專利名稱：一種提取ε-聚賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及防腐劑的提取技術(shù)，具體涉及一種從發(fā)酵液中提取ε-聚賴氨酸(ε -poly-L-lysine, ε -PL)的方法。
背景技術(shù)：
飼料的腐敗變質(zhì)會引起巨大的經(jīng)濟損失，如何防止腐敗是科學(xué)工作者最為關(guān)注的一個問題。目前，常用的防腐措施是添加飼料防腐劑，飼料防腐劑分為化學(xué)防腐劑、天然防腐劑和復(fù)合型防腐劑，其中使用最為廣泛的是化學(xué)防腐劑。隨著人們對食品安全性的認識和要求的逐步提高，化學(xué)防腐劑受到嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，飼料防霉防腐劑的天然化已成為今后的發(fā)
展趨勢。ε -聚賴氨酸是一種新型的天然防霉防腐劑，它不但對人體健康無害，有的還具有一定的營養(yǎng)價值，是今后開發(fā)的方向。ε -聚賴氨酸是L-賴氨酸殘基通過α -羧基和ε-氨基形成的酰胺鍵連接而成的均聚氨基酸，故稱為ε-聚賴氨酸。ε-聚賴氨酸具有廣譜抗菌性，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌均有很好的抑菌效果，是目前天然防腐劑中具有優(yōu)良防腐性能和巨大商業(yè)潛力的微生物類飼料防腐劑。迄今為止，ε -聚賴氨酸的微生物發(fā)酵在日本已實現(xiàn)工業(yè)化，年產(chǎn)千噸ε-聚賴氨酸的現(xiàn)代化工業(yè)裝置已建成投產(chǎn)。ε -聚賴氨酸生物防腐劑是一種天然的微生物代謝產(chǎn)物，是需要經(jīng)分離提取精制而獲得的發(fā)酵產(chǎn)品。但是，提取工藝繁瑣、收率低、含量低、費用高一直是限制ε-聚賴氨酸工業(yè)化的重要因素，因此，開發(fā)新的提取純化工藝對其工業(yè)化具有
重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提取ε -聚賴氨酸的方法，以解決上述提取工藝繁瑣、收率低、含量低、費用高的問題。技術(shù)方案如下:一種提取ε-聚賴氨酸的方法，其特征在于，包括以下步驟:I)先將發(fā)酵液加熱至60_100°C，保溫5-30分鐘，再冷卻至10_60°C，加入硅藻土吸附，經(jīng)離心后得清濾液；2)將所述清濾液調(diào)pH值為6.0-10.0，得堿化液；3)將所述堿化液加入樹脂吸附柱中進行吸附，并保持吸附過程的pH值保持在6.0-10.0范圍內(nèi)，直到樹脂吸附達飽和狀態(tài)；先洗滌飽和樹脂，后進行解析，解析結(jié)束，得解析液；4)在所述解析液中加入活性炭進行脫色，過濾得脫色液；5)將所述脫色液濃縮至ε-PL含量在3-70%，得濃縮液，所述濃縮液經(jīng)干燥得產(chǎn)
品O進一步地，步驟I)中離心包括2次，初次離心采用臥螺離心機；二次離心采用管式離心機。進一步地，步驟3)中所述吸附柱的高度與直徑比為2-10:1。進一步地，步驟3)中所述樹脂為弱酸性陽離子交換樹脂。進一步地，步驟3)中，依次用純化水和醋酸溶液洗滌飽和樹脂，所述醋酸溶液濃度為 0.05-0.5mol/L。進一步地，步驟3)中，用鹽酸溶液進行解析，所述鹽酸溶液濃度為0.05-1.0mol/L0進一步地，步驟3)中，利用特異性檢測方法跟蹤檢測ε -聚賴氨酸的濃度，根據(jù)濃度控制所述解析過程。進一步地,步驟4)中所述活性炭的加入量為所述解析液質(zhì)量的0.5-5.0%。進一步地，脫色過程為:先將解析液加熱升溫至40_90°C，攪拌脫色5-90分鐘，然后冷卻至10-40°C,過濾。進一步地，所述干燥為噴霧干燥或結(jié)晶干燥，所述結(jié)晶所用溶劑為乙醇和乙醚的混合液。本發(fā)明的技術(shù)效果:1、本發(fā)明的提取工藝運用樹脂與濃縮結(jié)晶相結(jié)合的方法從發(fā)酵液中提取精制ε -聚賴氨酸，所用原料、儀器取材容易，工藝簡單，成本低。2、所得ε -聚賴氨酸產(chǎn)品的回收率不低于74%，純度不低于93.2%。3、所得ε -聚賴氨酸分子量為3000-5000。


圖1本發(fā)明所用原料發(fā)酵液的液相圖；圖2本發(fā)明最終得到的ε -聚賴氨酸的液相圖。
具體實施例方式下面通過實施例進一步描述本發(fā)明。本發(fā)明所用原料發(fā)酵液為山東信得科技股份有限公司自制，指用白色鏈霉菌在培養(yǎng)基中，在一定的條件下，經(jīng)培養(yǎng)而成的液體，發(fā)酵液中富含ε -聚賴氨酸。實施例中使用的離子交換樹脂經(jīng)過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的堿洗和酸洗過程，可重復(fù)使用。實施例1剛下罐的發(fā)酵液，pH為3.0-5.0，先加熱發(fā)酵液至80°C，保溫15分鐘后，冷卻至30°C，加入硅藻土吸附，先采用臥螺離心機第一次離心，后采用管式離心機進行第二次離心，離心除去菌體后，得到清濾液。加入濃度為5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)清濾液pH=8.5，得堿化液。冷卻后將堿化液壓入弱酸性陽離子交換樹脂吸附柱進行吸附，本實施例優(yōu)選152樹月旨，吸附柱的高度與直徑比為5:1，吸附過程控制流速為6BV/h，同時不斷加入氫氧化鈉，保證吸附過程的PH值保持為8.5，直到樹脂吸附達飽和狀態(tài)。依次用純化水和0.2mol/L醋酸溶液各洗滌2次。用預(yù)先配制的0.lmol/L鹽酸溶液進行洗脫，控制洗脫速度，利用特異性檢測方法跟蹤檢測ε -聚賴氨酸的濃度，特異性檢測方法包括自外紫外分光光度法和高效液相色譜法等，本實施例優(yōu)選高效液相色譜法，解吸結(jié)束，得解析液。解析液用lmol/L NaOH中和至pH=6.5，在解析液中加入4.0%的活性炭，加熱升溫至70°C，攪拌脫色30分鐘，然后冷卻至30°C，過濾得脫色液。將脫色液在60°C以下減壓蒸餾濃縮，將濃縮至ε-PL含量在10%時，停止?jié)饪s，得濃縮液。濃縮液加入5倍體積的乙醇和乙醚的混合液結(jié)晶，混合液中乙醇和乙醚體積比為2: I ;過濾后得到沉淀物，沉淀物經(jīng)干燥，得到ε-聚賴氨酸純品。所得產(chǎn)品回收率為77%，純度為94.9%。實施例2剛下罐的發(fā)酵液，pH為3.0-5.0，先加熱發(fā)酵液至60°C，保溫30分鐘，冷卻至10°C，加入硅藻土吸附，先采用臥螺離心機第一次離心，后采用管式離心機進行第二次離心，離心除去菌體后，得到清濾液。加入濃度為5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)清濾液PH=I0.0，得堿化液。冷卻后將堿化液壓入弱酸性陽離子交換樹脂吸附柱進行吸附，本實施例優(yōu)選HD-2樹脂，吸附柱的高度與直徑比為10:1，吸附過程控制流速4BV/h，同時不斷加入氫氧化鈉，保證吸附過程的PH值保持為10.0，直到樹脂吸附達飽和狀態(tài)。依次用純化水和0.05mol/L醋酸溶液各洗滌2次。用預(yù)先配制的1.0mol/L鹽酸溶液進行洗脫，控制洗脫速度，利用特異性檢測方法跟蹤檢測ε -聚賴氨酸的濃度，特異性檢測方法包括自外紫外分光光度法和高效液相色譜法等，本實施例優(yōu)選高效液相色譜法，解吸結(jié)束，得解析液。解析液用lmol/LNaOH中和至pH=7，在解析液中加入0.5%的活性炭，加熱升溫至40°C，攪拌脫色90分鐘，然后冷卻至40°C，過濾得脫色液。將脫色液在70°C以下減壓蒸餾濃縮，將濃縮至ε-PL含量在70%時，停止?jié)饪s，得濃縮液。濃縮液加入3倍體積的乙醇和乙醚的混合液結(jié)晶，混合液中乙醇和乙醚體積比為2: I ;過濾后得到沉淀物，沉淀物經(jīng)干燥，得到ε-聚賴氨酸純品。所得產(chǎn)品回收率為74%，純度為95.8%。

實施例3剛下罐的發(fā)酵液，pH為3.0-5.0，先加熱發(fā)酵液至100°C，保溫5分鐘，冷卻至60°C，加入硅藻土吸附，先采用臥螺離心機第一次離心，后采用管式離心機進行第二次離心，離心除去菌體后，得到清濾液。加入濃度為5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)清濾液pH=6.0,得堿化液。冷卻后將堿化液壓入弱酸性陽離子交換樹脂吸附柱進行吸附，本實施例優(yōu)選HD-2樹脂，吸附柱的高度與直徑比為2:1，吸附過程應(yīng)控制流速5BV/h，同時不斷加入氫氧化鈉，保證吸附過程的PH值保持為6.0，直到樹脂吸附達飽和狀態(tài)。依次用純化水和0.5mol/L醋酸溶液各洗滌2次。用預(yù)先配制的0.05mol/L鹽酸溶液進行洗脫，控制洗脫速度，利用特異性檢測方法跟蹤檢測ε -聚賴氨酸的濃度，特異性檢測方法包括自外紫外分光光度法和高效液相色譜法等，本實施例優(yōu)選高效液相色譜法，解吸結(jié)束，得解析液。解析液用lmol/LNaOH中和至pH=7，在解析液中加入5.0%的活性炭，加熱升溫至90°C，攪拌脫色5分鐘，然后冷卻至10°C，過濾得脫色液。將脫色液在50°C以下減壓蒸餾濃縮，將濃縮至ε-PL含量在3%時，停止?jié)饪s，得濃縮液。濃縮液經(jīng)噴霧干燥，得到ε-聚賴氨酸純品。所得產(chǎn)品回收率為79%，純度為93.2%。實施例4剛下罐的發(fā)酵液，pH為3.0-5.0,先加熱發(fā)酵液至85°C，保溫30分鐘后，冷卻至40°C，加入硅藻土吸附，先采用臥螺離心機第一次離心，后采用管式離心機進行第二次離心，離心除去菌體后，得到清濾液。加入濃度為5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)清濾液pH=7.5，得堿化液。冷卻后將堿化液壓入弱酸性陽離子交換樹脂吸附柱進行吸附，本實施例優(yōu)選152樹月旨，吸附柱的高度與直徑比為6:1，吸附過程控制流速為3BV/h，同時不斷加入氫氧化鈉，保證吸附過程的PH值保持為7.5，直到樹脂吸附達飽和狀態(tài)。依次用純化水和0.4mol/L醋酸溶液各洗滌2次。用預(yù)先配制的0.lmol/L鹽酸溶液進行洗脫，控制洗脫速度，利用特異性檢測方法跟蹤檢測ε -聚賴氨酸的濃度，特異性檢測方法包括自外紫外分光光度法和高效液相色譜法等，本實施例優(yōu)選高效液相色譜法，解吸結(jié)束，得解析液。解析液用lmol/L NaOH中和至pH=7，在解析液中加入2.5%的活性炭，加熱升溫至50°C，攪拌脫色80分鐘，然后冷卻至20°C，過濾得脫色液。將脫色液在60°C以下減壓蒸餾濃縮，將濃縮至ε -PL含量在15%時，停止?jié)饪s，得濃縮液。濃縮液加入5倍體積的乙醇和乙醚的混合液結(jié)晶，混合液中乙醇和乙醚體積比為2: I ;過濾后得到沉淀物，沉淀物經(jīng)干燥，得到ε-聚賴氨酸純品。所得產(chǎn)品回收率為76.4%，純度為96.1%。實施例5剛下罐的發(fā)酵液，pH為3.0-5.0,先加熱發(fā)酵液至70V，保溫20分鐘后，冷卻至30°C，加入硅藻土吸附，先采用臥螺離心機第一次離心，后采用管式離心機進行第二次離心，離心除去菌體后，得到清濾液。加入濃度為5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)清濾液pH=7.0，得堿化液。冷卻后將堿化液壓入弱酸性陽離子交換樹脂吸附柱進行吸附，本實施例優(yōu)選152樹月旨，吸附柱的高度與直徑比為3:1，吸附過程控制流速為4BV/h，同時不斷加入氫氧化鈉，保證吸附過程的PH值保持為7.0，直到樹脂吸附達飽和狀態(tài)。依次用純化水和0.lmol/L醋酸溶液各洗滌2次。用預(yù)先配制的0.15mol/L鹽酸溶液進行洗脫，控制洗脫速度，利用特異性檢測方法跟蹤檢測ε -聚賴氨酸的濃度，特異性檢測方法包括自外紫外分光光度法和高效液相色譜法等，本實施例優(yōu)選高效液相色譜法，解吸結(jié)束，得解析液。解析液用lmol/L NaOH中和至pH=7.5，在解析液中加入1.0%的活性炭，加熱升溫至40°C，攪拌脫色70分鐘，然后冷卻至10°C，過濾得脫色液。將脫色液在60°C以下減壓蒸餾濃縮，將濃縮至ε-PL含量在7%時，停止?jié)饪s，得濃縮液。濃縮液加入5倍體積的乙醇和乙醚的混合液結(jié)晶，混合液中乙醇和乙醚體積比為2: I ;過濾后得到沉淀物，`沉淀物經(jīng)干燥，得到ε-聚賴氨酸純品。所得產(chǎn)品回收率為75.2%，純度為94.9%。實施例6剛下罐的發(fā)酵液，pH為3.0-5.0,先加熱發(fā)酵液至90°C，保溫10分鐘后，冷卻至20°C，加入硅藻土吸附，先采用臥螺離心機第一次離心，后采用管式離心機進行第二次離心，離心除去菌體后，得到清濾液。加入濃度為5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)清濾液pH=9.0，得堿化液。冷卻后將堿化液壓入弱酸性陽離子交換樹脂吸附柱進行吸附，本實施例優(yōu)選152樹月旨，吸附柱的高度與直徑比為8:1，吸附過程控制流速為7BV/h，同時不斷加入氫氧化鈉，保證吸附過程的PH值保持為9.0，直到樹脂吸附達飽和狀態(tài)。依次用純化水和0.4mol/L醋酸溶液各洗滌2次。用預(yù)先配制的0.09mol/L鹽酸溶液進行洗脫，控制洗脫速度，利用特異性檢測方法跟蹤檢測ε -聚賴氨酸的濃度，特異性檢測方法包括自外紫外分光光度法和高效液相色譜法等，本實施例優(yōu)選高效液相色譜法，解吸結(jié)束，得解析液。解析液用lmol/L NaOH中和至pH=6.5，在解析液中加入4.0%的活性炭，加熱升溫至80°C，攪拌脫色20分鐘，然后冷卻至30°C，過濾得脫色液。將脫色液在60°C以下減壓蒸餾濃縮，將濃縮至ε-PL含量在15%時，停止?jié)饪s，得濃縮液。濃縮液加入4倍體積的乙醇和乙醚的混合液結(jié)晶，混合液中乙醇和乙醚體積比為2: I ;過濾后得到沉淀物，沉淀物經(jīng)干燥，得到ε-聚賴氨酸純品。所得產(chǎn)品回收率為75.4%，純度為95.6%。所得ε -聚賴氨酸的純度鑒定，以實施例1所得ε _聚賴氨酸純品為研究對象。采用高效液相色譜法對發(fā)酵液及分離純化得到的ε -聚賴氨酸進行檢測，檢測結(jié)果如圖1-2所示。圖1表明，發(fā)酵液中含有其他物質(zhì)，保留時間分別為4.48917min、
5.63250min、8.58250min，對應(yīng)的峰面積分別為 3392.03,26316.17,429.11 ;保留時間為4.48917min所對應(yīng)的峰為ε -聚賴氨酸，與另兩種物質(zhì)相比，ε -聚賴氨酸含量較小。圖2為分離純化得到的ε -聚賴氨酸的液相色譜圖,其中物質(zhì)的保留時間分別為4.51500min、
6.04250min、7.39250min,對應(yīng)的峰面積分別為3190.94,40.66,99.58，保留時間為
4.51500min所對應(yīng)的峰為ε -聚賴氨酸，圖2表明分離純化物中主要成分為ε -聚賴氨酸。本發(fā)明提取所得ε -聚賴氨酸的特性:1、ε -聚賴氨酸能在人體內(nèi)分解為賴氨酸，而賴氨酸是人體必需8種氨基酸之一，也是世界各國允許在食品中強化的氨基酸，因此ε -聚賴氨酸是一種營養(yǎng)型抑菌劑，安全性高于其它化學(xué)防腐劑；聚賴氨酸具有廣譜抗菌性，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效果，它對耐熱性芽抱桿菌也有一定的作用；ε-聚賴氨酸對熱穩(wěn)定非常好，其水溶液在80°C處理60min，10(TC處理30min，120°C處理20min后對大腸桿菌最小抑菌濃度不變，說明ε -聚賴氨酸在高溫情況下不分解、不失活，能夠承受一般食品的加工過程中的熱處理，可以隨原料一同進行滅菌處理，防止二次污染。

2、可用作食品防腐劑、生物高分子材料、畜禽促生長劑等。3、溶于水、鹽酸，微溶于乙醇，不溶于乙醚、乙酸乙酯等有機溶劑。4、對茚三酮反應(yīng)呈陽性，用濃度為6mol/L的HCl水溶液水解后對茚三酮呈陽性。5、經(jīng)濃度為6mol/L的HCl水溶液水解后，用薄層層析檢測，結(jié)果表明水解液中生成單一的氨基酸-賴氨酸，說明本產(chǎn)品為賴氨酸的高分子聚合物。6、采用核磁氫譜1H NMR，鑒定了本品的結(jié)構(gòu)為ε -型結(jié)構(gòu)，通過a -COOH和ε -NH2之間以脫去一個水分子的方式形成ε-聚賴氨酸。7、由凝膠滲透色譜測出ε -PL分子量為3000-5000。
權(quán)利要求
1.一種提取ε-聚賴氨酸的方法，其特征在于，其包括以下步驟: 1)先將發(fā)酵液加熱至60-100°C，保溫5-30分鐘，再冷卻至10-60°C，加入硅藻土吸附，經(jīng)離心后得清濾液； 2)將所述清濾液調(diào)pH值為6.0-10.0，得堿化液； 3)將所述堿化液加入樹脂吸附柱中進行吸附，并保持吸附過程的pH值保持在6.0-10.0范圍內(nèi)，直到樹脂吸附達飽和狀態(tài)；先洗滌飽和樹脂，后進行解析，解析結(jié)束，得解析液； 4)在所述解析液中加入活性炭進行脫色，過濾得脫色液； 5)將所述脫色液濃縮至ε-PL含量在3-70%，得濃縮液，所述濃縮液經(jīng)干燥得產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟I)中離心包括2次，初次離心采用臥螺離心機；二次離心采用管式離心機。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述吸附柱的高度與直徑比為2-10:1。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述樹脂為弱酸性陽離子交換樹脂。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟3)中，依次用純化水和醋酸溶液洗滌飽和樹脂，所述醋酸溶液濃度為0.05-0.5mol/L。
6.如權(quán)利要 求1所述的方法，其特征在于:步驟3)中，用鹽酸溶液進行解析，所述鹽酸溶液濃度為0.05-1.0moI/L0
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟3)中，利用特異性檢測方法跟蹤檢測ε -聚賴氨酸的濃度，根據(jù)濃度控制所述解析過程。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟4)中所述活性炭的加入量為所述解析液質(zhì)量的0.5-5.0%。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:脫色過程為:先將解析液加熱升溫至40-900C，攪拌脫色5-90分鐘，然后冷卻至10-40°C，過濾。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述干燥為噴霧干燥或結(jié)晶干燥，所述結(jié)晶所用溶劑為乙醇和乙醚的混合液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提取ε-聚賴氨酸的方法，將發(fā)酵液經(jīng)硅藻土吸附后離心得到清濾液，然后將清濾液堿化再加入樹脂吸附柱中進行吸附，經(jīng)洗滌飽和樹脂、解析，得解析液，用活性炭將解析液脫色，過濾、濃縮，后經(jīng)噴霧干燥或結(jié)晶干燥即得ε-聚賴氨酸純品。本發(fā)明所用原料、儀器取材容易，工藝簡單，成本低；所得產(chǎn)品收率高，純度高。
文檔編號A23K1/16GK103159949SQ20131008735
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者李朝陽, 李常青, 喬彥良 申請人:山東信得科技股份有限公司