專利名稱：一種小麥幼胚的冷凍儲(chǔ)藏方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小麥幼胚的冷凍儲(chǔ)藏方法。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物之一，利用組織離體培養(yǎng)獲得再生植株是開展小麥細(xì)胞工程育種和轉(zhuǎn)基因育種的重要環(huán)節(jié)。目前為止，對小麥生長點(diǎn)、幼胚、幼穗、花藥、成熟胚、小孢子等外植體材料培養(yǎng)先后獲得了再生植株，然而，不同組織、器官之間再生率差異較大。其中，小麥幼胚被認(rèn)為是再生率最高的外植體類型。為了提高小麥幼胚培養(yǎng)再生植株的效率，國內(nèi)學(xué)者詳細(xì)研究了影響小麥幼胚培養(yǎng)的因素，包括基因型、植物激素、幼胚大小、培養(yǎng)基組成、碳源、有機(jī)添加物、氧氣濃度、干燥處理和培養(yǎng)程序等。另外，發(fā)現(xiàn)小麥供體植株生長的環(huán)境條件，如溫度、光照、營養(yǎng)、濕度等，通過影響小麥幼胚的生理狀態(tài)而影響其再生效果。上述研究結(jié)果顯著提高了小麥幼胚的再生效率，促進(jìn)了小麥遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展。但小麥幼胚供應(yīng)受季節(jié)、生長環(huán)境條件的嚴(yán)格制約。例如在我國華北地區(qū)，每年用于小麥轉(zhuǎn)基因研究的幼胚主要來自二種環(huán)境條件下，一是I月-3月取自溫室，二是5月中旬到6月上旬取自大田。來源于人工環(huán)境的實(shí)驗(yàn)材料數(shù)量有限，尤其一些科研單位缺乏人工氣候設(shè)施，不能滿足小麥轉(zhuǎn)化對幼胚材料的需求，小麥幼胚材料主要從自然環(huán)境中獲得。然而，每年從大田中取樣適宜小麥幼胚材料的時(shí)間非常短促，在傳統(tǒng)低溫儲(chǔ)藏條件下(4°C )只能儲(chǔ)藏3 5天，超過7天后幾乎失去了再生潛力，限制了小麥轉(zhuǎn)基因研究的開展和工作效率。探討冷凍儲(chǔ)存小麥幼胚的方法，在保持小麥幼胚再生性能的基礎(chǔ)上延長其供應(yīng)時(shí)間，對于開展小麥細(xì)胞工程育種和轉(zhuǎn)基因育種具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種小麥幼胚的冷凍儲(chǔ)藏方法，該方法可延長小麥幼胚在組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因研究中的供給時(shí)間。本發(fā)明所提供的小麥幼胚的冷凍儲(chǔ)藏方法，具體是將小麥幼穗置于溫度-10°C (TC的條件下保存。在所述方法中，所述小麥幼穗為開花授粉13 16天的小麥幼穗。此時(shí)，所述小麥幼穗中的小麥幼胚為心形期幼胚。具體的，所述小麥幼胚的大小為1.3 1.5mm。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述小麥具體為小麥品種CB037。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述方法中的所述溫度具體為_5°C。相應(yīng)的，所述保存的時(shí)間可達(dá)25天，如20天，再如5 15天或10 15天。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述方法中的所述溫度具體為-10°C。相應(yīng)的，所述保存的時(shí)間可達(dá)10天,如7 9天。
在所述方法中，所述小麥幼穗是用錫箔紙包裹后進(jìn)行低溫冷凍保存的。既可以減少保存過程中的水分蒸發(fā)，又能適當(dāng)透氣。本發(fā)明通過利用零下低溫儲(chǔ)存小麥幼穗，延長了小麥幼胚的供給時(shí)間，一定程度上解決了小麥幼胚取材受季節(jié)性及人工氣候條件限制的問題，對于小麥規(guī)?；D(zhuǎn)基因研究具有重要意義。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)-10 0°c是適宜長期儲(chǔ)存小麥幼胚的溫度條件:-1o°c條件下可保存10天左右，小麥幼胚的再生率與未經(jīng)低溫儲(chǔ)藏的對照組小麥幼胚相比無顯著差異，而且實(shí)生芽率顯著降低；-5°C條件下可保存25天左右，特別是保存5 15天時(shí)，小麥幼胚的再生率與未經(jīng)低溫儲(chǔ)藏的對照組小麥幼胚相比更高，且顯著差異，同時(shí)實(shí)生芽率顯著降低。


圖1為小麥CB037幼胚經(jīng)_5°C低溫處理不同時(shí)間后的組織培養(yǎng)情況。其中，A的處理時(shí)間為O天(對照CK);B的處理時(shí)間為5天；C的處理時(shí)間為10天；D的處理時(shí)間為15天；E的處理時(shí)間為25天。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。小麥(Triticum aestivum L.)品種CB037:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥分子育種課題組陳孝研究員·等培育，已申請國家農(nóng)業(yè)植物新品種保護(hù)權(quán)(申請日:2012年2月28日，申請?zhí)?20120164.2:公告日:2012年7月I日，公告號(hào):CNA008910E)，涉及該品種的相關(guān)文章有:“別曉敏，杜麗璞，徐惠君，葉興國.培養(yǎng)基中CuSO4和Fe鹽濃度對小麥胚培養(yǎng)再生效果的影響，植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2011，12 (6):975-981”；“張?jiān)讫?，王美蚊，張悅，褚翠萍，林志珊，徐瓊芳，葉興國，陳孝，張憲省.不同簇毛麥6VS染色體臂的白粉病抗性特異功能標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用.作物學(xué)報(bào)，2012，38(10): 1827-1832”;“別曉敏，佘茂云，杜麗璞，徐惠君，葉興國.不同生長素類型及組合對小麥幼胚再生效果的影響，核農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，25(5):1023-1028”。該品種中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥分子育種課題組可向社會(huì)無償提供。SD2 培養(yǎng)基:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2PO41700mg/L、KI0.83mg/L、H3B036.2mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H200.025mg/L、CoCl2.6H200.025mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2027.8mg/L、Na2-EDTA.2H2037.3mg/L、蔗糖 30g/L、維生素 BJmg/L、谷氨酰胺150mg/L、2，4-D2.0mg/L、Phytagel (植物凝膠)2.4g/L，pH 值為 6.0。以上成分采用 121。。高壓濕熱滅菌15分鐘。以上各濃度均為相應(yīng)組分在培養(yǎng)基中的終濃度。FHCK 培養(yǎng)基:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2PO41700mg/L、KI0.83mg/L、H3B036.2mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H200.025mg/L、CoCl2.6H200.025mg/L，F(xiàn)eSO4.7Η2027.8mg/L、Na2-EDTA.2Η2037.3mg/L、維生素 B1ImgZUVB60.5mg/L、煙酸 0.5mg/L、甘氨酸 2mg/L、肌醇 100mg/L、鹿糖 20g/L、Phytagel (植物凝膠)2.4g/L,pH 值為 6.0。以上成分采用121°C高壓濕熱滅菌15分鐘。以上各濃度均為相應(yīng)組分在培養(yǎng)基中的終濃度。實(shí)施例1、小麥CB037幼胚_(dá)10°C低溫儲(chǔ)藏試驗(yàn)本實(shí)施例中，以小麥品種CB037為試驗(yàn)對象，研究分析了將小麥CB037的幼胚置于-10°c低溫儲(chǔ)藏不同時(shí)間后再進(jìn)行組織培養(yǎng)的效果。具體如下:
一、小麥幼穗的獲得將小麥品種CB037種植在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(4 5月份，小麥生長期間溫度15 30°C)，開花授粉后13 16天，收集小麥CB037未成熟麥穗，此時(shí)小麥幼胚為心形期幼胚，胚的大小為1.3 1.5_。二、-10°C低溫處理小麥幼穗不同時(shí)間將步驟一得到的小麥CB037幼穗用錫箔紙緊緊包裹，置于塑封袋中，儲(chǔ)放在_10°C低溫冰箱中不同時(shí)間(0、1、5、7、9、11天)。三、組織培養(yǎng)1、誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織將步驟二中-10°C低溫儲(chǔ)藏不同時(shí)間的小麥幼穗取出，剝離小麥未成熟籽粒，經(jīng)濃度為15% (體積分?jǐn)?shù))的次氯酸鈉水溶液滅菌、無菌水沖洗后，在無菌濾紙上將小麥幼胚整胚挑出，在無菌濾紙上吸去表面液體，胚軸朝下接種至SD2培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿接種50 60枚小麥幼胚，25°C、黑暗條件下培養(yǎng)21天誘導(dǎo)胚性愈傷組織。同時(shí)以不經(jīng)低溫處理的小麥幼胚作為對照I (CKl)，以經(jīng)4°C低溫處理5天的小麥幼胚作為對照2 (CK2)。2、分化培養(yǎng)得到小麥再生植株將步驟I所得的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到FHCK培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 25天(光照強(qiáng)度為3500Lx，溫度為25°C )，分化得到小麥再生綠芽。其間，記錄接種幼胚數(shù) ，統(tǒng)計(jì)實(shí)生芽數(shù)、愈傷組織數(shù)、胚性愈傷組織數(shù)、再生芽數(shù)、實(shí)生芽率、胚性愈傷組織誘導(dǎo)率、再生率。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。實(shí)生芽率(%)=(實(shí)生芽數(shù)+接種幼胚數(shù))X 100胚性愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=(胚性愈傷組織數(shù)+接種幼胚數(shù))XlOO再生率(%)=(再生芽數(shù)+接種幼胚數(shù))X 100四、小麥幼胚-10°C低溫處理不同時(shí)間后組織培養(yǎng)的效果分析小麥CB037幼胚再生效果結(jié)果如表I所示。從表中可以看出，對照I (CKl)不經(jīng)低溫處理，小麥CB037幼胚的再生率為137.53%，與經(jīng)過_10°C低溫處理7天和9天的小麥幼胚再生率116.13%和128.69%無顯著差異，且優(yōu)于對照2 (CK2)在普通低溫(4°C )條件下儲(chǔ)存5天的結(jié)果，這表明-10°C低溫儲(chǔ)存下小麥CB037幼胚至少能儲(chǔ)存10天左右，延長了受體材料的供給時(shí)間。此外，-1o°c低溫處理僅I天就顯著降低了幼胚直接萌發(fā)成苗率(SP實(shí)生芽率)，從而省略了試驗(yàn)中削除胚尖的過程，可加快接種速度，提高工作效率。-1o°c低溫處理對胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響不顯著，處理I天胚性愈傷組織誘導(dǎo)率比對照I(CKl)和對照2 (CK2)提高，之后與2個(gè)對照相當(dāng)。表I小麥CB037經(jīng)_10°C低溫處理不同時(shí)間組織培養(yǎng)情況
權(quán)利要求
1.一種小麥幼胚的冷凍儲(chǔ)藏方法，是將小麥幼穗置于溫度-10°C o°c的條件下保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述小麥幼穗為開花授粉13 16天的小麥幼穗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述小麥幼穗中的小麥幼胚為心形期幼胚。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于:所述小麥幼胚的大小為1.3 1.Smnin
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于:所述小麥為小麥品種CB037。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述溫度為_5°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于:所述保存的時(shí)間為25天以內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述溫度為-10°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的方法，其特征在于:所述保存的時(shí)間為10天以內(nèi)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，所述小麥幼穗是用錫箔紙包裹后進(jìn) 行保存的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小麥幼胚的冷凍儲(chǔ)藏方法。本發(fā)明所提供的小麥幼胚的冷凍儲(chǔ)藏方法，是將小麥幼穗置于溫度-10℃～0℃的條件下保存。本發(fā)明通過利用零下低溫儲(chǔ)存小麥幼穗，延長了小麥幼胚的供給時(shí)間，一定程度上解決了小麥幼胚取材受季節(jié)性及人工氣候條件限制的問題，對于小麥規(guī)?；D(zhuǎn)基因研究具有重要意義。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)-10～0℃是適宜長期儲(chǔ)存小麥幼胚的溫度條件-10℃條件下可保存10天左右，小麥幼胚的再生率與未經(jīng)低溫儲(chǔ)藏的對照組小麥幼胚相比無顯著差異，而且實(shí)生芽率顯著降低；-5℃條件下可保存25天左右，特別是保存5～15天時(shí)，小麥幼胚的再生率與未經(jīng)低溫儲(chǔ)藏的對照組小麥幼胚相比更高，且顯著差異，同時(shí)實(shí)生芽率顯著降低。
文檔編號(hào)A01N3/00GK103155913SQ20131008749
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月19日
發(fā)明者葉興國, 王新敏, 王軻, 徐惠君, 杜麗璞, 林志珊, 張偉, 李欣 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所