專利名稱：一種微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的規(guī)?；苽浞椒ǎ瑢儆谖⑸锛夹g和生物技術領域。
背景技術：
益生菌是活的微生物制劑，能夠改善宿主的競爭腸道粘膜的受體和提高機體免疫力來發(fā)揮功效。益生菌在腸道內可以產生半乳糖苷酶，能夠緩解乳糖不耐癥患者的癥狀。益生菌還具有抗腫瘤和抗突變的作用，還可以提高機體免疫力。所以益生菌在宿主內的存活和增殖能力對益生作用有重要影響，益生菌制品中的菌應該代謝穩(wěn)定，活性較強，通過上消化道后有大量存活，進入腸道后發(fā)揮益生作用。但是許多研究顯示，益生菌在加工和運輸過程中易失活；進入人或動物消化道后大多數(shù)難以經(jīng)受低PH值的胃酸、膽汁酸及胰液等的作用，難以有足夠的數(shù)量達到腸道或定居于腸道而發(fā)揮作用。為了解決益生菌在使用時存在的上述問題，利用微膠囊包埋技術保護益生菌成為目前國內外研究的熱點。所謂微膠囊技術，其實是指利用天然的或合成的高分子包囊材料，將固體的、液體的、甚至是氣體的微小囊核物質包覆形成為直徑在1-5000 μ m范圍內(通常是在5-400 μ m大小之間)的一種具有半透性或密封囊性的微型膠囊的技術。微膠囊包埋可以保護益生菌免受噬菌體的侵害，提高其在冷凍干燥過程中的存活率，增加貯存過程中的穩(wěn)定性。將益生菌用微膠囊技術包埋在壁材內，也可以降低外界環(huán)境對細胞的損傷，同時也可以實現(xiàn)益生菌細胞的重復多批次利用。應用于益生菌的微膠囊包埋技術可分為兩類:擠壓法和乳化法。這兩種方法都可以將益生菌的存活率提高80-95%。通過微膠囊技術制備的微生物制劑己被應用于農林種植業(yè)、畜牧水產養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生保健、食品和環(huán)境保護等各領域中。中國專利CN100563811C公開了一種微生物微膠囊大量制備的方法，該方法以海藻酸鈉、氯化鈣為微膠囊包被材料，對有益菌種進行單層包被成膜處理，得到具有單層包被膜的微膠囊。但通過該方 法形成的單層微膠囊的穩(wěn)定性不好，一方面是因為在有螯合劑(如乳酸、檸檬酸)存在時，螯合劑對鈣的親和性比海藻酸鈣強，此時海藻酸鈣非常不穩(wěn)定；同時單層包被處理的微膠囊在膜的形態(tài)穩(wěn)定性上依然無法滿足要求。中國專利CN100537759C公開了一種腸溶性多層包被益生菌微膠囊及其制備方法，該方法以海藻酸鈉、氯化鈣和殼聚糖為微膠囊包被材料，以乳酸菌或雙歧桿菌為囊心物制備益生菌微膠囊，其原理是利用海藻酸鈉與氯化鈣發(fā)生了離子交換形成海藻酸鈣包被，再利用海藻酸鈣與殼聚糖等電點不同使殼聚糖在海藻酸鈣表面形成二次的多層包被。但實際應用中發(fā)現(xiàn)，由于該方法適用于在菌體發(fā)酵后進行包被，是對發(fā)酵后大量且高密度的細胞的包被處理，但是對于一些需要在發(fā)酵前對于種子液進行包被處理的需求，由于待包被細胞的密度較低，導致微生物細胞本身對膠囊的機械性能的支撐性較差，使得采用該方法而形成的微膠囊在成膜性能尤其是膜的韌性依然存在一些欠缺，不僅形成的微膠囊的形態(tài)穩(wěn)定性不夠，導致其后續(xù)產品的運輸及保存性能受到較大影響，更有甚者部分會出現(xiàn)發(fā)酵處理后即發(fā)生變型甚至破損的現(xiàn)象，更加不適合于大規(guī)模的工業(yè)化運輸及利用。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是現(xiàn)有技術中對發(fā)酵后微生物的包被方法不適用于發(fā)酵前微生物包被處理的問題進而提供一種制備機械強度高，穩(wěn)定性好的微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的方法。本發(fā)明所要解決的第二個技術問題在于提供一種發(fā)酵形變小、機械強度高、易于保存的微生物多層微膠囊。為解決上述技術問題，本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:(I)單層微膠囊的制備:在無菌條件下，取無菌處理后的海藻酸鈉溶液，加入待包被處理的微生物種子液，混合均勻；并將上述得到的混合液混入經(jīng)無菌處理的氯化鈣溶液中，攪拌均勻并固化，濾出上清液，得到所需的單層微膠囊，并以無菌水清洗；(2)多層微膠囊的制備:將步驟(I)中得到的所述單層微膠囊加入殼聚糖酸性緩沖液中進行成膜反應，并通過補料使得所述殼聚糖溶液的濃度不斷上升，隨后濾出上清液，得到所需的多層微膠囊，并用無菌水清洗。本發(fā)明所述的方法可適用于現(xiàn)有技術中幾乎所有的微生物的包被之用，并優(yōu)選種子液處理至對數(shù)生長期的菌種。本發(fā)明所述的方法適用于各種現(xiàn)有技術中涉及的益生菌，具體可以包括但不限于乳酸菌、酵母菌等益生菌種。所述步驟(2)中，所述殼聚糖溶液的濃度以每分鐘0.1-0.2g/L的速率梯度上升。此處所述的梯度上升并不僅止于勻速的上升，事實上顯示，只要保證所述殼聚糖溶液的濃度以每分鐘0.1-0.2g/L的速率上升，無論是否勻速上升，對其機械性能和韌性的影響并不
大。 所述殼聚糖酸性緩沖液的初始濃度為l_2g/L以每分鐘0.1-0.2g/L的速率梯度上升至終濃度為5-6g/L。作為可以變換的實現(xiàn)方式，所述使殼聚糖濃度上升的步驟還可以通過其他補料的方式實現(xiàn)，具體可以包括但不限于:所述殼聚糖酸性緩沖液的初始濃度為l_2g/L，所述補料是指補入與原始添加體積相同的濃度為10-12g/L的殼聚糖溶液；所述殼聚糖酸性緩沖液的初始濃度為l_2g/L，所述補料是指以10-20ml/min的流速連續(xù)補入濃度為20-30g/L的殼聚糖溶液。事實上，在本發(fā)明所述的方案中，通過補料的方式使得所述殼聚糖溶液的濃度不斷上升即可以實現(xiàn)本發(fā)明增強成膜性能的目的，上述提供的三種可行性方案僅為研究中技術效果較佳的方式而已，任何本領域技術人員熟知的可操作的補料方式均可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。所述殼聚糖為脫乙酰度大于90%，分子量在40000左右的改性殼聚糖。鑒于殼聚糖的水溶解度較低，所述殼聚糖酸性緩沖液是將殼聚糖溶解于低濃度鹽酸、磷酸等緩沖液中配制得到的。 所述步驟(I)中，所述混合液是由高壓無菌空氣經(jīng)噴頭噴入所述氯化鈣溶液中的。所述混合液經(jīng)噴頭噴入所述氯化鈣溶液前，還包括經(jīng)過無菌濾膜過濾的步驟。
所述濾膜的孔徑小于0.22 μ m。所述高壓空氣的流速為4_8m3/h。所述噴頭為空心圓形滴狀噴頭。所述海藻酸鈉溶液的濃度為l_3g/L。所述氯化鈣溶液的濃度為0.1-0.3mol/L。本發(fā)明還提供了應用上述制備方法制備得到的多層微膠囊。殼聚糖又名脫乙酰甲殼素、可溶性甲殼素和甲殼胺等，化學名稱為(1，4)-2-氨基_2_脫氧-D-葡萄糖，分子式為(C6H11NO4) n。甲殼素(β - (I，4) -2-乙酰氨基-2_脫氧-D-葡聚糖)在自然界的資源非常豐富，廣泛存在于蟹、蝦等低等動物以及藻類、真菌等低等植物中，是一種天然高分子。將甲殼素在堿性條件下加熱，脫去N-乙?；罂缮蓺ぞ厶恰ぞ厶鞘巧锝缰形┮坏囊环N堿性多糖，它是白色、無定型、半透明、略有珍珠光澤的固體，可溶于稀的鹽酸、硝酸、醋酸等無機酸和大多數(shù)有機酸，但不溶于稀硫酸和稀磷酸。影響殼聚糖溶解的主要因素有脫乙酰度、殼聚糖的相對分子質量、酸的種類等。鑒于殼聚糖自身性能的局限性，人們對其進行了改性研究，通過控制反應條件在殼聚糖上引入其他基團來改變其理化性質。本發(fā)明所用的脫乙酰度大于90%，分子量在40000左右的殼聚糖即為改性殼聚糖，其溶解性要好于未改性的殼聚糖。本發(fā)明所述的改性殼聚糖可以根據(jù)現(xiàn)有技術中公開的改性方法進行操作，下述實施例中所述的改性殼聚糖是采用醇溶法對殼聚糖進行脫乙酰改性而得到的，改性步驟如下:稱取殼聚糖5.0g于錐形瓶中，加入45%的NaOH現(xiàn)配溶液中，加入無水乙醇(乙醇與NaOH的體積比為1:1)。將錐形瓶置于恒溫水浴中，90°C下反應2h，水沖洗至中性，然后用無水醇脫水，干燥保存即 可。對制備得到的多層微膠囊性能進行研究，根據(jù)微膠囊在發(fā)酵前后的體積膨脹率Sw與膜強度成反比的關系，采用Sw表征微膠囊的膜強度，如下方程式計算:Sff= [ (Df/D0)3-1] X100%其中，Sw(% )為微膠囊膨脹率；D。為微囊化酵母菌發(fā)酵前微膠囊直徑；Df為微囊化酵母菌發(fā)酵后微膠囊直徑。本發(fā)明的上述技術方案相比現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點:(I)本發(fā)明所述的微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法，在進行二次包被時，使用濃度逐漸增大的殼聚糖溶液進行包被，上述工藝特點是先采用低濃度殼聚糖成膜，此時殼聚糖量少，幾乎所有殼聚糖分子都能夠與海藻酸鈣凝膠發(fā)生聚電解質絡合反應，因此，殼聚糖分子的排布更為清晰有層次，更容易形成的縝密且韌性較好的膜，隨著殼聚糖濃度的增加，形成的膜從整齊均勻性轉而向厚度及機械性能發(fā)展，形成的膜越來越厚，膜的機械強度也隨之提高。此外，本工藝另一特點是可以更方便的實現(xiàn)殼聚糖溶解所需緩沖液的重復利用，從而降低生產成本；(2)研究發(fā)現(xiàn)，當多層包被處理時，所述殼聚糖溶液的濃度以每分鐘0.01-0.02g/L的速率梯度上升時，所制備得到的微膠囊的機械性能較好，形變較??；(3)當多層包被處理時，當所述殼聚糖酸性緩沖液的初始濃度為0.1-0.2g/L并經(jīng)梯度上升，得到的膜的性能較優(yōu)，但當殼聚糖終濃度升至5-6g/L以上時，得到的微膠囊的機械性能最好，形變最小，隨著殼聚糖濃度的進一步上升，對成膜性能的影響變化不大；(4)本發(fā)明所述的微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法，利用脫乙酰度大于90%的改性殼聚糖進行二次包被；所述改性殼聚糖的溶解性較好，從而可以與海藻酸鈉更好地絡合，進一步提高微膠囊的強度和成膜性能；(5)本發(fā)明采用高壓無菌空氣擠壓噴入的方法具有成本低廉，設備構造簡單，易于與發(fā)酵罐體結合等優(yōu)點，因此更適合于大批量規(guī)?；a微膠囊；(6)本發(fā)明所用的殼聚糖材料具有良好的益生性能，可以在禽類養(yǎng)殖過程中控制脂肪沉積量，改善腸道菌群環(huán)境，及在家畜養(yǎng)殖中促進動物增重、降低血液及肌肉組織中的膽固醇含量、提高動物免疫力等的作用；得到的所述微生物多層微膠囊可進行后續(xù)的發(fā)酵及產品化處理，進行發(fā)酵后過濾分離得到的濕產品具有良好的流動性和分散性，所用的殼聚糖材料可以促進魚類生長，改善腸道菌群環(huán)境和提高魚類免疫力等，非常適合水產領域搶食性魚類飼養(yǎng)；而得到的濕產品經(jīng)過干燥后，得到的干產品可以用于飼料加工和畜牧養(yǎng)殖行業(yè)，具有良好的穩(wěn)定性；體內應用時能防止胃液的破壞，從而使盡可能多的益生菌菌體到達腸道，起到保健和治療的作用；(7)本發(fā)明所述的多層微膠囊經(jīng)發(fā)酵后得到的產品具有良好的流動性和分散性，可以有效防止微生物細胞失活，同時所得的微膠囊韌性良好，可有效保證運輸及使用過程中的完整性，產品的穩(wěn)定性較好。


為了使本發(fā)明的內容更容易被清楚的理解，下面結合附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中，圖I是本發(fā)明實施例2所述酵母菌雙層微膠囊發(fā)酵前的示意圖；圖2是本發(fā)明實 施例2所述酵母菌雙層微膠囊發(fā)酵后的示意圖；圖3是本發(fā)明實施例10所述酵母菌雙層微膠囊發(fā)酵前的示意圖；圖4是本發(fā)明實施例10所述酵母菌雙層微膠囊發(fā)酵后的示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明所述的方法適用于各種微生物的包被之用，下述各實施例中均以酵母菌株的發(fā)酵種子液為包被種子液，具體包括配制YPD種子液酵母膏3. 85g/L,蛋白胨3g/L,葡萄糖10g/L, 28°C, 180rpm恒溫培養(yǎng)20-24h至對數(shù)生長期時結束培養(yǎng)，備用，種子液無需經(jīng)過處理而可以直接進行包被處理。海藻酸鈉膠液的配制在不斷攪拌下按照最終濃度為l_3g/L的濃度，分批次加入海藻酸鈉入去離子水中，制成透明膠液，115°C下滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆?。氯化鈣溶液配制用蒸餾水配成O. 1-0. 3mol/L溶液，115°C下滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆?。殼聚糖初始溶液的配制按照終濃度l_2g/L的濃度分批次將所述改性后的殼聚糖加入至酸性緩沖溶液中不斷攪拌至溶解，備用。所述酸性緩沖液以12ml冰醋酸和9g醋酸鈉定容至IOOOml得到，自然pH。
本發(fā)明所述得到的雙層包被微膠囊適用于各種可行性的發(fā)酵液培養(yǎng)之用，為了闡述方便，下述各實施例中將得到的雙層包被的微膠囊發(fā)酵處理的培養(yǎng)基均與發(fā)酵種子液相同的Yro培養(yǎng)基。實施例I本實施例所述的酵母菌雙層微膠囊是通過如下步驟制備得到的(I)單層微膠囊的制備在無菌條件下，取無菌處理后的濃度為lg/L海藻酸鈉溶液，加入待包被處理的對數(shù)生長期的酵母種子液，混合均勻，至106cfu/ml左右密度；并將上述得到的混合液用直徑為小于O. 22 μ m的無菌濾膜過濾后用流速為4m3/h的高壓空氣擠壓經(jīng)空心圓形滴狀噴頭噴入經(jīng)無菌處理的濃度為O. lmol/L氯化鈣溶液中，慢速攪拌均勻并固化20min，濾出上清液，得到所需的單層微膠囊，并以無菌水清洗；(2)雙層微膠囊的制備將步驟(I)中得到的所述單層微膠囊加入初始濃度為Ig/L殼聚糖酸性緩沖液中進行成膜反應，并以10g/L的同樣的殼聚糖酸性溶液進行補料，通過濃度檢測裝置，在線檢測發(fā)酵罐中殼聚糖的濃度，并通過補料使得所述殼聚糖溶液的濃度以每分鐘O. 2g/L的速率梯度上升，直至終濃度為6g/L時停止補料，繼續(xù)固化反應5-10min，隨后濾出上清液，得到所需的直徑為300-700 μ m的多層微膠囊，并用無菌水清洗。包被后培養(yǎng)將得到的所述包有酵母細胞的雙層微膠囊接入前述YPD發(fā)酵液中，28 V，150rpm恒溫培養(yǎng)16h左右至對數(shù)生長末期，過濾分離的到發(fā)酵后的雙層微膠囊的濕產品，該發(fā)酵后得到的濕產品可直接作為添加肥料用于水產養(yǎng)殖業(yè)。對益生菌雙層微膠囊濕產品進行流化床干燥，得到益生菌雙層微膠囊干產品，可用于飼料加工和畜牧養(yǎng)殖行業(yè)。實施例2本實施例所述 的酵母菌雙層微膠囊是通過如下步驟制備得到的(I)單層微膠囊的制備在無菌條件下，取無菌處理后的濃度為3g/L海藻酸鈉溶液，加入待包被處理的酵母種子液，混合均勻，至106cfu/ml左右密度；并將上述得到的混合液用直徑小于O. 22 μ m的無菌濾膜過濾后用流速為6m3/h的高壓空氣經(jīng)空心圓形滴狀噴頭噴入經(jīng)無菌處理的濃度為O. 3mol/L氯化鈣溶液中，慢速攪拌均勻并固化20min，濾出上清液，得到所需的單層微膠囊，并以無菌水清洗；(2)雙層微膠囊的制備將步驟(I)中得到的所述單層微膠囊加入初始濃度為2g/L脫乙酰度大于90%，分子量在40000左右的改性殼聚糖酸性緩沖液中進行成膜反應，并以8g/L的同樣的殼聚糖酸性溶液補料，通過在線監(jiān)測補料使得所述改性殼聚糖溶液的濃度以每分鐘O. lg/L的速率梯度上升至5g/L時停止補料，繼續(xù)固化反應5-10min，隨后濾出上清液，得到所需的直徑為300-700 μ m的雙層微膠囊，并用無菌水清洗。包被后培養(yǎng)將得到的所述雙層微膠囊接入YPD發(fā)酵液中，280C，150rpm恒溫培養(yǎng)16h左右至對數(shù)生長末期，過濾分離得到發(fā)酵后的雙層微膠囊的濕產品，并通過顯微鏡觀察所述雙層微膠囊在發(fā)酵前后的形態(tài)變化，具體如圖I和2所示。發(fā)酵后得到的濕產品，可用于水產養(yǎng)殖業(yè)。對益生菌雙層微膠囊濕產品進行流化床干燥，得到益生菌雙層微膠囊干產品，可用于飼料加工和畜牧養(yǎng)殖行業(yè)。實施例3本實施例所述的酵母菌雙層微膠囊是通過如下步驟制備得到的
(I)單層微膠囊的制備在無菌條件下，取無菌處理后的濃度為lg/L海藻酸鈉溶液，加入待包被處理的酵母種子液，混合均勻；并將上述得到的混合液用直徑為小于
O.22 μ m的無菌濾膜過濾后用流速為4m3/h的高壓空氣經(jīng)空心圓形滴狀噴頭噴入經(jīng)無菌處理的濃度為O. lmol/L氯化鈣溶液中，攪拌均勻并固化，濾出上清液，得到所需的單層微膠囊，并以無菌水清洗；(2)雙層微膠囊的制備將步驟(I)中得到的所述單層微膠囊加入初始濃度為3g/L殼聚糖酸性緩沖液中進行成膜反應，并以9g/L的同樣的殼聚糖酸性溶液補料使得所述殼聚糖溶液的濃度以每分鐘O. 05g/L的速率梯度上升至4g/L，隨后濾出上清液，得到所需的雙層微膠囊，并用無菌水清洗。將上述得到的雙層微膠囊經(jīng)前述Yro培養(yǎng)基發(fā)酵，得到發(fā)酵后的濕產品，可用于
水產養(yǎng)殖業(yè)。對益生菌雙層微膠囊濕產品進行流化床干燥，得到益生菌雙層微膠囊干產品，可用于飼料加工和畜牧養(yǎng)殖行業(yè)。實施例4本實施例所述的酵母菌雙層微膠囊是通過如下步驟制備得到的(I)單層微膠囊的制備在無菌條件下，取無菌處理后的濃度為lg/L海藻酸鈉溶液，加入待包被處理的酵母種子液，混合均勻；并將上述得到的混合液用直徑為小于
O.22 μ m的無菌濾膜過濾后用流速為4m3/h的高壓空氣經(jīng)空心圓形滴狀噴頭噴入經(jīng)無菌處理的濃度為O. lmol/L氯化鈣溶液中，攪拌均勻并固化，濾出上清液，得到所需的單層微膠囊，并以無菌水清洗； (2)雙層微膠囊的制備將步驟(I)中得到的所述單層微膠囊加入初始濃度為Ig/L的殼聚糖酸性緩沖液中進行成膜反應，并以20ml/min的補料速率連續(xù)流加濃度為20g/L的同樣的殼聚糖酸性溶液進行補料，固化反應結束后濾出上清液，得到所需的雙層微膠囊，并用無菌水清洗。將上述得到的雙層微膠囊經(jīng)Yro培養(yǎng)基發(fā)酵，得到發(fā)酵后的濕產品，可用于水產
養(yǎng)殖業(yè)。對益生菌雙層微膠囊濕產品進行流化床干燥，得到益生菌雙層微膠囊干產品，可用于飼料加工和畜牧養(yǎng)殖行業(yè)。實施例5本實施例的制備過程同實施例4，其區(qū)別僅在與步驟(2)中，所述殼聚糖酸性溶液的初始濃度為2g/L，并以10ml/min的補料速率連續(xù)流加濃度為30g/L的同樣的殼聚糖酸性溶液進行補料，得到所需的多層微膠囊。實施例6本實施例的制備過程同實施例4，其區(qū)別僅在與步驟(2)中，所述殼聚糖酸性溶液的初始濃度為O. 7g/L，并以30ml/min的補料速率連續(xù)流加濃度為10g/L的同樣的殼聚糖酸性溶液進行補料，得到所需的多層微膠囊。實施例7本實施例所述的酵母菌雙層微膠囊是通過如下步驟制備得到的(I)單層微膠囊的制備在無菌條件下，取無菌處理后的濃度為lg/L海藻酸鈉溶液，加入待包被處理的酵母種子液，混合均勻；并將上述得到的混合液用直徑為小于
O.22 μ m的無菌濾膜過濾后用流速為4m3/h的高壓空氣經(jīng)空心圓形滴狀噴頭噴入經(jīng)無菌處理的濃度為O. lmol/L氯化鈣溶液中，攪拌均勻并固化，濾出上清液，得到所需的單層微膠囊，并以無菌水清洗；(2)雙層微膠囊的制備將步驟(I)中得到的所述單層微膠囊加入初始濃度為Ig/L的反應體積為2L的殼聚糖酸性緩沖液中進行成膜反應，并在整個固化過程中以濃度為12g/L的同樣的殼聚糖酸性溶液2L進行補料至固化反應結束，隨后濾出上清液，得到所需的雙層微膠囊，并用無菌水清洗。將上述得到的雙層微膠囊經(jīng)Yro培養(yǎng)基發(fā)酵，得到發(fā)酵后的濕產品，可用于水產
養(yǎng)殖業(yè)。對益生菌雙層微膠囊濕產品進行流化床干燥，得到益生菌雙層微膠囊干產品，可用于飼料加工和畜牧養(yǎng)殖行業(yè)。實施例8本實施例的制備過程同實施例7，其區(qū)別僅在與步驟(2)中，所述殼聚糖酸性溶液的初始濃度為2g/L，并以濃度為10g/L的同樣的殼聚糖酸性溶液進行補料，得到所需的多層微膠囊。實施例9本實施例的制備過程同實施例7，其區(qū)別僅在與步驟(2)中，所述殼聚糖酸性溶液的初始濃度為3g/L，并以濃度為8g/L的同樣的殼聚糖酸性溶液進行補料，得到所需的多層
微膠囊。 實施例10本實施例所述的酵母菌雙層微膠囊是通過如下步驟制備得到的(I)單層微膠囊的制備在無菌條件下，取無菌處理后的濃度為2g/L海藻酸鈉溶液，加入待包被處理的微生物種子液，混合均勻；并將上述得到的混合液用直徑小于
O.22 μ m的無菌濾膜過濾后用流速為8m3/h的高壓空氣經(jīng)空心圓形滴狀噴頭噴入經(jīng)無菌處理的濃度為O. 2mol/L氯化鈣溶液中，攪拌均勻并固化，濾出上清液，得到所需的單層微膠囊，并以無菌水清洗；(2)雙層微膠囊的制備將步驟(I)中得到的所述單層微膠囊加入濃度為5. 5g/L殼聚糖酸性緩沖液中進行成膜反應35-40min，隨后濾出上清液，得到所需的雙層微膠囊，并用無菌水清洗。將包有酵母細胞的雙層微膠囊接入發(fā)酵液中，28°C，150rpm恒溫培養(yǎng)16h左右，過濾分離的到發(fā)酵后的雙層微膠囊，并通過顯微鏡觀察所述雙層微膠囊在發(fā)酵前后的形態(tài)變化，具體如圖3和4所示。實施例11雙層微膠囊的性能研究在顯微鏡下分別測量上述實施例1-5中所得到的的雙層包被微膠囊在發(fā)酵前后的膠囊直徑，并計算各個微膠囊在發(fā)酵前后的體積膨脹率，具體數(shù)據(jù)見下表。
權利要求
1.一種微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)單層微膠囊的制備:在無菌條件下，取無菌處理后的海藻酸鈉溶液，加入待包被處理的微生物種子液，混合均勻；并將上述得到的混合液混入經(jīng)無菌處理的氯化鈣溶液中，攪拌均勻并固化，濾出上清液，得到所需的單層微膠囊，并以無菌水清洗； (2)多層微膠囊的制備:將步驟(I)中得到的所述單層微膠囊加入殼聚糖酸性緩沖液中進行成膜反應，并通過補料使得所述殼聚糖溶液的濃度不斷上升，反應結束后濾出上清液，得到所需的多層微膠囊，清洗，即得。
2.根據(jù)權利要求1所述的微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述殼聚糖酸性緩沖液的初始濃度為l_2g/L，并以每分鐘0.1-0.2g/L的速率梯度上升至終濃度為5-6g/L。
3.根據(jù)權利要求1所述的微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖酸性緩沖液的初始濃度為l_2g/L，所述補料是指補入與原始添加體積相同的濃度為10-12g/L的殼聚糖溶液。
4.根據(jù)權利要求1所述的微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖酸性緩沖液的初始濃度為l-2g/L,所述補料是指以10-20ml/min的流速連續(xù)補入濃度為20-30g/L的殼聚糖溶液。
5.根據(jù)權利要求1-4任一所述的微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖為脫乙酰度大于90%，分子量在40000左右的改性殼聚糖。
6.根據(jù)權利要求1-5任一所述的微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中，所述混合液是由高壓無菌空氣經(jīng)噴頭噴入所述氯化鈣溶液中的。
7.根據(jù)權利要求6所述的微 生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法，其特征在于，所述混合液經(jīng)噴頭噴入所述氯化鈣溶液前，還包括經(jīng)過無菌濾膜過濾的步驟。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法，其特征在于，所述高壓空氣的流速為4-8m3/h。
9.根據(jù)權利要求8所述的微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法，其特征在于，所述噴頭為空心圓形滴狀噴頭。
10.根據(jù)權利要求1-9任一所述的微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法，其特征在于，所述海藻酸鈉溶液的濃度為l_3g/L。
11.根據(jù)權利要求10所述的微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的制備方法，其特征在于，所述氯化鈣溶液的濃度為0.1-0.3mol/L。
12.根據(jù)權利要求1-11任一所述的方法制備得到的多層微膠囊。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵前包被多層微膠囊的規(guī)模化制備方法，屬于微生物技術和生物技術領域。本發(fā)明所述的多層微膠囊的規(guī)?；苽浞椒ǎ院Ｔ逅徕c、氯化鈣和脫乙酰度大于90%，分子量在40000左右的改性殼聚糖為微膠囊的包被材料，包括如下步驟(1)單層微膠囊的制備(2)多層微膠囊的制備。在進行二次包被時，先采用低濃度殼聚糖成膜，此時，殼聚糖量少，幾乎所有殼聚糖分子都能夠與海藻酸鈣凝膠發(fā)生聚電解質絡合反應，因此，更容易形成的縝密且韌性較好的膜，隨著殼聚糖濃度的增加，形成的膜越來越厚，膜的機械強度也隨之提高。此外，本工藝可以更方便的實現(xiàn)殼聚糖溶解所需緩沖液的重復利用，從而降低生產成本。
文檔編號A23K1/00GK103222539SQ201310121179
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月9日 優(yōu)先權日2013年4月9日
發(fā)明者魏永剛, 楊祿良, 陳守慧, 張冬梅 申請人:魏永剛