專利名稱：花生耐漬澇的非共生血紅蛋白基因AhGLB及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種花生耐澇基因AhGLB，本發(fā)明還涉及所述花生耐澇基因的用途以及不同基因型花生受到不同脅迫處理時(shí)該基因的特異表達(dá)情況，揭示該基因的功能。
背景技術(shù)：
花生是我國(guó)主要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，是我國(guó)最具競(jìng)爭(zhēng)力的出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品。水分是影響植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝和生態(tài)地理分布的重要的生態(tài)因子之一。由水分造成的脅迫一般分為兩種，干旱脅迫和潰澇缺氧脅迫，兩者對(duì)植物生理生態(tài)造成的危害非常大。其中濕澇對(duì)世界花生產(chǎn)量影響頗深，在亞洲(尤其是東南亞)、南美洲花生產(chǎn)區(qū)濕澇與干旱往往交替發(fā)生，雨季明顯，是世界花生濕澇危害的重災(zāi)區(qū)。由于國(guó)內(nèi)外對(duì)花生的研究普遍注重于抗旱一方面，對(duì)花生潰澇危害的認(rèn)識(shí)不夠充分，花生潰澇研究無(wú)體系、不深入，整體上仍處于初始階段，而我國(guó)花生產(chǎn)區(qū)常分布于濕潤(rùn)、半濕潤(rùn)氣候區(qū)，旱澇往往交替發(fā)生，特別是南方產(chǎn)區(qū)澇害尤其明顯，其中長(zhǎng)江中下游地區(qū)的春澇、春夏連澇；華南產(chǎn)區(qū)的夏秋澇；以及平原花生區(qū)和華南稻田花生區(qū)潰澇等，都是澇害十分嚴(yán)重的受災(zāi)區(qū)，據(jù)預(yù)測(cè)，隨著全球氣候變暖，我國(guó)南方花生的濕澇問(wèn)題將更加突出，在花生的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，潰澇缺氧脅迫的影響不容忽視，它將影響花生對(duì)氧分和營(yíng)養(yǎng)的吸收，同時(shí)也會(huì)改變花生的農(nóng)藝性狀等。我國(guó)作為當(dāng)今世界花生生產(chǎn)、外貿(mào)第一大國(guó)，同時(shí) 作為潰澇嚴(yán)重受害國(guó)之一，對(duì)花生澇害防治研究亟待加強(qiáng)，但是，迄今為止除了對(duì)澇害或土壤過(guò)濕對(duì)花生產(chǎn)量的影響和化學(xué)調(diào)控研究以外，很少涉及內(nèi)部機(jī)理的深入研究，因此花生濕澇機(jī)理研究亟待開(kāi)展，當(dāng)下應(yīng)加強(qiáng)花生抗?jié)趁{迫的研究和治理，以推進(jìn)花生品種改良創(chuàng)新和指導(dǎo)生產(chǎn)，保證花生產(chǎn)業(yè)全面穩(wěn)定的發(fā)展。分子育種是運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)的科學(xué)性與先進(jìn)性，分離目的基因，構(gòu)建重組分子，將目的性狀基因?qū)胗牧嫉闹参锛?xì)胞中，達(dá)到培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗的新品種，且綜合性狀優(yōu)良的后代，育出新品種的目的。分子育種是從基因這個(gè)微觀水平予以改造和標(biāo)記，再在植株上進(jìn)行表達(dá)。非共生血紅蛋白近年來(lái)陸續(xù)在植物當(dāng)中被發(fā)現(xiàn)，研究表明非共生血紅蛋白基因能在低氧脅迫時(shí)，結(jié)合NO作用生成N03_，提升N03_在植物體當(dāng)中的濃度，滿足植物在潰澇缺氧脅迫下對(duì)N03_的需求，同時(shí)降低NO對(duì)植物造成的傷害，從而減輕潰澇低氧脅迫對(duì)植物體的傷害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供以下的技術(shù)方案:花生耐潰澇的非共生血紅蛋白基因AhGLB，其全序列為序列表SEQ ID NO:5所示?；ㄉ蜐车姆枪采t蛋白基因AhGLB的應(yīng)用，該基因的表達(dá)能夠提高花生抗?jié)趁{迫的能力。本發(fā)明還涉及利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)花生在不同處理?xiàng)l件下所述基因的表達(dá)量，包括如下步驟:設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物:AhGLB-RT-S和AhGLB_RT_AS，提取花生幼葉總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物與pMD_18連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)菌落PCR鑒定后，陽(yáng)性克隆大量擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，將取得的質(zhì)粒依次稀釋得到濃度梯度；利用羅氏熒光定量PCR軟件分析并計(jì)算出相關(guān)的線性方程，作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線；在Roche熒光定量PCR儀進(jìn)行待測(cè)樣品的熒光定量PCR，根據(jù)程序自動(dòng)給出的Ct值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出所測(cè)樣品的目的基因拷貝數(shù)。設(shè)計(jì)不同的處理方式:1)未處理花生不同組織中AhGLB基因的表達(dá)分析；2)不同基因型花生在氮誘導(dǎo)下AhGLB基因的表達(dá)分析；3)不同基因型花生在低氧脅迫下AhGLB基因的表達(dá)分析。本發(fā)明還涉及上述花生耐澇基因在構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)基因以及檢測(cè)花生耐潰澇狀況中的應(yīng)用，包括如下步驟:構(gòu)建AhGLB正義基因植物表達(dá)載體PRI101-AN-AhGLB，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌ΕΗΑ105，利用農(nóng)
桿菌侵染法轉(zhuǎn)化花生，經(jīng)篩選鑒定，獲得轉(zhuǎn)基因植株；設(shè)計(jì)潰澇缺氧脅迫處理，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因花生及對(duì)照根中AhGLB基因的表達(dá)量。本發(fā)明從分子生物學(xué)角 度，以花生為材料，從基因庫(kù)中挑選許多植物中的非共生血紅蛋白基因序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，獲得中間片段，再利用RACE技術(shù)擴(kuò)增出全長(zhǎng)cDNA片段，從花生中分離克隆得到AhGLB基因，通過(guò)BLAST分析得知該序列與其他植物中的非共生血紅蛋白序列相似性極高，并從熒光定量的水平研究了 AhGLB基因在花生不同部位、不同時(shí)間氮誘導(dǎo)、不同時(shí)間低氧脅迫下的表達(dá)量變化情況，以及潰澇缺氧脅迫下AhGLB基因在轉(zhuǎn)基因花生植株根中的表達(dá)情況，研究了花生非共生血紅蛋白基因在植物應(yīng)對(duì)潰澇缺氧脅迫下的作用。試驗(yàn)中證明分離克隆得到的AhGLB基因，與花生抗?jié)橙毖趺{迫存在相關(guān)性，并且獲得了潰澇低氧脅迫下各防御酶的生理特性變化情況，獲得了轉(zhuǎn)AhGLB基因花生抗?jié)持仓?，為最終完成花生抗?jié)橙毖趺{迫的轉(zhuǎn)基因研究和抗?jié)橙毖趺{迫新品種的培育奠定基礎(chǔ)?；ㄉ谑艿綕橙毖趺{迫時(shí)最主要的表現(xiàn)為氧分的供應(yīng)不足，也就是低氧脅迫，因此，花生中非共生血紅蛋白基因AhGLB與花生抗?jié)趁{迫相關(guān)，推測(cè)其表達(dá)可以提高花生抗?jié)趁{迫的能力。


圖1:花生AhGLB基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2:花生AhGLB基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量；圖3:花生AhGLB基因在低氧脅迫下的相對(duì)表達(dá)量(ZH8:中花8號(hào)，YH15:豫花15，XH2008:湘花 2008 ；G:根，Y =Bf )；圖4:花生AhGLB基因在氮誘導(dǎo)下根中的相對(duì)表達(dá)量，A圖為中花8號(hào)及對(duì)照，B圖為豫花15及對(duì)照，C圖為湘花2008及對(duì)照；圖5:花生AhGLB基因在氮誘導(dǎo)下葉中的相對(duì)表達(dá)量，A圖為中花8號(hào)及對(duì)照，B圖為豫花15及對(duì)照，C圖為湘花2008及對(duì)照；圖6:轉(zhuǎn)基因植株及對(duì)照在潰澇缺氧脅迫下根中AhGLB基因的表達(dá)量(T:轉(zhuǎn)基因花生植株；ck:非轉(zhuǎn)基因植株)；
具體實(shí)施方式
:實(shí)施例1:花生耐潰澇基因AhGLB的獲得1、花生組織總RNA的提取實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:所用器皿都需經(jīng)過(guò)特殊處理。耐高溫儀器用具150°C烘烤3小時(shí)，其他器皿用0.1 %的DEPC浸泡12小時(shí)，然后高壓滅菌去除DEPC。溶液試劑用0.1 %的DEPC處理(37°C放置12小時(shí)后高壓消毒)，不耐高溫的試劑直接用DEPC-H2O配制?？俁NA提取按TIANGEN的Trizol Reagent的操作要求，具體步驟如下:I)取花生幼嫩葉片在液氮中研磨成粉末后，每50mg組織加入I毫升Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%。2) 12000g，4°C離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移入一干凈離心管中，研磨液室溫放置5分鐘，上清液15-30°C靜置5分鐘。3)以用勻漿的Trizol試劑計(jì)，每ImL加入0.2mL的氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈搖晃15秒，15-30°C靜置2-3分鐘，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。4) 12000g，4°C離心15分鐘，此時(shí)樣品分為三層。上層水相約為用以勻漿的Trizol試劑體積的60%，將上層水相移入一干凈離心管。按每毫升Trizol液加0.5mL異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g，4 °C離心10分鐘。5)棄去上清液，以用勻衆(zhòng)Trizol試劑計(jì),每ImL加入至少I(mǎi)mL的75%乙醇,洗漆沉淀。渦旋混合，不超過(guò)5000g，4°C離心3分鐘。6)小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥2-3分鐘，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度，甚至RNA不溶。加入少量無(wú)RNase水(約40 μ L)充分溶解。7)電泳檢測(cè)總RNA的純度和亮度。整個(gè)操作過(guò)程始終戴口罩與手套操作,并頻繁更換手套,盡量避免RNase污染。2.單鏈cDNA合成,具體參照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒MML-V方法First strand cDNA合成試驗(yàn)操作方法:Microtube 管中(表 I):表I

權(quán)利要求
1.花生耐潰澇的非共生血紅蛋白基因AhGLB，其全序列為序列表SEQID NO :5所示。
2.花生耐潰澇的非共生血紅蛋白基因AhGLB的應(yīng)用，該基因的表達(dá)能夠提高花生抗?jié)?勞脅迫的能力。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種花生耐漬澇的非共生血紅蛋白基因AhGLB及其應(yīng)用，其全序列為序列表SEQ ID NO5所示。該基因在花生受到長(zhǎng)期陰雨或洪澇引起的漬澇缺氧脅迫時(shí)，能與NO結(jié)合生成NO3-，減輕漬澇危害，從而在花生遭受漬澇危害時(shí)發(fā)揮重要作用。此外，本發(fā)明還公開(kāi)了不同基因型花生受到不同脅迫處理時(shí)該基因特異表達(dá)情況，以及轉(zhuǎn)基因花生受到漬澇缺氧脅迫處理時(shí)該基因的表達(dá)情況，用于揭示該基因的功能。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103255147SQ20131008892
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月20日
發(fā)明者單世華, 李林, 張廷婷, 李春娟, 徐娟, 閆彩霞, 周西 申請(qǐng)人:山東省花生研究所