專利名稱：一種蝴蝶蘭防褐化組培方法及防褐化培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地說是一種蝴蝶蘭防褐化組培方法及防
褐化培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
外植體褐變是植物組織培養(yǎng)中遇到的重要問題。有研究表明，導(dǎo)致褐化的主要原因是由多酚氧化酶作用于天然底物酚類物質(zhì)形成醌而引起的，通過加入抗氧化劑和吸附劑可較好地控制褐化現(xiàn)象發(fā)生。針對這些產(chǎn)生褐化的原因，早前有研究表明活性炭是能夠起到防褐化的作用的，因為活性炭防褐化用的原理是活性炭的吸附作用，而活性炭本身吸附作用是有限的，也就是說每瓶中我們不可能加入大量的活性炭，所以小量的活性炭的吸附作用是比較小的，一旦吸附的有害成分達到飽和，基本上就沒有功效了，因此在培養(yǎng)過程中需更換新鮮培養(yǎng)基，而植物的生長發(fā)育是連續(xù)的過程，對培養(yǎng)的內(nèi)在小環(huán)境是有嚴格要求的，頻繁更換培養(yǎng)基不利于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分產(chǎn)生作用，且在轉(zhuǎn)接過程中存在著污染的風(fēng)險，高頻率的轉(zhuǎn)接會加大污染死亡的機率，也就說活性炭防褐化的作用有嚴重的缺陷。隨后又有研究表明光照對初代培養(yǎng)的褐化是有影響的，結(jié)果表明，IOOOlx和30001X光強培養(yǎng)可降低褐化率，20001x光強培養(yǎng)的外植體褐化嚴重，差異顯著。不難發(fā)現(xiàn)這些方法存在著一定的缺陷和不全面性且不環(huán)保，對于整個培養(yǎng)階段的防褐化和一個比較系統(tǒng)的防褐化方法的研究還是甚少。蝴蝶蘭又名蝶蘭(Phalaenopsisamabilis),蘭科(Orchidaceae)蝶蘭屬(Phalaenopsis)多年生附生草本植物，有著“洋蘭皇后”之稱的蝴蝶蘭，由于其花形如彩蝶飛舞，色彩艷麗，體態(tài)輕盈、飄逸，在國內(nèi)外花卉市場上極受歡迎，一直都是消費者的寵兒。而且蝴蝶蘭除了盆栽之外，還 特別適宜用作切花，是藝術(shù)插花的高檔花材?！癡31”是蝴蝶蘭紅花系列的一個品種，以超長的花梗長度，良好的花序排列，中庸的花形及花色，特別的花朵圖案，博得廣大生產(chǎn)者及消費者的歡迎，多年以來一直受到追捧，是蝴蝶蘭中的佼佼者。但是蘭科植物在組織培養(yǎng)過程中的褐化問題是多發(fā)的常見的，幾乎不可避免，褐化會導(dǎo)致植株的死亡，也就是培養(yǎng)中的植物不能繼續(xù)進行培養(yǎng)，所以防止褐化是在蘭科植物組織培養(yǎng)中要極力解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蝴蝶蘭防褐化組培方法，通過該方法可以對蝴蝶蘭組織培養(yǎng)過程出現(xiàn)的褐化問題進行改善，提高存活率，增加健康的組培苗數(shù)量從而增加最終
的產(chǎn)量。本發(fā)明的目的還在于提供提供一種植物防褐化組織培養(yǎng)基；該培養(yǎng)基可以對植物組培過程中出現(xiàn)的褐化問題得到顯著改善。本發(fā)明解決技術(shù)問題采用如下方案:
一種植物防褐化組培培養(yǎng)基，其特點在于，各階段培養(yǎng)基由如下組分組成:(I)初代培養(yǎng)基每升MS基本培養(yǎng)基中添加6-BA 8.0 mg、NAA 0.5 mg、金盞花提取液175 mg、瓊脂8 g、蔗糖30 g，培養(yǎng)基pH=5.6;或每升N6基本培養(yǎng)基中添加6-BA 8.0 mg、NAA 0.5 mg、朽1檬提取液150 mg、瓊脂8 g、鹿糖30 g,培養(yǎng)基pH=5.6 ;或每升MS基本培養(yǎng)基中添加6-BA 8.0 mg、NAA 0.5 mg、西紅柿提取液300 mg、瓊月旨8 g、蔗糖30 g，培養(yǎng)基pH=5.6 ;或每升MS基本培養(yǎng)基中添加BA 8.0 mg、NAA 0.5 mg、迷迭香提取液110 mg、瓊脂8 g、鹿糖30 g,培養(yǎng)基pH=5.6;
(2)增殖分化培養(yǎng)基每升B5基本培養(yǎng)基中添加6-BA 8.0 mg、NAA 0.5、金盞花提取液175 mg椰汁150g、瓊脂8 g、蔗糖30 g、培養(yǎng)基ρΗ=5.6 ;或每升Ν6基本培養(yǎng)基中添加+6-ΒΑ 8.0 mg、NAA 0.5 mg、朽1檬提取液150 mg、椰汁150g、瓊脂8 g、蔗糖30 g，培養(yǎng)基pH=5.6 ;或MS基本培養(yǎng)基中添加6-BA 8.0 mg、NAA 0.5 mg、西紅柿提取液300 mg、椰汁150g、瓊脂8 g、蔗糖30 g，培養(yǎng)基pH=5.6 ;或MS基本培養(yǎng)基中添加6-BA 8.0 mg、NAA 0.5 mg、迷迭香提取液110 mg、椰汁150g、瓊脂8 g、蔗糖30 g、培養(yǎng)基pH=5.6。本發(fā)明同時提供一種蝴蝶蘭防褐化組培方法，包括外植體消毒、初代培養(yǎng)和增殖分化培養(yǎng)，生根培養(yǎng)、煉苗和移栽，其特點在于，所述初代培養(yǎng)是指:將消毒處理的外植體接入權(quán)利要求1所述的初代培養(yǎng)基上，25±1°C、光照1500-2000LX ;光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)5-6周；所述增殖分化培養(yǎng)是指:將初代培養(yǎng)后的沒有發(fā)生褐化的組織接入權(quán)利要求1所述的增殖分化培養(yǎng)基，25±1°C、光照1500-2000LX ;光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)至分化出幼苗。所述生根培養(yǎng)是指:將增殖分化培養(yǎng)后的苗高2 cm的無根小苗，按每瓶I株，接種于MS + 6-BA 1.0mg/L + NAA 0.2 mg/L +瓊脂8 g/L+蔗糖30 g/L培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2周。所述煉苗是指:將生根培養(yǎng)后的成苗每隔25-30天重新轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，如此反復(fù)2-3次；將壯苗后的成苗瓶口打開，在培養(yǎng)室半遮光放置2-3日，期間適時補充水分，使組培苗逐步適應(yīng)外界環(huán)境，達到煉苗的目的。所述移栽是指:將消毒處理過的水苔用清水浸泡，然后用脫水機脫去水苔中多余的水分至水苔手緊握無水滴產(chǎn)生，待用；移栽時將苗的根系分開呈散射狀，中間填充水苔，再用水苔包裹整個根系，然后將苗根部浸入營養(yǎng)液中，待水苔吸收營養(yǎng)液后再進行包苗，移栽。所述外植體消毒是指:
從植株上剪下當(dāng)年生嫩葉，自來水沖去泥沙，洗滌液浸泡10 min并除去表面污垢，自來水沖洗3h，置于超凈工作臺上:體積濃度75%的酒精溶液浸泡35s，之后無菌水沖洗3次，再用體積濃度0.2%的HgCl2溶液浸泡5-7min，無菌水沖洗8次，之后用500 mg/LPVP浸泡4-8 min轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，吸干附著水分等待接入初代培養(yǎng)基。本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點或效果:1.本發(fā)明采用天然添加物金盞花和檸檬作為添加劑加入培養(yǎng)基中，是第一次將天然物質(zhì)加入培養(yǎng)基中起到防褐化的作用，與傳統(tǒng)的化學(xué)試劑和活性炭相比較，這些天然物質(zhì)天然純凈，綠色環(huán)保，利用添加物自身所含有益物質(zhì)起到防褐化的作用。2.本發(fā)明采用幾種不同的基本培養(yǎng)基與天然添加劑組合，找到了最優(yōu)化的防褐化的組合方案，且方案不唯一，可以有多種選擇，為今后蝴蝶蘭組培過程中的防褐化提供思路和解決辦法。4.本發(fā)明在最后階段，待組培苗長勢穩(wěn)定后接入不加防褐化試劑的培養(yǎng)基中正常生根，極少發(fā)生褐化，起到節(jié)約成本的目的。5.本發(fā)明在初代和增殖過程都能起到防止褐化的作用，與傳統(tǒng)方法相比更全面，從各個階段解決防褐化的問題，因而提高組培苗的成活率和質(zhì)量，同時對組培苗自身的生長起到一定的促進作用，可以得到大量的優(yōu)質(zhì)成苗。6.本發(fā)明中的組培苗褐化率低,營養(yǎng)健康,溫光合理,長勢旺盛。
具體實施方式
以下通過具體實施例對本發(fā)明技術(shù)方案做進一步說明。以下實施例MS培養(yǎng)基配方:每升培養(yǎng)基中含KNO3 (1900 mg/L), NH4NO3 (1650mg/L), MgSO4.7H20 (370 mg/L), KH2PO4 (170 mg/L), CaCl2 (330 mg/L), KI (0.83 mg/L),H3BO3 (6.2 mg/L), MnSO4.H2O (16.9 mg/L)，ZnSO4.7H20 (8.6 mg/L)，CuSO4.5H20 (0.025mg/L), CoCl2.6H20 (0.025 mg/L), Na2MoO4.2H20 (0.25mg/L), FeSO4.7H20 (27.85mg/L),Na2EDTA (37.25 mg/L)，甘氨酸(2.0mg/L)，煙酸 B3 (0.5mg/L)，鹽酸硫胺素 BI (0.lmg/L),鹽酸批B多醇 B6 (0.5mg/L),肌醇(100mg/L)。B5 培養(yǎng)基配方:KNO3 (2500 mg/L), (NH4) 2 SO4 (134 mg/L)，NaH2PO4.H2O (150mg/L), MgSO4.7H20 (250 mg/L), CaCl2 (124 mg/L), KI (0.75 mg/L), H3BO3 (3 mg/L),MnSO4.H2O (10 mg/L), ZnSO4.7H20 (2mg/L), CuSO4.5H20 (0.025 mg/L), CoCl2.6H20(0.025 mg/L), Na2MoO4.2H20 (0.25mg/L)，F(xiàn)eSO4.7H20 (27.85mg/L), Na2EDTA (37.25 mg/L),煙酸B3 (lmg/L),鹽酸硫胺素BI (lOOmg/L),鹽酸批卩多醇B6 (lmg/L),肌醇(100mg/L)。N6 培養(yǎng)基配方:KN03 ( 28 30mg/L), (NH4) 2 SO4 (463 mg/L), MgSO4.7H20 (185mg/L), KH2PO4 (400mg/L), CaCl2 (125 mg/L), KI (0.8 mg/L), H3BO3 (1.6 mg/L), MnSO4.H2O(3.3 mg/L), ZnSO4.7H20 (1.5 mg/L), FeSO4.7H20 (27.85mg/L), Na2EDTA (37.25 mg/L)，甘氨酸(2.0mg/L),煙酸B3 (0.5mg/L)，鹽酸硫胺素BI (lmg/L),鹽酸批卩多醇B6 (0.5mg/L)。蝴蝶蘭防褐化組培方法包括以下步驟:(I)外植體的選擇及天然添加劑的制備與滅菌選取當(dāng)年生嫩葉或組培苗中的嫩葉，當(dāng)年生嫩葉需要經(jīng)過如下的滅菌過程:從植株上剪下，自來水沖去泥沙，洗滌劑液浸泡10 min并用軟刷輕輕刷去表面污垢，自來水沖洗3h，置于超凈工作臺上:體積濃度75%的酒精溶液浸泡35s，之后無菌水沖洗3次，再用體積濃度0.2%的HgCl2溶液浸泡7min,無菌水沖洗8次,之后用500 mg/L PVP浸泡6 min轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中吸干水分等待接入培養(yǎng)基；使用了 PVP (聚乙烯吡咯烷酮)后的消毒效果比原先沒有使用的溶液無菌率提高了 4倍。選取組培苗為外植體是不需要經(jīng)過消毒的過程直接置于超凈工作臺中待用。本發(fā)明選取的天然添加劑為金盞花、檸檬、西紅柿、迷迭香，需要提前制備成無菌溶液。選取剛過觀賞期的金盞花摘下花朵洗凈，榨取汁液，將汁液過濾除去固體殘渣，再用無菌過濾器在超凈工作臺中過濾制成無菌提取液(即本發(fā)明的提取液，下同)待加入滅菌完成的培養(yǎng)基中使用。帶表皮檸檬榨取汁液，將汁液過濾除去固體殘渣，再用無菌過濾器在超凈工作臺中過濾制成無菌提取液待加入滅菌完成的培養(yǎng)基中使用。帶表皮西紅柿榨取汁液，將汁液過濾，再用無菌過濾器在超凈工作臺中過濾制成無菌提取液待加入滅菌完成的培養(yǎng)基中使用。迷迭香植株按500g:1L的比例放入水中先沸水煮0.5h，然后保持水溫90°煮2.5h，將汁液過濾除去固體殘渣，再用無菌過濾器在超凈工作臺中過濾制成無菌提取液待加入滅菌完成的培養(yǎng)基中使用。(2)初代培養(yǎng)將處理好的葉片切為正常的0.5cm*0.5cm的小塊A，接入表I中的各培養(yǎng)基中，或先將葉片切為正常的0.5cm*0.5cm的小塊，再將0.5cm*0.5cm的小塊再橫向從中間切開切成小塊B ;然后將小塊接入表I中的各培養(yǎng)基中，在25土1°C、光照1500-2000Lx ;光照時間10-12小時/天的條件下培養(yǎng)，每組培養(yǎng)基處理分3次重復(fù)，每次處理9瓶。6周內(nèi)的平均褐化率結(jié)果(培養(yǎng)6周)如表I所示，其中第3、9、12、30四組中2周內(nèi)沒有發(fā)生褐化、6周內(nèi)平均褐化率小于5。且采用第二種方式處理的小塊B進行培養(yǎng)生長、分化，其平均褐化率要低于小塊A的褐化率。表1初代培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種植物防褐化組培培養(yǎng)基，其特征在于，各階段培養(yǎng)基由如下組分組成: (1)初代培養(yǎng)基 每升MS基本培養(yǎng)基中添加6-BA 8.0 mg、NAA 0.5 mg、金盞花提取液175 mg、瓊脂8 g、鹿糖30 g ,培養(yǎng)基pH=5.6;或 每升N6基本培養(yǎng)基中添加6-BA 8.0 mg、NM 0.5 mg、朽1檬提取液150 mg、瓊脂8 g、鹿糖30 g,培養(yǎng)基pH=5.6 ;或 每升MS基本培養(yǎng)基中添加6-BA 8.0 mg、NAA 0.5 mg、西紅柿提取液300 mg、瓊脂8g、鹿糖30 g,培養(yǎng)基pH=5.6 ;或 每升MS基本培養(yǎng)基中添加BA 8.0 mg、NAA 0.5 mg、迷迭香提取液110 mg、瓊脂8g、鹿糖30 g,培養(yǎng)基pH=5.6; (2)增殖分化培養(yǎng)基 每升B5基本培養(yǎng)基中添加6-BA 8.0 mg、NAA 0.5、金盞花提取液175 mg椰汁150g、瓊脂8 g、蔗糖30 g、培養(yǎng)基pH=5.6 ;或 每升N6基本培養(yǎng)基中添加+6-BA 8.0 mg、NM 0.5 mg、朽1檬提取液150 mg、椰汁150g、瓊脂8 g、蔗糖30 g，培養(yǎng)基pH=5.6 ;或 MS基本培養(yǎng)基中添加6-BA 8.0 mg、NAA 0.5 mg、西紅柿提取液300 mg、椰汁150g、瓊脂8 g、蔗糖30 g，培養(yǎng)基pH=5.6 ;或 MS基本培養(yǎng)基中添加6- BA 8.0 mg、NAA 0.5 mg、迷迭香提取液110 mg、椰汁150g、瓊脂8 g、蔗糖30 g、培養(yǎng)基pH=5.6。
2.—種蝴蝶蘭防褐化組培方法，包括外植體消毒、初代培養(yǎng)和增殖分化培養(yǎng)，生根培養(yǎng)、煉苗和移栽，其特征在于， 所述初代培養(yǎng)是指: 將消毒處理的外植體接入權(quán)利要求1所述的初代培養(yǎng)基上，25±1°C、光照1500-2000LX ;光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)5-6周； 所述增殖分化培養(yǎng)是指: 將初代培養(yǎng)后的沒有發(fā)生褐化的組織接入權(quán)利要求1所述的增殖分化培養(yǎng)基，25±1°C、光照1500-2000LX ;光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)至分化出幼苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種蝴蝶蘭防褐化組培方法，其特征在于:所述生根培養(yǎng)是指: 將增殖分化培養(yǎng)后的苗高2 cm的無根小苗，按每瓶I株，接種于MS + 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L +瓊脂8 g/L+蔗糖30 g/L培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2周。
4.權(quán)利要求2或3所述的一種蝴蝶蘭防褐化組培方法，其特征在于:所述煉苗是指: 將生根培養(yǎng)后的成苗每隔25-30天重新轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，如此反復(fù)2-3次；將壯苗后的成苗瓶口打開，在培養(yǎng)室半遮光放置2-3日，期間適時補充水分，使組培苗逐步適應(yīng)外界環(huán)境，達到煉苗的目的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種蝴蝶蘭防褐化組培方法，其特征在于:所述移栽是指: 將消毒處理過的水苔用清水浸泡，然后用脫水機脫去水苔中多余的水分至水苔手緊握無水滴產(chǎn)生，待用；移栽時將苗的根系分開呈散射狀，中間填充水苔，再用水苔包裹整個根系，然后將苗根部浸入營養(yǎng)液中，待水苔吸收營養(yǎng)液后再進行包苗，移栽。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種蝴蝶蘭防褐化組培方法，其特征在于:所述外植體消毒是指: 從植株上剪下當(dāng)年生嫩葉，自來水沖去泥沙,洗滌液浸泡10 min并除去表面污垢，自來水沖洗3h，置于超凈工作臺上，體積濃度75%的酒精溶液浸泡35s，之后無菌水沖洗3次，再用體積濃度0.2%的HgCl2溶液浸泡5-7min，無菌水沖洗8次，之后用500 mg/L PVP浸泡4-8 min轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，吸干附著水分 等待接入初代培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地說是一種蝴蝶蘭防褐化組培方法及防褐化培養(yǎng)基。組培方法包括外植體消毒、初代培養(yǎng)和增殖分化培養(yǎng)，生根培養(yǎng)、煉苗和移栽等步驟，其中在初代培養(yǎng)和增殖分化培養(yǎng)中將金盞花、檸檬、西紅柿、迷迭香等提取液添加到相應(yīng)的培養(yǎng)基中，從而有效防治蝴蝶蘭組培中常見的褐化問題，同時采用不同的切取方式輔助防治分化階段的褐化問題，形成了一種復(fù)合防褐化的方法。本發(fā)明方法穩(wěn)定性高，成功率大，綠色環(huán)保，可周年重復(fù)生產(chǎn)。
文檔編號A01H4/00GK103202233SQ20131015414
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月28日
發(fā)明者項艷, 任潔, 沈周高, 趙康, 馮琳, 趙華琳 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)