一種中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的保存實(shí)驗(yàn)方法
【專利摘要】本發(fā)明適用于獸醫(yī)生物制品保存【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的保存實(shí)驗(yàn)方法，所述方法包括下述步驟：對患中華絨螯蟹小核糖核酸病毒病的病蟹組織材料進(jìn)行三種不同方法的保存，然后對保存預(yù)定時(shí)間后的病蟹組織材料進(jìn)行過濾液的制備，采用注射病毒過濾液的人工感染健康蟹方式，通過蟹死亡率和平均死亡天數(shù)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析來評價(jià)三種保存方法的保存效果，從而獲取對中華絨螯蟹小核糖核酸病毒病的保存方式，為非發(fā)病季節(jié)對病毒材料進(jìn)行保存提供了有力的支持。
【專利說明】一種中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的保存實(shí)驗(yàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物制品保存【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的保存實(shí)驗(yàn)方法。
【背景技術(shù)】[0002]中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)小核糖核酸病毒病也稱為河蟹抖抖病、河蟹顫抖病以及河蟹環(huán)爪病，該病具有流行廣、危害大的特點(diǎn)，是造成河蟹大批死亡的主要病害之一，其主要癥狀表現(xiàn)為在疾病的充分發(fā)展期蟹的步足出現(xiàn)嚴(yán)重抖動(dòng)現(xiàn)象，臨近死亡或剛死亡時(shí)步足向其腹部方向成環(huán)抱的僵直狀態(tài)，該病的病因是由小核糖核酸病毒科病毒引起的。
[0003]對病毒病以及病原的深入研究，必須具有具毒力的病毒材料，對中華絨螯蟹小核糖核酸病毒病的深入研究也是如此。在尚無建立對該病毒敏感細(xì)胞株的當(dāng)今，獲得具毒力的病毒材料只能從自然發(fā)病的病蟹中采集或通過人工感染的方式在發(fā)病蟹中收集。由于該病的自然發(fā)病具有季節(jié)性，因而在非發(fā)病季節(jié)病料的獲得極為困難，人工感染獲得病毒材料十分費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，同時(shí)人工感染前需要有一定量的毒種。因此，在中華絨螯蟹的發(fā)病季節(jié)對病毒材料進(jìn)行保存成為非發(fā)病季節(jié)對病毒的研究的重要環(huán)節(jié)之一。
[0004]但是目前對病毒材料的保存沒有一種統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各種保存方式都有，各有各的優(yōu)點(diǎn)，不能提供一種操作簡便、保存時(shí)間長、保存量大、對中華絨螯蟹小核糖核酸病毒進(jìn)行有效保存的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的保存實(shí)驗(yàn)方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中目前對病毒材料的保存沒有一種統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各種保存方式都有，各有各的優(yōu)點(diǎn)，不能提供一種操作簡便、保存時(shí)間長、保存量大、對中華絨螯蟹小核糖核酸病毒進(jìn)行有效保存的方法的問題。
[0006]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的保存實(shí)驗(yàn)方法，所述保存實(shí)驗(yàn)方法包括下述步驟:
[0007](I)、對含有中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的病蟹進(jìn)行清洗消毒，然后對清洗消毒后的病蟹進(jìn)行組織解剖，得到病蟹的病毒組織材料；
[0008](2)、取部分所述病蟹的病毒組織材料分別保存于三種不同的保存環(huán)境中，分別為:袋裝密封于普通冰箱冷凍室、袋裝密封于低溫冰箱冷凍室和浸入50%甘油磷酸緩沖液中存放于普通冰箱冷藏室；
[0009](3)、根據(jù)預(yù)定的保存時(shí)間，分別取出保存在所述三種保存環(huán)境中的病蟹病毒組織材料，分別制備病蟹病毒過濾液，并將制備的病蟹病毒過濾液分別注射到對應(yīng)的健康蟹上，形成實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)，設(shè)置一對照組，對所述實(shí)驗(yàn)組和所述對照組分別進(jìn)行對照觀察；
[0010](4)、對健康蟹的死亡率和死亡天數(shù)通過標(biāo)準(zhǔn)差和F檢驗(yàn)的方式進(jìn)行評價(jià)，得到各種保存方式的差異性數(shù)據(jù)，確定不同保存方式的保存效果。
[0011]作為一種改進(jìn)，所述步驟(1)具體包括下述步驟:
[0012]病蟹用清水洗刷干凈后，分別用75%酒精棉球消毒蟹甲殼和步足的表面；
[0013]無菌操作打開甲殼，用滅過菌的剪刀、鑷子、解剖刀取出所有病蟹的肝胰腺、心臟、腹神經(jīng)節(jié)；
[0014]將病蟹上取出的組織混勻后，形成病蟹病毒組織材料。
[0015]作為一種改進(jìn)，所述步驟(3)具體包括下述步驟:
[0016]保存于50%甘油磷酸緩沖液中的病毒組織材料取出后，用無菌生理鹽水沖洗4~5次；
[0017]普通冰箱和低溫冰箱保存的病毒組織材料取出后在室溫下融化；
[0018]然后分別對上述三種實(shí)驗(yàn)病毒組織材料進(jìn)行稱重，并加入3倍于組織重量的無菌生理鹽水 ；
[0019]用滅菌的玻璃研磨管對病蟹組織進(jìn)行研磨，組織細(xì)胞充分破碎后，每分鐘2000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除蟹油以及大的顆粒物質(zhì)；
[0020]去除蟹油以及大的顆粒物質(zhì)后，進(jìn)行每分鐘7000轉(zhuǎn)低溫離心半小時(shí)；
[0021]取離心后的清液，用0.22 μ m孔徑大小的無菌微孔濾膜過濾；
[0022]使用滅菌針筒吸取過濾液從健康蟹第三步足基部注射到蟹的腹腔內(nèi)，每只健康蟹注射0.3ml ；
[0023]實(shí)驗(yàn)期間每天定時(shí)計(jì)數(shù)蟹的死亡數(shù)。
[0024]作為一種改進(jìn)，所述普通冰箱冷凍室的溫度為_16°C，所述低溫冰箱冷凍室的溫度為_74°C，所述普通冰箱冷藏室的溫度為2°C。
[0025]本發(fā)明實(shí)施例中，對患中華絨螯蟹小核糖核酸病毒病的病蟹組織材料進(jìn)行三種不同方法的保存，然后對保存預(yù)定時(shí)間后的病蟹組織材料進(jìn)行過濾液的制備，采用注射病毒過濾液的人工感染健康蟹方式，通過蟹死亡率和平均死亡天數(shù)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析來評價(jià)三種保存方法的保存效果，從而獲取對中華絨螯蟹小核糖核酸病毒病的保存方式，為非發(fā)病季節(jié)對病毒材料進(jìn)行保存提供了有力的支持。
【具體實(shí)施方式】
[0026]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0027]本發(fā)明實(shí)施例在于提供一種操作簡便、保存時(shí)間長、保存量大、對中華絨螯蟹小核糖核酸病毒進(jìn)行有效保存，能滿足該病在非發(fā)病季節(jié)進(jìn)行科學(xué)研究的中華絨螯蟹小核糖核酸病毒保存技術(shù)。
[0028]下述給出了中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的保存實(shí)驗(yàn)方法，其具體包括下述步驟:
[0029](I)、對含有中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的病蟹進(jìn)行清洗消毒，然后對清洗消毒后的病蟹進(jìn)行組織解剖，得到病蟹的病毒組織材料；
[0030](2)、取部分所述病蟹的病毒組織材料分別保存于三種不同的保存環(huán)境中，分別為:袋裝密封于普通冰箱冷凍室、袋裝密封于低溫冰箱冷凍室和浸入50%甘油磷酸緩沖液中存放于普通冰箱冷藏室；
[0031](3)、根據(jù)預(yù)定的保存時(shí)間，分別取出保存在所述三種保存環(huán)境中的病蟹病毒組織材料，分別制備病蟹病毒過濾液，并將制備的病蟹病毒過濾液分別注射到對應(yīng)的健康蟹上，形成實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)，設(shè)置一對照組，對所述實(shí)驗(yàn)組和所述對照組分別進(jìn)行對照觀察；
[0032](4)、對健康蟹的死亡率和死亡天數(shù)通過標(biāo)準(zhǔn)差和F檢驗(yàn)的方式進(jìn)行評價(jià)，得到各種保存方式的差異性數(shù)據(jù)，確定不同保存方式的保存效果。
[0033]其中，人工感染病毒后，用健康蟹的死亡率和平均死亡天數(shù)來評價(jià)病毒三種保存方法的保存效果。平均死亡天數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和F檢驗(yàn)等數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析按照薛仲三的方法進(jìn)行，F(xiàn)檢驗(yàn)值反映每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各個(gè)保存時(shí)間的病毒人工感染健康蟹后平均死亡天數(shù)之間的差異性，Q值反映每個(gè)實(shí)驗(yàn)組兩個(gè)保存時(shí)間的病毒經(jīng)人工感染健康蟹后平均死亡天數(shù)之間的差異性。 [0034]在該實(shí)施例中，步驟(1)具體包括下述步驟:
[0035]病蟹用清水洗刷干凈后，分別用75%酒精棉球消毒蟹甲殼和步足的表面；
[0036]無菌操作打開甲殼，用滅過菌的剪刀、鑷子、解剖刀取出所有病蟹的肝胰腺、心臟、腹神經(jīng)節(jié)；
[0037]將病蟹上取出的組織混勻后，形成病蟹病毒組織材料。
[0038]在本實(shí)施例中，上述步驟(3)具體包括下述步驟:
[0039]保存于50%甘油磷酸緩沖液中的病毒組織材料取出后，用無菌生理鹽水沖洗4~5次；
[0040]普通冰箱和低溫冰箱保存的病毒組織材料取出后在室溫下融化；
[0041]然后，分別對上述三種實(shí)驗(yàn)病毒組織材料進(jìn)行稱重，并加入3倍于組織重量的無菌生理鹽水；
[0042]用滅菌的玻璃研磨管對病蟹組織進(jìn)行研磨，組織細(xì)胞充分破碎后，每分鐘2000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除蟹油以及大的顆粒物質(zhì)；
[0043]去除蟹油以及大的顆粒物質(zhì)后，進(jìn)行每分鐘7000轉(zhuǎn)低溫離心半小時(shí)；
[0044]取離心后的清液，用0.22 μ m孔徑大小的無菌微孔濾膜過濾；
[0045]使用滅菌針筒吸取過濾液從健康蟹第三步足基部注射到蟹的腹腔內(nèi)，每只健康蟹注射0.3ml ；
[0046]實(shí)驗(yàn)期間每天定時(shí)計(jì)數(shù)蟹的死亡數(shù)。
[0047]其中，每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)對照組，對照組的健康蟹來源、大小、只數(shù)和室內(nèi)養(yǎng)殖等條件完全和試驗(yàn)組一樣，每只蟹注射0.3ml無菌生理鹽水。共觀察45天。對照組的蟹在45天試驗(yàn)期內(nèi)均成活并無異常情況。
[0048]當(dāng)然，普通冰箱冷凍室的溫度為-16°C，低溫冰箱冷凍室的溫度為-74V，普通冰箱冷藏室的溫度為2°C。
[0049]在本實(shí)施例中，三種保存方法中低溫冰箱冷凍(_74°C )保存的保存效果最好，其次是50%甘油磷酸緩沖液中冷藏(2°C )保存的方法，而普通冰箱冷凍(_16°C )保存的保存效果最差，它們的保存時(shí)間分別為29個(gè)月、14個(gè)月和10個(gè)月以內(nèi)時(shí)，病毒的毒力仍能保持。
[0050]為了便于說明，下述給出該三種保存方式的具體的事例進(jìn)行說明:[0051]事例一:病毒普通冰箱冷凍(_16°C )保存及其保存效果
[0052]病毒普通冰箱冷凍保存及其保存效果見表1和表2。
[0053]病毒保存時(shí)間5個(gè)月時(shí)和10個(gè)月時(shí)人工感染健康蟹的死亡率都為100%，但平均死亡天數(shù)分別為9.9和15.1天；而病毒保存時(shí)間為14個(gè)月時(shí)，蟹的死亡率明顯下降，為25 %，死亡蟹平均死亡天數(shù)為21.5天；18個(gè)月時(shí)，病毒失去毒力，被感染的健康蟹在45天的試驗(yàn)期內(nèi)全部存活。
[0054]對保存5個(gè)月、10個(gè)月、14個(gè)月平均死亡天數(shù)進(jìn)行F檢驗(yàn)，算得的F值為8.203 (表I)超過非常顯著臨界值6.36 (P = 0.01)，表明三種保存時(shí)間的病毒人工感染健康蟹平均死亡天數(shù)之間的差別非常顯著。表2顯示兩個(gè)保存時(shí)間的病毒人工感染健康蟹平均死亡天數(shù)之間的差異性。5個(gè)月和10個(gè)月病毒保存時(shí)間之間的蟹平均死亡天數(shù)差別接近顯著，因其Q值2.79接近顯著差異臨界值3.01 (P = 0.05) ; 10個(gè)月和14個(gè)月之間的差別顯著，其Q值3.44大于顯著差異臨界值3.01 (P = 0.05) ；5個(gè)月和14個(gè)月之間的差異非常顯著，其Q值6.23大于非常顯著臨界值4.84 (P = 0.01)。以上結(jié)果表明病毒在普通冰箱冷凍(_16°C )中保存的有效保存時(shí)間是在10個(gè)月以內(nèi)，此期間病毒的毒力仍能得到保持。
[0055]表1在普通冰箱(_16°C )中冷凍保存的不同保存時(shí)間病毒人工感染試驗(yàn)
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的保存實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述保存實(shí)驗(yàn)方法包括下述步驟: (1)、對含有中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的病蟹進(jìn)行清洗消毒，然后對清洗消毒后的病蟹進(jìn)行組織解剖，得到病蟹的病毒組織材料； (2)、取部分所述病蟹的病毒組織材料分別保存于三種不同的保存環(huán)境中，分別為:袋裝密封于普通冰箱冷凍室、袋裝密封于低溫冰箱冷凍室和浸入50%甘油磷酸緩沖液中存放于普通冰箱冷藏室； (3)、根據(jù)預(yù)定的保存時(shí)間，分別取出保存在所述三種保存環(huán)境中的病蟹病毒組織材料，分別制備病蟹病毒過濾液，并將制備的病蟹病毒過濾液分別注射到對應(yīng)的健康蟹上，形成實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)，設(shè)置一對照組，對所述實(shí)驗(yàn)組和所述對照組分別進(jìn)行對照觀察； (4)、對健康蟹的死亡率和死亡天數(shù)通過標(biāo)準(zhǔn)差和F檢驗(yàn)的方式進(jìn)行評價(jià)，得到各種保存方式的差異性數(shù)據(jù)，確定不同保存方式的保存效果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的保存實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述步驟(1)具體包括下述步驟: 病蟹用清水洗刷干凈后，分別用75%酒精棉球消毒蟹甲殼和步足的表面； 無菌操作打開甲殼，用滅過菌的剪刀、鑷子、解剖刀取出所有病蟹的肝胰腺、心臟、腹神經(jīng)節(jié)； 將病蟹上取出的組織混勻后，形成病蟹病毒組織材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的保存實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述步驟(3)具體包括下述步驟: 保存于50%甘油磷酸緩沖液中的病毒組織材料取出后，用無菌生理鹽水沖洗4~5次； 普通冰箱和低溫冰箱保存的病毒組織材料取出后在室溫下融化； 然后分別對上述三種實(shí)驗(yàn)病毒組織材料進(jìn)行稱重，并加入3倍于組織重量的無菌生理鹽水； 用滅菌的玻璃研磨管對病蟹組織進(jìn)行研磨，組織細(xì)胞充分破碎后，每分鐘2000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除蟹油以及大的顆粒物質(zhì)； 去除蟹油以及大的顆粒物質(zhì)后，進(jìn)行每分鐘7000轉(zhuǎn)低溫離心半小時(shí)； 取離心后的清液，用0.22 μ m孔徑大小的無菌微孔濾膜過濾； 使用滅菌針筒吸取過濾液從健康蟹第三步足基部注射到蟹的腹腔內(nèi)，每只健康蟹注射0.3ml ； 實(shí)驗(yàn)期間每天定時(shí)計(jì)數(shù)蟹的死亡數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的中華絨螯蟹小核糖核酸病毒的保存實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述普通冰箱冷凍室的溫度為_16°C，所述低溫冰箱冷凍室的溫度為_74°C，所述普通冰箱冷藏室的溫度為2°C。
【文檔編號】A01N1/02GK103583510SQ201310093185
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月22日
【發(fā)明者】朱光來 申請人:江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院