核菌的平板培養(yǎng)狀況圖； 圖5為未加入花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis) HWyb1112的內(nèi)蒙葵花菌核菌的平板培養(yǎng)狀況圖；圖6為加入花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis) HWyb1112的內(nèi)蒙葵花菌核菌的平板培養(yǎng)狀況圖。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一:本實(shí)施方式抑制植物病原真菌的花域芽孢桿菌為花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis) HWyb1112,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2012年11月19日，保藏號(hào)為CGMCC N0.6838。本實(shí)施方式花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2為革蘭氏陽性菌，長桿狀，細(xì)胞大小為(1.8“!11 2.(^111)\(0.74 111 0.84 111)，有芽孢(如圖1所示)，呈橢圓型端生；在PDA培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)24h，菌落直徑3 5mm，不透明，呈花瓣型，邊緣不整齊，表面不光滑有 褶皺，顏色為淡粉色。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)花域芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)HWyblll2 進(jìn)行生理生化鑒定:花域芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2革蘭氏染色試驗(yàn)呈陽性，接觸β-半乳糖苷酶、吡咯烷基芳胺酶、β-木糖苷酶、酪氨酸芳胺酶呈陽性，接觸L-脯氨酸芳胺酶、β -N-乙酰葡萄糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶呈陰性，能夠利用D-甘露醇、D-甘露糖、古老糖、β -葡萄糖苷酶、a-葡萄糖、D-海藻糖、D-葡萄糖，不能利用D-塔格糖。本發(fā)明的花域芽抱桿菌(Bacillusvallismortis) HWyblll2 通過 16S rDNA 序列比對(duì)分析，與芽孢桿菌屬(Bacillus)的16S rDNA序列的同源性最高，保守區(qū)相似性為99%，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定花域芽孢桿菌HWybl112屬于芽抱桿菌屬(Bacillus),為花域芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)菌株。本實(shí)施方式的花域芽抱桿菌(Bacillus vallismortis) HWyb1112可在PDA培養(yǎng)基上生長。本實(shí)施方式花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2的最適生長溫度為28°C，最適生長環(huán)境的pH為7.5。
具體實(shí)施方式
二:本實(shí)施方式花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis) HWyb1112由黑龍江省哈爾濱呼蘭區(qū)健康甜菜田植株根部O 15cm的泥土中篩選得到。篩選按以下步驟進(jìn)行:將采集的健康甜菜根際土，風(fēng)干、研碎、過篩，取其中1.0g于帶有玻璃珠的IOOmL
無菌水中，充分振蕩，制成懸濁液，以10倍稀釋得到ΙΟΛ ΟΛΚΓ3......稀釋液。取其中
0.1mL梯度稀釋液于上PDA和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30°C恒溫培養(yǎng)，觀察菌種形態(tài)菌落顏色，進(jìn)行初篩，直至獲得單菌落。測(cè)定拮抗能力，最終獲得目的菌株，試管斜面4°C保存。對(duì)篩選得到的花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2進(jìn)行分子鑒定，按以下步驟進(jìn)行:利用引物16F和16R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后委托上海英駿生物科技有限公司測(cè)序；其中，PCR擴(kuò)增引物序列如下:16F:5/ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16R:5/ -CTAC·GGCTACCTTGTTACGA-3'，PCR 擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性 5min，95°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 90s，30個(gè)循環(huán)；72°C終延伸IOmin。PCR引物購買自上海生工生物技術(shù)有限公司，其他試劑購自于哈爾濱賽拓生物技術(shù)有限公司。花域芽抱桿菌(Bacillusvallismortis) Hffyb 1112 的 16 SrDNA 序列長度為1584bp,其序列提交至GenBank,測(cè)序結(jié)果與GenBank中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，然后用軟件DNAMAN的Observed Divergency構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖3所示)，以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，該序列與芽孢桿菌屬(Bacillus)的16S rDNA序列的同源性最高，保守區(qū)相似性為99%，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定花域芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2屬于芽抱桿菌屬(Bacillus),為花域芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)菌株。通過平板培養(yǎng)的方法檢測(cè)篩選得到的花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)HWybl112的抑菌性:未加入花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2的立枯絲核菌的平板培養(yǎng)狀況圖如圖3所示，從圖3可以看出，平板中長滿了立枯絲核菌；加入花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2的立枯絲核菌的平板培養(yǎng)狀況圖如圖4所示，從圖4可以看出，平板中的立枯絲核菌得到了抑制；由圖3和圖4對(duì)比可以得出，花域芽抱桿菌(Bacillus vallismortis) HWyb1112可高效抑制立枯絲核菌，對(duì)立枯絲核菌有拮抗作用。
未加入花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2的內(nèi)蒙葵花菌核菌的平板培養(yǎng)狀況圖如圖5所示，從圖5可以看出，平板中長滿了內(nèi)蒙葵花菌核菌；加入花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2的內(nèi)蒙葵花菌核菌的平板培養(yǎng)狀況圖如圖6所示，從圖6可以看出，平板中的內(nèi)蒙葵花菌核菌得到了抑制；由圖5和圖6對(duì)比可以得出，花域芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2可高效抑制內(nèi)蒙葵花菌核 菌，對(duì)內(nèi)蒙葵花菌核菌有拮抗作用。
權(quán)利要求
1.一株抑制植物病原真菌的花域芽孢桿菌，其特征在于抑制植物病原真菌的花域芽孢桿菌為花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)HWyblll2,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2012年11月19日，保 藏號(hào)為CGMCC N0.6838。
全文摘要
一株抑制植物病原真菌的花域芽孢桿菌，它涉及一株花域芽孢桿菌。本發(fā)明提供一株花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)菌株，可高效抑制植物病原真菌。本發(fā)明抑制植物病原真菌的花域芽孢桿菌為花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2012年11月19日，保藏號(hào)為CGMCC No.6838。本發(fā)明的花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)菌株，具有廣泛的溫度、酸堿適應(yīng)性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，適于作為農(nóng)業(yè)生防菌加以開發(fā)利用。
文檔編號(hào)A01P3/00GK103232952SQ201310085260
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者殷博, 曹亞彬, 吳皓瓊, 耿貴, 甄濤, 郭立姝, 牛彥波, 黨阿麗, 何鑫, 楊亮 申請(qǐng)人:黑龍江省科學(xué)院微生物研究所