專利名稱：選擇性敲除樹突狀細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞構(gòu)建領(lǐng)域，涉及一種選擇性敲除樹突狀細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DCs) —直以來被認(rèn)為是人體內(nèi)一種功能強(qiáng)大且多樣化的抗原遞呈細(xì)胞，它能將體內(nèi)外來源的抗原信息傳遞給多種免疫功能細(xì)胞，指揮調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)進(jìn)而達(dá)到生理性抵御或病理性的加重?fù)p傷的反應(yīng)。申請(qǐng)人:長(zhǎng)期從事小腸來源的DCs，因其具有數(shù)量大、直接接觸人體最大的細(xì)菌庫(kù)——腸內(nèi)容物、正常時(shí)為達(dá)到免疫耐受而保持靜息狀態(tài)、以及腸道易受缺血缺氧的損傷等特征，小腸來源的DCs又具有更為復(fù)雜且重要的特性。腸道粘膜固有層樹突狀細(xì)胞(lamina propria dendritic cells, LPDCs)是近年來逐漸被重視的位于腸粘膜下的一群抗原遞呈細(xì)胞。與體內(nèi)其它的DCs不同，腸道LPDCs特征性地表達(dá)TLR-5，在接受腸道細(xì)菌鞭毛抗原的刺激激活后對(duì)腸道局部炎癥反應(yīng)甚至全身的免疫平衡產(chǎn)生重要影響。體外研究發(fā)現(xiàn)腸道LPDCs所表達(dá)的TLR5在細(xì)菌鞭毛抗原的刺激下通過Myd88信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活一系列生物效應(yīng)，并直接誘導(dǎo)一系列促進(jìn)腸道局部防御性的免疫反應(yīng):促使?jié){細(xì)胞成熟并分泌slgA、誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Thl和Thl7細(xì)胞分化，同時(shí)促使淋巴細(xì)胞回巢至腸粘膜下。然而，另一些體內(nèi)研究卻發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷休克等應(yīng)急情況下雖然腸道LPDCs增加了與細(xì)菌鞭毛抗原的接觸機(jī)會(huì)，但其經(jīng)常表現(xiàn)為功能抑制。Wang等發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下腸道來源的樹突狀細(xì)胞呈現(xiàn)成熟度低、TGF-β分泌增加、前炎癥因子(IL-1 β，IL-6, TNF-α )分泌減少等特點(diǎn)，并能誘導(dǎo)以Treg細(xì)胞極化為主的免疫抑制狀態(tài)；我們前期的研究亦發(fā)現(xiàn) 嚴(yán)重創(chuàng)傷休克小鼠的LPDCs表面⑶80/86、MHC II表達(dá)下降等分化不成熟以及抗原遞呈活性下降的特性。Kao JY等在胃粘膜局部免疫研究中發(fā)現(xiàn)，Helicobacter pylori (H.P)與胃粘膜下與CDllc+DCs接觸后，能夠使后者的TGF-β及IL-10分泌增加、并誘導(dǎo)ΤΗ17細(xì)胞向Treg細(xì)胞方向極化，促進(jìn)免疫耐受，最終使得H.P逃避免疫攻擊而入侵機(jī)體。究竟是什么機(jī)制決定腸道LPDCs誘導(dǎo)免疫及炎癥反應(yīng)的方向？有學(xué)者認(rèn)為這與LPDCs所具有的“非T細(xì)胞依賴“的淋巴細(xì)胞激活方式有密切關(guān)系。Uematsu S等發(fā)現(xiàn)隨著視黃醒脫氫酶(retinaldehyde dehydrogenase, RALDH)的表達(dá)上升以及視黃醇(Retinoicacid, RA)分泌量的增加，LPDCs的功能可出現(xiàn)由“促炎”向“抑炎”的雙向轉(zhuǎn)變。結(jié)合嚴(yán)重創(chuàng)傷打擊后機(jī)體出現(xiàn)的“SIRS “及”CARS “的差異表現(xiàn)，我們推測(cè)腸道LPDCs “指揮方向”的變化可能在其中起到至關(guān)重要的作用，而其規(guī)律可能為=LPDCs內(nèi)RALDH的表達(dá)以及RA分泌的量變導(dǎo)致了 LPDCs誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化的功能發(fā)生“質(zhì)變”，隨著其細(xì)胞內(nèi)RA的增加，免疫監(jiān)督(SIRS)向免疫逃逸(CARS)方向發(fā)展，腸道局部免疫及全身免疫平衡狀態(tài)由此被打破。而RALDH及RA的合成亦是在TLR5_Myd88及其下游信號(hào)通路所控制。故推測(cè)，Myd88相關(guān)信號(hào)通路是LPDCs功能狀態(tài)的主要決定因素，在相關(guān)的研究中亟需一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，即樹突狀細(xì)胞選擇性的不表達(dá)Myd88分子的小鼠，以此搭載與多種疾病模型進(jìn)行體內(nèi)對(duì)照研究，以高效地揭示上述推測(cè)的真實(shí)性及機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是要克服上述技術(shù)的不足，而提供一種選擇性敲除樹突狀細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案:這種選擇性敲除樹突狀細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法，包括步驟如下:(I)、選擇CD 11 c-cr e與條件性My d88基因敲除小鼠；構(gòu)建引物，分別對(duì)兩種小鼠通過PCR技術(shù)進(jìn)行基因型鑒定；(2)、將上述兩種小鼠進(jìn)行雜交；(3)、對(duì)雜交的小鼠后代進(jìn)行基因型鑒定，篩選得到樹突狀細(xì)胞內(nèi)Myd88分子選擇性敲除的雜交小鼠 myd88F1°x/F1°x; Cdllc-cre。對(duì)上述兩種基因型的小鼠的雜交后代進(jìn)行基因型鑒定，以引物I和引物2，引物4、引物5、引物6和引物7同時(shí)陽(yáng)性的小鼠即為myd88FWF1°x;Cdllc-cre小鼠；其中引物I的DNA 序列為 GTT GTG TGT GTC CGA CCG T (序列表 I )，引物 2 的 DNA 序列為 GTC AGA AACAAC CAC CAC CAT GC (序列表 2)，引物 4 的 DNA 序列為 GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC(序列表3)，引物5的DNA序列為GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT (序列表4)，引物6的DNA 序列為 CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT (序列表 5)，引物 7 的 DNA 序列為 GTA GGTGGA AAT TCT AGC ATC ATC C (序列表 6)。本發(fā)明有益的效·果是:本發(fā)明構(gòu)建的樹突狀細(xì)胞內(nèi)Myd88分子選擇性敲除的雜交小鼠的生物學(xué)特征為全身樹突狀細(xì)胞不表達(dá)Myd88分子，其可較好地應(yīng)用于樹突狀細(xì)胞免疫效應(yīng)及分子機(jī)制的活體研究。


圖1是本發(fā)明鑒定野生型和myd88FWF1°x小鼠示意圖；圖2是本發(fā)明鑒定野生型和Cdllc-cre轉(zhuǎn)基因小鼠示意具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合舉例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的舉例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明構(gòu)建該雜交小鼠的方法包括以下步驟:I)自美國(guó) jackson 公司購(gòu)得 CDllc-cre (Name:B6.FVB(Cg)-Tg(Neurog3~cre)ClAble/J)與條件性Myd88(B6.129P2-Myd88tmlDefr/J)基因敲除小鼠；根據(jù)公司提供的信息構(gòu)建引物，分別對(duì)兩種小鼠進(jìn)行基因型鑒定(PCR技術(shù))。2)將上述兩種小鼠進(jìn)行雜交；3)對(duì)雜交的小鼠后代進(jìn)行基因型鑒定，篩選得到樹突狀細(xì)胞內(nèi)Myd88分子選擇性敲除的雜交小鼠(myd88Flox/Flox; Cd 11 c-cre )。(一)小鼠基因組DNA的制備1、剪15天內(nèi)小鼠尾巴尖約0.5cm放入Eppendorf管中。2、每管加入裂解緩沖液 500ul DNAiso (takara DNAiso Lot:B101_l)。3、放置在常溫250rpm震蕩過夜。4、待組織溶解完全，向每管加入2倍體積乙醇，搖勻后室溫放置，5min。5、待絮狀沉淀產(chǎn)生,迅速顛倒幾次離心管,5000rpm, 5min,去上清。6、用70%乙醇洗滌沉淀兩次，洗完后置空氣中干燥。7、加滅菌水，瓊脂糖膠電泳鑒定，定量。8、室溫至DNA完全溶解后(24_48hr)可用于PCR分析。(二)PCR鑒定小鼠的基因型引物I (GTT GTG TGT GTC CGA CCG T)和引物 2 (GTC AGA AAC AAC CAC CAC CATGC)能夠鑒定野生型和myd88F1°x/F1°x小鼠，這對(duì)引物能從條件性基因敲除小鼠中擴(kuò)增出大小為353bp和/或266bp的條帶用于鑒定野生型和轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠。結(jié)果見圖1。用引物4 (GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC)、引物 5 (GTG AAA CAG CAT TGCTGT CAC TT)、引物 6 (CTA GGC CAC` AGA ATT GAA AGA TCT)和引物 7 (GTA GGT GGA AATTCT AGC ATC ATC C)來鑒定Cdllc-cre的野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠，這對(duì)引物能從轉(zhuǎn)基因小鼠中擴(kuò)增出大小為IOObp和/或324bp的條帶，但不能區(qū)分雜合子和純合子。結(jié)果見圖2。(三)小鼠雜交和基因型篩選myd88F1°x/F1°x;Cdllc-cre小鼠對(duì)上述兩種基因型的小鼠的雜交后代進(jìn)行基因型鑒定，以引物1(GTT GTG TGT GTCCGA CCG T)和引物 2 (GTC AGA AAC AAC CAC CAC CAT GC)和引物 4 (GCG GTC TGG CAGTAA AAA CTA TC)、引物 5 (GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT)、引物 6 (CTA GGC CAC AGAATT GAA AGA TCT)和引物 7 (GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C)同時(shí)陽(yáng)性的小鼠即為myd88Flox/Flox;Cdllc-cre 小鼠。所獲得的myd88FWF1°x;Cdllc-cre 小鼠:I)全部通過基因型鑒定；railc-cre:Myd88f/f為純合子的基因型，子代均可用于實(shí)驗(yàn)，目前正處于擴(kuò)群階段。2)該種小鼠的生育、生產(chǎn)、發(fā)育及生殖等基本生命現(xiàn)象正常，可用于體內(nèi)對(duì)照試驗(yàn)。3)該種小鼠的免疫功能正常，可用于免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)制研究。
權(quán)利要求
1.一種選擇性敲除樹突狀細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法，其特征在于:包括步驟如下: (1)、選擇⑶llc-cre與條件性Myd88基因敲除小鼠；構(gòu)建引物，分別對(duì)兩種小鼠通過PCR技術(shù)進(jìn)行基因型鑒定； (2)、將上述兩種小鼠進(jìn)行雜交； (3)、對(duì)雜交的小鼠后代進(jìn)行基因型鑒定，篩選得到樹突狀細(xì)胞內(nèi)Myd88分子選擇性敲除的雜交小鼠 myd88F1 wf1qX ; Cdllc-cre。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選擇性敲除樹突狀細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法，其特征在于:對(duì)上述兩種基因型的小鼠的雜交后代進(jìn)行基因型鑒定，以引物I和引物2，引物4、引物5、引物6和引物7同時(shí)陽(yáng)性的小鼠即為myd88FWF1°x;Cdllc-cre小鼠；其中引物 I 的 DNA 序列為 GTT GTG TGT GTC CGA CCG T，引物 2 的 DNA 序列為 GTC AGA AAC AACCAC CAC CAT GC，引物 4 的 DNA 序列為 GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC，引物 5 的 DNA 序列為 GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT，引物 6 的 DNA 序列為 CTA GGC CAC AGA ATT GAAAGA TCT，引物 7 的 DNA 序列為 GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種選擇性敲除樹突狀細(xì)胞內(nèi)Myd88分子的雜交小鼠的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)自美國(guó)jackson公司購(gòu)得CD11c-cre(樹突狀細(xì)胞工具鼠)與條件性Myd88基因敲除小鼠；2)將上述兩種小鼠進(jìn)行雜交；3)構(gòu)建引物，對(duì)雜交的小鼠后代進(jìn)行基因型鑒定，篩選得到樹突狀細(xì)胞內(nèi)Myd88分子選擇性敲除的雜交小鼠(myd88Flox/Flox;Cd11c-cre)。本發(fā)明有益的效果本發(fā)明構(gòu)建的樹突狀細(xì)胞內(nèi)Myd88分子選擇性敲除的雜交小鼠的生物學(xué)特征為全身樹突狀細(xì)胞不表達(dá)Myd88分子，其可較好地應(yīng)用于樹突狀細(xì)胞免疫效應(yīng)及分子機(jī)制的活體研究。
文檔編號(hào)A01K67/027GK103229751SQ201310173868
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者梁廷波, 張勻, 白雪莉, 陳偉, 徐濤, 張劍, 繆小燕 申請(qǐng)人:梁廷波