專利名稱：人前列腺癌新鮮組織激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物模型的建立，具體是一種人前列腺癌新鮮組織激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
在研究前列腺癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制以及評(píng)價(jià)治療措施有效性的實(shí)驗(yàn)中，各種前列腺癌動(dòng)物模型成為實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵工具。目前在國(guó)內(nèi)外已有眾多學(xué)者成功建立了各種前列腺癌動(dòng)物模型，包括應(yīng)用與人類原發(fā)性前列腺癌的生物學(xué)表現(xiàn)一致的細(xì)胞株以及人前列腺癌新鮮組織構(gòu)建裸鼠模型。理想的前列腺癌的動(dòng)物模型應(yīng)該能夠模擬人體前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的生理過程，腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移習(xí)性、組織學(xué)特點(diǎn)和生物化學(xué)特性要與人類前列腺癌相似，并且能模擬人前列腺癌基因的變化和對(duì)激素的治療反應(yīng)。
異種種植動(dòng)物模型即用已建立的人前列腺癌細(xì)胞系或人前列腺癌種植于免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)所建立的動(dòng)物模型。免疫缺陷動(dòng)物系的建立是異種種植模型建立的基礎(chǔ)，目前常用的動(dòng)物包括裸鼠和重癥聯(lián)合免疫缺陷性小鼠。移植模型雖具有成功率較高，潛伏期較短，可測(cè)性較強(qiáng)，但其不能研究前列腺癌的發(fā)生機(jī)制，只可研究其發(fā)展與轉(zhuǎn)移機(jī)制。目前，研究者們正在嘗試將人前列腺癌組織直接種植于免疫缺陷的小鼠身上，長(zhǎng)出的腫物可持續(xù)生長(zhǎng)并保持原腫瘤的組織病理特征，其可被用來篩選新的治療方法，并且發(fā)現(xiàn)該原位模型的組織病理、侵襲性及轉(zhuǎn)移特性與臨床上的情況類似。國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和VCaP，胰酶消化后加入等量含10%FBS的1640培養(yǎng)液進(jìn)行離心，棄上清后加入培養(yǎng)液輕輕吹打均勻可得到相應(yīng)的單細(xì)胞懸液，將1-5 X IO6個(gè)細(xì)胞與人工基膜(Matrigel)以1:1比例混合，裸鼠或者NSG小鼠(N0D-SCID-1L2R/1111)皮下包埋含IOmg睪酮緩釋膠囊I周。10%水合氯醛麻醉滿意后，取平臥位固定四肢，75%酒精術(shù)區(qū)消毒，于腹部正中縱行切口約1cm，注意避免損傷包皮腺，剪開肌層腹膜顯露腹腔，尋找并用彎鑷將精囊小心提出切口，顯露其根部前列腺前葉，眼科鑷夾持提起前列腺包膜，微量注射器將前述細(xì)胞懸液接種于前列腺包膜下，關(guān)腹，術(shù)后予口服慶大抗感染(或?qū)⒓?xì)胞混合液注射到皮下或腎被膜下)。傳代后，分別將腫瘤原位及皮下種植于補(bǔ)充雄激素的裸鼠，即可得到穩(wěn)定的人激素依賴性前列腺癌裸鼠模型。待上述裸鼠腫瘤生長(zhǎng)>50 mm3進(jìn)行去勢(shì)，并移除補(bǔ)充雄激素的緩釋管(去雄)，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制，大約7-14天后腫瘤出現(xiàn)再度增長(zhǎng)，將腫瘤傳代給去勢(shì)及不補(bǔ)充雄激素的裸鼠，待腫瘤長(zhǎng)大后得到人激素非依賴性前列腺癌。傳代后可以得到穩(wěn)定的人激素非依賴性前列腺癌。檢驗(yàn)方法:檢測(cè)小鼠血中睪酮濃度，以及應(yīng)用一抗抗人的AR和PSA行免疫組化實(shí)驗(yàn)。國(guó)內(nèi)外有文獻(xiàn)報(bào)道，種植手術(shù)前先在裸鼠皮下包埋含IOmg睪酮緩釋膠囊I周:在種植人組織或腫瘤傳代前應(yīng)該給相應(yīng)裸鼠補(bǔ)充雄激素，因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)裸鼠體內(nèi)的雄激素水平較低，在補(bǔ)充雄激素的的裸 鼠腫瘤體積倍增時(shí)間約為7天，這與原腫瘤類似。組織應(yīng)該首先被種植到腎被膜下而非皮下，由于皮下腫瘤成瘤率較低，且既不能模擬原位腫瘤的微環(huán)境，也不能使得腫瘤轉(zhuǎn)移潛能完全表現(xiàn)出來，而將腫瘤組織種植在血供豐富的腎被膜下，腫瘤組織更容易在裸鼠體內(nèi)成活。并且，國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道，在24小時(shí)內(nèi)，將人新鮮前列腺癌組織取下切成ImmX 3mmX 3mm的小塊，種植到上述裸鼠的雙腎被膜下，飼養(yǎng)90天后，傳代于該系鼠的前列腺前葉，可以得到激素依賴性前列腺癌裸鼠模型。目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)已有通過組織培養(yǎng)原代細(xì)胞的成熟方法，首先將漂洗、修剪干凈的組織剪成1-2 mm3左右小塊；然后將組織塊放入離心管(三角燒瓶)中加入30-50倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子(密封燒瓶);接著將燒瓶放入37°C水浴或者37°C孵箱內(nèi)，每隔3分鐘振搖一次，如能放在37°C的恒溫震蕩水浴箱中則更好。具體操作過程中需要注意:消化時(shí)間與組織的類別很有關(guān)系，對(duì)于某些腫瘤組織或其他較致密結(jié)締組織，消化時(shí)間4-48小時(shí)，對(duì)于容易消化的組織可以采用37°C震蕩消化15-45分鐘，也可以根據(jù)具體情況而定；如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經(jīng)搖動(dòng)即成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，可以認(rèn)為已消化充分；上皮組織經(jīng)膠原酶消化后，由于上皮細(xì)胞對(duì)此酶有耐受性，可能仍有一些細(xì)胞團(tuán)未完全分散，但成團(tuán)的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長(zhǎng)。因此，雖然有利用腫瘤細(xì)胞進(jìn)行建模的例子，但是，至今還沒有利用人前列腺癌新鮮組織進(jìn)行原代培養(yǎng)后直接進(jìn)行裸鼠異體移植實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中，利用人新鮮前列腺癌組織原代培養(yǎng)的原代細(xì)胞直接進(jìn)行原位和皮下種植的問題，而提供一種人前列腺癌新鮮組織激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。一種人前列 腺癌新鮮組織激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，
a.首先在雄性裸鼠皮下埋藏含IOmg睪酮緩釋膠囊一周；
b.取人前列腺癌新鮮組織原代培養(yǎng)后得到的貼壁原代細(xì)胞，將膠原酶消化后的原代細(xì)胞以1:1比例混合人工基膜后，種植到上述補(bǔ)充了雄激素的BULB/C裸鼠單側(cè)腎被膜下，40-60天后得到人激素依賴性前列腺癌裸鼠模型，傳代于上述該系鼠的前列腺前葉，即可得到穩(wěn)定的人激素依賴性前列腺癌裸鼠原位模型；
c.待上述裸鼠腫瘤生長(zhǎng)>50mm3后進(jìn)行去勢(shì)，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制后出現(xiàn)再度增長(zhǎng)，將腫瘤傳代給手術(shù)去勢(shì)及不補(bǔ)充雄激素的裸鼠，待腫瘤長(zhǎng)大后經(jīng)傳代可得到人激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型。所述人前列腺癌新鮮組織激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于:所述原代細(xì)胞是將人體新鮮前列腺癌標(biāo)本經(jīng)生理鹽水沖洗，加膠原酶II后充分挫切碎，37°C無菌二氧化碳孵育箱消化30-60分鐘，加等量含10%FBS的1640進(jìn)行離心、棄上清將剩余組織和少量余液均勻涂抹在培養(yǎng)皿中，貼壁3-4小時(shí)，加入含1%雙抗和10%FBS的1640約3mL，置于37°C無菌二氧化碳孵育箱，培養(yǎng)72小時(shí)后，行換液處理，每皿加入含1%雙抗和10%FBS的1640約6mL，2-3天后重復(fù)換液3次，即培養(yǎng)7_10天后，可得較純凈的貼壁原代細(xì)胞。這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明，激素依賴和非依賴的兩種腫瘤是來源于同一個(gè)病人的前列腺癌組織，在體外培養(yǎng)出原代細(xì)胞后再行異體移植，提高成瘤率；單側(cè)腎被膜下種植比較雙側(cè)腎被膜下種植，提高了術(shù)后裸鼠的成活率；整體降低了造模成本。應(yīng)用裸鼠異體種植人前列腺癌新鮮組織技術(shù)和原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為平臺(tái)，不僅更加接近于臨床人體前列腺癌，且能觀察到腫瘤發(fā)展到激素非依賴的過程，成為更為有效的前列腺癌研究工具。


圖1是鏡下組織周圍人新鮮前列腺癌組織原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞 圖2是鏡下組織遠(yuǎn)處人新鮮前列腺癌組織原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞 圖3是人前列腺癌新鮮組織原代 細(xì)胞異種移植于裸鼠腎被膜下成瘤視圖； 圖4是裸鼠腎組織與人前列腺癌組織 圖5是依賴組人前列腺癌組織裸鼠原位前列腺列腺腫瘤病理切片H-E染色；
圖6是非依賴組人前列腺癌組織裸鼠原位前列腺腫瘤病理切片H-E染色 圖7是兩種組織間PSA的平均光密度值比較 圖8是兩種組織間AR的平均光密度值比較 圖9是雄激素非依賴組與雄激素依賴組裸鼠血清睪酮水平比較 圖10是人新鮮前列腺癌組織的原代細(xì)胞培養(yǎng) 圖11是人新鮮前列腺癌組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)傳代純化后細(xì)胞圖。
具體實(shí)施例方式一種人前列腺癌新鮮組織激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，
a.首先在雄性裸鼠皮下埋藏含IOmg睪酮緩釋膠囊一周；
b.取人前列腺癌新鮮組織原代培養(yǎng)后得到的貼壁原代細(xì)胞，將膠原酶消化后的原代細(xì)胞以1:1比例混合人工基膜后，種植到上述補(bǔ)充了雄激素的BULB/C裸鼠單側(cè)腎被膜下，40-60天后得到人激素依賴性前列腺癌裸鼠模型，傳代于上述該系鼠的前列腺前葉，即可得到穩(wěn)定的人激素依賴性前列腺癌裸鼠原位模型；
c.待上述裸鼠腫瘤生長(zhǎng)>50mm3后進(jìn)行去勢(shì)，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制后出現(xiàn)再度增長(zhǎng)，將腫瘤傳代給手術(shù)去勢(shì)及不補(bǔ)充雄激素的裸鼠，待腫瘤長(zhǎng)大后經(jīng)傳代可得到人激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型。所述人前列腺癌新鮮組織激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于:所述原代細(xì)胞是將人體新鮮前列腺癌標(biāo)本經(jīng)生理鹽水沖洗，加膠原酶II后充分挫切碎，37°C無菌二氧化碳孵育箱消化30-60分鐘，加等量含10%FBS的1640進(jìn)行離心、棄上清將剩余組織和少量余液均勻涂抹在培養(yǎng)皿中，貼壁3-4小時(shí)，加入含1%雙抗和10%FBS的1640約3mL，置于37°C無菌二氧化碳孵育箱，培養(yǎng)72小時(shí)后，行換液處理，每皿加入含1%雙抗和10%FBS的1640約6mL，2-3天后重復(fù)換液3次，即培養(yǎng)7_10天后，可得較純凈的貼壁原代細(xì)胞。1.1對(duì)象和方法
1.1.1研究對(duì)象
人前列腺癌新鮮組織，經(jīng)過原代細(xì)胞培養(yǎng)后，異體移植于BULB/C裸鼠的前列腺癌動(dòng)物模型；以及在動(dòng)物模型中獲得的腫瘤組織經(jīng)過原代培養(yǎng)后得到的足量的腫瘤細(xì)胞。1.1.2實(shí)驗(yàn)材料1.1.2.1組織來源、實(shí)驗(yàn)試劑和動(dòng)物
O人前列腺癌組織天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院臨床手術(shù)標(biāo)本(術(shù)前獲患者同意)
2)膠原酶IISigma公司
3)0.9%生理鹽水天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院
4)人工基膜MatrigelSigma公司
5)RPM1-1640 培養(yǎng)基 Gibco 公司
6)胎牛血清FBSGibco公司
7)雙抗(青霉素與鏈霉素)天津華津制藥廠
8)胰蛋白酶Gibco公司
9)雄性BULB/C裸鼠:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，6-8周齡，體重 18-20g
10)小鼠飼料(1011顆粒飼料)北京維通利華生物技術(shù)有限公司
11)硫酸慶大霉素注射 液天津華津制藥廠
12)10%水合氯醛天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院
13)36%甲醛溶液天津新華化工廠
14)鼠抗人AR單克隆抗體Abcom公司
15)鼠抗人PSA單克隆抗體Abcom公司
16)羊抗多克隆抗體200μ L EPIT MICS公司
17)即用型SP免疫組化通用試劑盒天津市津脈基因測(cè)繪技術(shù)有限公司，包括:5%BSA封閉液6mL ;生物素標(biāo)記二抗工作液6mL ;3%過氧化氫6mL ;辣根酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液6mL
18)DAB試劑盒北京中杉金橋公司，包括試劑A:濃縮緩沖液(20X)3mL ;試劑B:DAB溶液(20 X) 3mL ;試劑C:濃縮過氧化氫溶液(20 X) 3mL
19)去離子水與無菌雙蒸水天津市泌尿外科研究所自備
20)無水乙醇天津醫(yī)大第二醫(yī)院
21)PBS磷酸鹽緩沖液(0.01M, PH7.2-7.4)粉劑北京中杉金橋公司
22)枸櫞酸鹽緩沖液(0.01M, PH6.0)粉劑北京中杉金橋公司
23)人睪酮(TES.T) ELISA試劑盒美國(guó)Biocheck公司 1.1.2.2主要儀器設(shè)備
1)石臘切片機(jī)德國(guó)Leica公司
2)光學(xué)顯微鏡日本Olympus公司
3)光學(xué)顯微照相系統(tǒng)日本NikonECLIPSE90i公司
4)微量移液器美國(guó)Gilson公司
5)電熱真空干燥箱天津市三水科學(xué)儀器有限公司
6)LRH系列生化培養(yǎng)箱上海恒一科學(xué)儀器有限公司
7)通風(fēng)櫥天津市拉貝爾儀器儀表有限公司
8)微型漩渦混合儀上海滬西分析儀器廠
9)臺(tái)式高速離心機(jī)TDL-40B型上海安亭科學(xué)儀器廠
10)電子天平AB204-E 型 METTLER TOLEDO, Switzerland 公司11)架盤藥物天平BP-1I型上海醫(yī)用激光儀器廠
12)LABCoNCO 純水系統(tǒng) BIORAD 公司，USA
13)磁力攪拌機(jī)902N0210 型 Fisher Scientific 公司，USA
14)普通冰箱B⑶-268K型山東海爾集團(tuán)
15)無菌二氧化碳孵育箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠
16)二氧化碳?xì)馄可虾２┭笇?shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠
17)磁力攪拌機(jī)902N0211 型 Fisher Scientific 公司，USA
18)立式壓力蒸汽滅菌器上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠
19)智能安全型超凈工作臺(tái)上海智成分析儀器制造有限公司
20)超聲波加濕器合肥榮事達(dá)小家電有限公司
21)紫外線殺菌車天津市正大醫(yī)療護(hù)理設(shè)備廠
22)空氣凈化器廣東美的環(huán)境電器制造有限公司
23)-80°C低溫冰箱海爾集團(tuán)公司
24)獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠IVC蘇州市蘇杭科技器材有限公司
25)電子天平上海精密儀器儀表有限公司
26)游標(biāo)卡尺上海精密儀器儀表有限公司
27)Silastic laboratory tubing 美國(guó) DOW CORUNING CORPORATION 公司
28)Testosterone laboratory use only (code: 164410050) 美國(guó) ACROS 公司
29)Medical Adhesive Silicone Type A DOW CORUNING CORPORATION 公司
30)小鼠手術(shù)物品:眼科剪、鑷子、手術(shù)刀柄、手術(shù)刀片、眼科彎剪、持針器、玻璃錐、打孔器、4-0吸收線、3-0絲線、顯微手術(shù)燈，醫(yī)用固定膠布、ImL注射器、消毒用酒精棉球、紗布、手術(shù)單、電子秤、燒杯、生理鹽水、一次性口罩、帽子、手套、一次性無菌吸管、IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿等
31)其它:微波爐、冰箱、玻璃立缸、濕盒、微波修復(fù)盒等
1.1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.1.3.1人前列腺癌組織標(biāo)本取材法
登記患者信息(姓名、年齡、PSA、診斷、Gleason評(píng)分、病史)，手術(shù)取出標(biāo)本后，根據(jù)穿刺及影響學(xué)檢查結(jié)果，判斷前列腺癌組織位置，剖開前列腺，取前列腺癌組織，其中一份置于4°C的無菌RPM1-1640培養(yǎng)液中洗滌后備用，一份用10%福爾馬林固定石蠟切片，一份保存于-80°C的冰箱。1.1.3.2人前列腺癌新鮮組織原代細(xì)胞培養(yǎng) 在超凈臺(tái)中進(jìn)行無菌操作，術(shù)前手術(shù)操作間內(nèi)外均行紫外線照射30分鐘，將人體新鮮前列腺癌標(biāo)本進(jìn)行生理鹽水沖洗多次，放入IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加足量(至少需要完全覆蓋組織)膠原酶II后應(yīng)用兩把手術(shù)刀片將組織切碎充分(操作一直進(jìn)行，大約40分鐘)，放入37°C無菌二氧化碳孵育箱消化30-60分鐘，加等量含10%FBS的1640進(jìn)行離心，1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘，棄上清后將剩余組織和少量余液均勻涂抹在IOcm培養(yǎng)皿中(這些培養(yǎng)皿底部均勻涂抹2-3滴FBS，無菌風(fēng)干備用)，貼壁3-4小時(shí)，每皿輕柔加入含1%雙抗和10%FBS的1640約3mL，置于37°C無菌二氧化碳孵育箱，培養(yǎng)72小時(shí)后，行換液處理，每皿加入含1%雙抗和10%FBS的1640約6mL，2-3天后重復(fù)此法換液，如此重復(fù)3次，即培養(yǎng)7_10天后，可得到較純凈的貼壁原代腫瘤細(xì)胞。圖1、2顯微鏡下人新鮮前列腺癌組織經(jīng)過原代培養(yǎng)得到的原代細(xì)胞(X200)，如圖所示，在組織周圍可見致密排列的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖1);在距離組織遠(yuǎn)處仍可見生長(zhǎng)良好、排列緊密的原代腫瘤細(xì)胞(圖2)。1.1.3.3裝有睪酮的半透乳膠管的制作方法
將半透乳膠管剪成Icm長(zhǎng)，戊二醛浸泡10小時(shí)，將睪酮(約IOmg)裝入管中，用生物膠封口，置于超凈臺(tái)紫外線照射3小時(shí)。1.1.3.4裸鼠背部皮下植入加有睪酮的半透乳膠管的手術(shù)過程 O術(shù)前手術(shù)操作間紫外線照射30分鐘；
2)取裸鼠稱重，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉(按0.003mL/g計(jì)算)；
3)小鼠固定，術(shù)區(qū)消毒，右側(cè)背部切開皮膚約2毫米，放入裝有睪酮的半透乳膠管，縫合切口 ；
4)標(biāo)記后放回鼠籠，飲水中加入硫酸慶大霉素注射液2mL(8萬單位)，I周后可進(jìn)行人前列腺癌細(xì)胞異體種植。1.1.3.5原代細(xì)胞種植及激素依賴性前列腺癌裸鼠模型的構(gòu)建
I)事先用胰蛋白酶消化細(xì)胞后加入等量含10%FBS的1640進(jìn)行離心(1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)，棄上清后加入培養(yǎng)液輕輕吹打均勻可得到單細(xì)胞懸液，將此細(xì)胞懸液按照I X IO6個(gè)細(xì)胞/0.0lmL和人工基膜(matrigel)按1:1比例混勻0.02mL備用；
2)術(shù)前手術(shù)操作間紫外線照射30分鐘，應(yīng)用一次性ImL的注射器；
3)稱重，小鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉(按0.003mL/g計(jì)算)；
4)小鼠取俯臥位固定，術(shù)區(qū)消毒，左側(cè)肋緣下切口約8毫米，依次切開皮膚、肌肉，進(jìn)入腹腔，找到左側(cè)腎臟，將腎臟提出切口 ；
5)用注射器針頭深刺入腎被膜，將上述細(xì)胞混合液種植于皮下包埋含IOmg睪酮緩釋膠囊的BULB/C裸鼠單側(cè)腎被膜下，這側(cè)腎臟可選擇2-3個(gè)部位進(jìn)行細(xì)胞種植(每個(gè)部位約
0.02mL)，將左側(cè)腎臟放回原位，依次縫合肌肉、皮膚，關(guān)閉切口，再次消毒皮膚；標(biāo)記裸鼠后放回鼠籠，飲水中加入硫酸慶大霉素注射液2mL (8萬單位)，經(jīng)大約60天，可得到人激素依賴性前列腺癌裸鼠模型；
6)將長(zhǎng)瘤的裸鼠處稱重麻醉后在無菌條件下取出左腎(種植有人前列腺癌組織的腎)組織，無菌RPM1-1640培養(yǎng)液沖洗，去除血污和壞死組織，可見腎臟上有明顯腫物形成，切下組織塊，將組織塊用手術(shù)刀切成I mm3小塊，置于4°C的無菌RPM1-1640培養(yǎng)液中洗滌后，冰上放置備用；
7)將新購(gòu)入的裸鼠稱重，小鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉(按0.003mL/g計(jì)算)；
8)小鼠取俯臥位固定，術(shù)區(qū)消毒，然后，分別將上述切好的大小約為Imm3
的腫瘤小塊，種植到補(bǔ)充雄激素裸鼠的皮下及前列腺原位，即可得到穩(wěn)定的人激素依賴性前列腺癌裸鼠模型。1.1.3.6激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型的構(gòu)建
待上述裸鼠腫瘤生長(zhǎng)較大后(>50 mm3)進(jìn)行去勢(shì)(去掉雙側(cè)睪丸:先將雙側(cè)睪丸附睪推至雙側(cè)陰囊內(nèi)，應(yīng)用23號(hào)手術(shù)線將陰囊與肢體連接處系住，打結(jié)3次系緊以致睪丸缺血變黑逐漸壞死)， 并移除補(bǔ)充雄激素的緩釋管(去雄)，腫瘤生長(zhǎng)開始受到抑制，但大約7-14天后腫瘤出現(xiàn)再度增長(zhǎng)(與國(guó)外最新文獻(xiàn)報(bào)道一致)，將腫瘤傳代給手術(shù)去勢(shì)及不補(bǔ)充雄激素的裸鼠，待腫瘤長(zhǎng)大后經(jīng)傳代可得到人激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型。1.1.3.7人前列腺癌組織裸鼠腫瘤前列腺原位傳代方法 O術(shù)前手術(shù)操作間紫外線照射30分鐘；
2)腫瘤組織塊制作方法:上述人前列腺癌組織種植于小鼠腎被膜下10周后，將小鼠稱重麻醉后在無菌條件下取出種有人前列腺癌組織的小鼠左腎，無菌RPM1-1640培養(yǎng)液沖洗，去除血污和壞死組織，可見腎臟上有明顯腫物形成，切下腫瘤組織塊，將組織塊用手術(shù)刀切成I mm3小塊，置于4°C的無菌RPM1-1640培養(yǎng)液中洗滌后，冰上放置備用；
3)將新購(gòu)入的裸鼠稱重，小鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉(按0.003mL/g計(jì)算)；
4)小鼠固定，術(shù)區(qū)消毒，取陰莖上緣約5毫米處腹正中切口，依次切開皮膚、腹壁組織，避免損傷腸道；
5 )暴露術(shù)野，于盆腔內(nèi)仔細(xì)尋找乳白色精囊，將兩側(cè)精囊提出腹腔外，盡量顯露精囊根部前列腺；
6)用顯微鑷尖部劃破前列腺包膜，將切碎腫瘤組織塊包埋于前列腺包膜下；
7)器官放回原位，逐層關(guān)腹，再次消毒皮膚；
8)然后，剪開裸鼠雙上肢或者四肢根部的皮膚，切口大約長(zhǎng)3毫米，盡量減小切口和損傷，但要保證腫瘤小塊組織能塞進(jìn)去，隨后用小鑷游離切口內(nèi)的遠(yuǎn)端皮膚和皮下組織，充分游離后，將腫瘤組織小塊填塞到最遠(yuǎn)端的游離部分，盡量延長(zhǎng)組織種植處到切口的距離，從而最大程度上避免組織拖出體外，盡量一震即能縫合切口 ； 9)同樣的方法將腫瘤組織小塊種植到其他幾個(gè)皮下部位，然后用75%酒精消毒切口皮
膚；
10)將標(biāo)記后放回鼠籠，飲水中加入硫酸慶大霉素注射液2mL(8萬單位);待腫瘤生長(zhǎng)大約2月后(腫瘤大小約為50-100 mm3)取瘤；
11)傳代的過程中，激素依賴性的裸鼠腫瘤和非依賴性的不同:新的裸鼠在傳代手術(shù)前即行埋管補(bǔ)充雄激素或者去勢(shì)手術(shù)處理。1.1.3.8 取瘤方法
腫瘤生長(zhǎng)2-3個(gè)月大小合適時(shí)(約50-100 mm3)，將裸鼠處死后立即在無菌條件下取出腫瘤組織，無菌生理鹽水沖洗，去除血污和壞死組織，每只小鼠腫瘤組織均勻分成多份，其中一份用10%福爾馬林固定石蠟切片，兩份保存于_80°C冰箱，其余行原代細(xì)胞培養(yǎng)。1.1.3.9荷瘤鼠腫瘤定期觀察測(cè)量
每3天觀察一次，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，分別測(cè)量長(zhǎng)徑和短徑，腫瘤體積計(jì)算方法為腫瘤體積計(jì)算公式:體積=π /6X長(zhǎng)徑X短徑2。1.1.3.10 H-E染色的實(shí)驗(yàn)方法
H-E染色委托天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科病理科協(xié)助，具體步驟如下:
1)石蠟切片常規(guī)脫蠟和水化(二甲苯1、II和III各10分鐘，系列乙醇水化)；
2)0.01mol/L PBS (PH7.2)洗，3 分鐘 X3 次;
3)將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色3分鐘；
4)酸水及氨水中分色I(xiàn)分鐘；
5)流水沖洗I小時(shí)后入蒸餾水I分鐘；6)入70%和90%酒精中脫水各10分鐘；
7)入酒精伊紅染色液染色2-3分鐘；
8)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明；
9)常規(guī)中性樹膠封片；
10)結(jié)果觀察，拍照。1.1.3.11免疫組織化學(xué)染色的實(shí)驗(yàn)方法
免疫組織化學(xué)染色(SABC^i)參照試劑盒說明進(jìn)行，簡(jiǎn)要操作步驟如下:
1)石蠟標(biāo)本4μπι切片，70°C烤箱烤片15分鐘，以利于脫蠟；
2)二甲苯⑴浸泡10分鐘；
3)二甲苯(II)浸泡10分鐘；
4)無水酒精(I)浸泡5分鐘；
5)無水酒精(II)浸泡5分鐘；
6)95%酒精⑴浸泡5分鐘；
7)85%酒精⑴ 浸泡5分鐘；
8)75%酒精(I)浸泡5分鐘；
9)自來水沖洗3分鐘；
10)PBS液洗滌2分鐘X3次；
11)將切片置于枸櫞酸鹽緩沖液中，于微波爐中低火修復(fù)抗原(先加熱5分鐘至沸騰后斷電，待液溫稍涼后再次加熱10分鐘)；
12)取出修復(fù)盒，于室溫下冷卻(勿將切片自盒中取出)；
13)液溫恢復(fù)常溫(約一至兩小時(shí))后，取出切片，以PBS液洗滌2分鐘X3次；
14)濾紙擦干切片周邊多余水分，標(biāo)本上滴加3%雙氧水，濕盒中室溫下避光孵育15分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶；
15)甩干多余液體，以PBS液洗滌2分鐘X3次；
16)濾紙擦干切片周邊多余水分，標(biāo)本上滴加5%BSA血清封閉液，于濕盒中室溫下孵育25分鐘；
17)甩干多余液體(不洗滌)，滴加一抗(FKBP5所用濃度為5ug/mL)，涂布均勻后置于濕盒中孵育,4 °C冰箱內(nèi)過夜；
18)次日(于冰箱內(nèi)留置約18小時(shí)后)，取出濕盒，室溫下放置至恢復(fù)常溫；
19)切片恢復(fù)常溫(約半小時(shí))后，以PBS液洗滌5分鐘X3次；
20)濾紙擦干切片周邊多余水分，標(biāo)本上滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，涂布均勻后置于濕盒中，在37°C溫箱中孵育25分鐘；
21)取出濕盒，室溫下放置，待冷卻至常溫后，以PBS液洗滌5分鐘X3次；
22)濾紙擦干切片周邊多余水分，標(biāo)本上滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，涂布均勻后置于濕盒中，37°C溫箱中孵育30分鐘；
23)取出濕盒，室溫下放置，待冷卻至常溫后，以PBS液洗滌5分鐘X3次；
24)滴加DAB液(事先配制，取蒸餾水lmL，試劑盒中ABC試劑各I滴，混勻即可，宜30分鐘內(nèi)使用)，室溫顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間(顯色時(shí)間在5分鐘左右)； 25)自來水沖洗10分鐘；26)濾紙擦干切片周邊多余水分，標(biāo)本上滴加蘇木素工作液(按照1:4配制)，復(fù)染細(xì)胞核，反應(yīng)時(shí)間平均為30到40秒；
27)自來水沖洗10分鐘；
28)75%酒精(II)浸泡10秒；
29)85%酒精(II)浸泡10秒；
30)95%酒精(II)浸泡10秒；
31)無水酒精(III)浸泡10秒；
32)無水酒精(IV)浸泡5分鐘；
33)二甲苯(III)浸泡5分鐘；
34)二甲苯(IV)浸泡5分鐘；
35)中性樹膠封片
36)顯微鏡觀察。1.1.3.12免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷
免疫組化結(jié)果判斷:光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片顯色反應(yīng)，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照，用已 知陽性切片作陽性對(duì)照。以細(xì)胞漿或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞必須:1.細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；2.陽性顆粒定位性好；3.著色明顯高于背景。采用Image-PiO Plus(IPP)圖像分析軟件對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行定量測(cè)量。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)以上的高倍鏡視野(X200)，測(cè)量每個(gè)視野下陽性細(xì)胞的平均光密度值。1.1.3.13統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，所有測(cè)定數(shù)據(jù)均采用(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)，P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后面的第二和第四部分也是應(yīng)用同樣的方法，下同略。1.1.3.14裸鼠血清提取方法
1)裸鼠稱重、深度麻醉、仰臥位固定；
2)術(shù)區(qū)消毒，打開胸腔，完整暴露心臟，以ImL注射器針頭刺入右心室，吸取血液，注意吸取的過程中動(dòng)作要輕柔；
3)將收集的血液標(biāo)本于室溫下放置60分鐘，然后去掉注射器針頭，緩慢而輕柔地將血液轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的離心管中，待其自行凝集，而后4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，離心完畢后上清液即是血清；
4)以微量加樣器吸取上清液，做好標(biāo)記，-80°C凍存。人前列腺癌新鮮組織經(jīng)原代培養(yǎng)的原代細(xì)胞異種移植于裸鼠腎被膜下成瘤結(jié)果如圖3、4所示，細(xì)胞成活后成瘤結(jié)果良好:前列腺癌腫物為裸鼠腎臟中央部位處的白色實(shí)性組織(圖3)。實(shí)驗(yàn)過程中將原代細(xì)胞直接種植于小鼠腎被膜下成瘤率85% (17/20)，3個(gè)月時(shí)小鼠死亡率5%(1/20)。人前列腺癌組織的原代細(xì)胞種植于裸鼠腎被膜下組織H-E染色結(jié)果(圖4):裸鼠腎組織與人前列腺癌組織分解明顯，腫瘤組織分化差，沒有腺體結(jié)構(gòu)、內(nèi)部有壞死，人前列腺癌組織細(xì)胞核明顯大于小鼠腎組織細(xì)胞核。
得到的腫瘤組織塊種植在裸鼠前列腺原位，可在裸鼠間傳代，成瘤率95%(19/20)。圖5是依賴組人前列腺癌組織裸鼠原位前列腺腫瘤病理切片H-E染色圖；圖6是非依賴組人前列腺癌組織裸鼠原位前列腺腫瘤病理切片H-E染色圖；裸鼠原位前列腺腫瘤切片顯示腫瘤缺乏腺泡結(jié)構(gòu)，其中腫瘤細(xì)胞胞核形態(tài)不規(guī)則，核異型性明顯。人新鮮組織激素依賴和非依賴性前列腺癌裸鼠模型的驗(yàn)證:
免疫組織化學(xué)檢測(cè)裸鼠模型腫瘤組織中的PSA和AR表達(dá)結(jié)果:參見圖7、8，異種移植于裸鼠前列腺原位的人前列腺癌組織可表達(dá)PSA和AR，并且PSA和AR的表達(dá)水平在激素依賴和非依賴性的動(dòng)物模型中分別存在一定的差異=PSA光密度值分別為0.0487±0.0014和0.0346±0.0012，AR光密度值分別為0.0585±0.0013和0.0351 ±0.0011，差異分別都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p〈0.05)。同時(shí)，經(jīng)過檢測(cè)激素依賴和非依賴性的動(dòng)物模型中睪酮水平，發(fā)現(xiàn)兩者分別接近于人前列腺癌的激素依賴期的水平和去勢(shì)后激素非依賴期的水平，激素非依賴性的裸鼠模型中睪酮水平明顯低于激素依賴性的裸鼠模型的睪酮水平(圖9)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P〈0.05)。雄激素非依賴組與雄激素依賴組小鼠睪酮水平分別取新鮮雄激素非依賴組與雄激素依賴組裸鼠血清，采用人睪酮(TES.T) ELISA試劑盒測(cè)得雄激素非依賴組與雄激素依賴組裸鼠血清睪酮水平分別為1.09±0.075ng/mL和9.78±0.994ng/mL (表1.1，圖9)，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)，雄激素非依賴組裸鼠血清睪酮濃度處在去勢(shì)水平(〈1.2ng/mL)。表1.1:雄激素非依賴組與雄激素依賴組裸鼠血清睪酮水平
如圖9所示:雄激素非依賴性組裸鼠血清睪酮水平明顯低于雄激素依賴組裸鼠，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p〈0.05。裸鼠模型中的腫瘤組織經(jīng)過原代 培養(yǎng)后可以成功得到大量的原代細(xì)胞，顯微鏡下(X200)顯示如圖所示:可見致密排列的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，其間可見成纖維細(xì)胞(圖10);細(xì)胞經(jīng)過傳代后成纖維細(xì)胞基本消失,可見排列緊密的原代腫瘤細(xì)胞(圖 11)。
權(quán)利要求
1.一種人前列腺癌新鮮組織激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于: a.首先在雄性裸鼠皮下埋藏含IOmg睪酮緩釋膠囊一周； b.取人前列腺癌新鮮組織原代培養(yǎng)后得到的貼壁原代細(xì)胞，將膠原酶消化后的原代細(xì)胞以1:1比例混合人工基膜后，種植到上述補(bǔ)充了雄激素的BULB/C裸鼠單側(cè)腎被膜下，40-60天后得到人激素依賴性前列腺癌裸鼠模型，傳代于上述該系鼠的前列腺前葉，即可得到穩(wěn)定的人激素依賴性前列腺癌裸鼠原位模型； c.待上述裸鼠腫瘤生長(zhǎng)>50mm3后進(jìn)行去勢(shì)，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制后出現(xiàn)再度增長(zhǎng)，將腫瘤傳代給手術(shù)去勢(shì)及不補(bǔ)充雄激素的裸鼠，待腫瘤長(zhǎng)大后經(jīng)傳代可得到人激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述人前列腺癌新鮮組織激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于:所述原代細(xì)胞是將人體新鮮前列腺癌標(biāo)本經(jīng)生理鹽水沖洗，加膠原酶II后充分切碎，37°C無菌二氧化碳孵育箱消化30-60分鐘，加等量含10%FBS的1640進(jìn)行離心、棄上清將剩余組織和少量余液均勻涂抹在培養(yǎng)皿中，貼壁3-4小時(shí)，加入含1%雙抗和10%FBS的1640約3mL，置于37°C無菌二氧化碳孵育箱，培養(yǎng)72小時(shí)后，行換液處理，每皿加入含1%雙抗和10%FBS的1640約6mL，2-3天后重復(fù)換液3次，即培養(yǎng)7_10天后，可得較純凈的貼壁原代細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人前列腺癌新鮮組織激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法。其是在小鼠皮下埋藏含10mg睪酮緩釋膠囊一周，另將人前列腺癌新鮮組織培養(yǎng)的原代細(xì)胞與人工基膜混合后，接種于補(bǔ)充雄激素的BULB/C裸鼠單側(cè)腎被膜下，傳代于該系鼠的前列腺前葉，得到人激素依賴性前列腺癌裸鼠模型，待裸鼠腫瘤生長(zhǎng)>50mm3進(jìn)行去勢(shì)，將腫瘤傳代給手術(shù)去勢(shì)及不補(bǔ)充雄激素的裸鼠，腫瘤長(zhǎng)大后經(jīng)傳代得到人前列腺癌新鮮組織激素非依賴性前列腺癌裸鼠模型。這樣使本發(fā)明更接近于人體前列腺癌，以裸鼠異體種植人前列腺癌新鮮組織技術(shù)和原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為平臺(tái)，同時(shí)得到具有同一人前列腺癌組織來源的激素依賴和非依賴的前列腺癌裸鼠模型。
文檔編號(hào)A01K67/027GK103210879SQ20131017029
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月10日
發(fā)明者牛遠(yuǎn)杰, 蔣寧, 尚芝群, 田晶, 陳靖, 朱識(shí)淼, 馬媛, 張名浩, 孫李斌 申請(qǐng)人:天津市泌尿外科研究所