專利名稱：一種柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及生物能源植物柳枝稷的組織培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
柳枝稷(英文名Switchgrass,拉丁名n'rgai應(yīng)),又稱“能源草”,因其栽培技術(shù)簡單，適應(yīng)性廣，防風(fēng)固沙能力強(qiáng)，耐貧瘠，生物學(xué)產(chǎn)量高，被國際上確定為生產(chǎn)染料乙醇的首選生物能源植物，并投入了大量的人力、物力進(jìn)行研究開發(fā)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對能源植物進(jìn)行遺傳改良是現(xiàn)代基因工程技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域運(yùn)用的新突破。柳枝稷作為一種重要的新型生物能源植物，已經(jīng)成為基因轉(zhuǎn)化的主要目標(biāo)之一。其中，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強(qiáng)柳枝稷的抗逆性，提高光和效率，增加生物學(xué)產(chǎn)量，降低木質(zhì)素含量和提高乙醇產(chǎn)率等方面已成為目前的研究熱點(diǎn)并展示出良好的應(yīng)用前景。然而，與大多數(shù)禾本科植物的組織培養(yǎng)相似，柳枝稷在人工誘導(dǎo)愈傷組織方面也存在著很多困難。因此，加強(qiáng)柳枝稷的通過愈傷組織再生植株的體外繁殖方法的研究就很有必要，對柳枝稷的生物技術(shù)研究將起到很大的促進(jìn)作用。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有柳枝稷體外繁殖技術(shù)存在的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種柳枝稷的體外繁殖方法，以拓寬柳枝稷組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的基因型范圍，以實(shí)現(xiàn)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對能源植物進(jìn)行遺傳改良，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代基因工程技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的新突破。本發(fā)明的目的是這樣 實(shí)現(xiàn)的:一種采用柳枝稷種子組織培養(yǎng)育苗方法，其特種在于它包括以下工藝步驟:
選取100顆飽滿的種子(鮮重為0.225 g，選取的種子長度在0.2 0.5 cm，寬度為0.Γ0.2 cm)做為實(shí)驗(yàn)使用材料，
(I)、種子處理
a將柳枝稷種子6%(v/v) NaClO中浸泡2 h，按每鮮重為0.225 g柳枝稷種子放入5^10 ml 6%(v/v) NaClO中，期間不停攪拌；b用蒸餾水清洗3遍后，于暗處靜置過夜；
c按每鮮重0.225 g柳枝稷種子用5 10 ml 6% (v/v) NaClO浸泡20 min ； d將種子清洗后，在無菌條件下，將其接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)。(2)、愈傷組織及芽的誘導(dǎo)
將接種的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱，每天光照14 h，光照強(qiáng)度1400-1500 lux，溫度23 V±1 V，無菌條件下培養(yǎng):Γ5 d后，種子開始萌動(dòng)，I周后開始有愈傷形成，并伴隨有新芽或者新葉的形成，誘導(dǎo)愈傷選用培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補(bǔ)充2，4-D 5 mg/L,6-BA 1.2mg/L, NAA 1.0 mg/L，pH 為 5.8。(3)、生根培養(yǎng)
4周后，在無菌條件下將新長成的愈傷組織轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基選用MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補(bǔ)充2，4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L,NAA 1.5 mg/L，pH為 5.8。溫度 23 °C ± I°C，光照14 h，光強(qiáng)150(T2000 lux, 7^10 d后開始生根，且速度較快，2周后，可將生根的柳枝稷苗進(jìn)行過渡栽培。其中，步驟(I) d中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加2，4-D 5飛mg/L，6-BA 1.2 1.5 mg/L, NAA 1.(Tl.2 mg/L, pH 為 5.8。本發(fā)明的研究方法通過具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了描述，相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及結(jié)果:
本發(fā)明采用柳枝稷種子組織培育方法，既可繁殖優(yōu)良品種，又可從種子實(shí)生苗中選取優(yōu)異的株苗用作遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，避免花費(fèi)大量金錢和精力。本發(fā)明方法可行，操作簡單，可以為人們進(jìn)行雜交育種及遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，提供了一種有效的途徑。縮短了柳枝稷的培養(yǎng)周期，利用正交實(shí)驗(yàn)，摸索出能誘導(dǎo)柳枝稷愈傷組織形成的最適激素配比，能在較大程度上促進(jìn)愈傷及生芽、生根的形成，縮短柳枝稷的培養(yǎng)周期。


圖1為接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上3 d后萌動(dòng)的種子照片；
圖2為接種10 d后種子形成愈傷及胚芽的照片；
圖3為接種14 d后 在培養(yǎng)基上形成大量分化組織的照片；
圖4為在生根培養(yǎng)基上形成的生根的柳枝稷的照片；
圖5為煉苗的照片。以上附圖為實(shí)施例一中的實(shí)驗(yàn)效果圖。
具體實(shí)施方式
:
下面結(jié)合實(shí)例和附圖詳細(xì)說明
6-BA 6-b 節(jié)氨基嘌吟(6-BenzylaminoPurine)
NAA a_ 蔡乙酸(1-NaPhthylaceticacid)
2, 4-D 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid)
實(shí)施例一:
本發(fā)明選擇柳枝稷種子為外植體，在MS培養(yǎng)基上添加不同的激素配比，誘導(dǎo)愈傷組織，分化及生根誘導(dǎo)。具體生產(chǎn)過程為:
選取外植體
選取成熟飽滿的柳枝稷種子100顆(0.225 g)。愈傷誘導(dǎo)及芽分化
將種子置于培養(yǎng)皿中，采用10 ml 6% (v/v) NaClO進(jìn)行表面消毒2 h，期間置于搖床上不停攪拌；
棄去次氯酸鈉，清洗干凈，用蒸餾水浸泡過夜；
用10 ml 6%(v/v)的NaClO消毒20 min,無菌條件下放入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基配方為 MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加 2，4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L, NAA 1.0 mg/L, pH 為 5.8。
24°C，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1(T15 d誘導(dǎo)獲得愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)3(T40 d時(shí)，可從愈傷組織中再生出大量的叢生芽，具體實(shí)驗(yàn)效果見圖1，圖2和圖3。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)，100顆柳枝稷成熟種子(0.225 g)誘導(dǎo)芽分化率可達(dá)到90%以上。叢生芽生根培養(yǎng)
轉(zhuǎn)移分化成芽的愈傷組織至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，240C，光照條件下培養(yǎng)2(T30 d，誘導(dǎo)生根，得到再生植株(圖4)。其中，生根培養(yǎng)基配方為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加2，4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L, NAA 1.5 mg/L，pH 為 5.8。移栽至溫室
打開培養(yǎng)瓶封口，將再生植株煉苗4飛d，移栽至溫室即可(圖5)。
實(shí)施例二:
本發(fā)明選擇柳枝稷種子為外植體，在MS培養(yǎng)基上添加不同的激素配比，誘導(dǎo)愈傷組織，分化及生根誘導(dǎo)。具體生產(chǎn)過程為:
(I)選取外植體 選取成熟飽滿的柳枝稷種子100顆(0.225 g)。

(2)愈傷誘導(dǎo)及芽分化
將種子置于培養(yǎng)皿中，采用5 ml 6%(v/v)的NaClO表面消毒2 h，期間置于搖床上不停攪拌；
棄去次氯酸鈉，清洗干凈，用蒸餾水浸泡過夜；
用5 ml 6% (v/v)的NaClO鈉消毒20 min,無菌條件下放入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基配方為 MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加 2，4-D 6 mg/L，6-BA 1.5 mg/L, NAA 1.2 mg/L, pH 為 5.8。24°C，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 20 d誘導(dǎo)獲得愈傷組織，分化培養(yǎng)，30^40 d時(shí)，可從愈傷組織中再生出大量的叢生芽。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)，100顆柳枝稷成熟種子(0.225 g)誘導(dǎo)芽分化率只能達(dá)到40%左右。(3)叢生芽生根培養(yǎng)
轉(zhuǎn)移分化成芽的愈傷組織至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，240C，光照條件下培養(yǎng)2(T30 d，誘導(dǎo)生根，得到再生植株。其中，生根培養(yǎng)基配方為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加2，4-D 5mg/L, 6-BA 1.2 mg/L, NAA 1.5 mg/L，pH 為 5.8。(4)移栽至溫室
打開培養(yǎng)瓶封口，將再生植株煉苗4飛d，移栽至溫室即可。
權(quán)利要求
1.一種柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗方法，按照下述步驟進(jìn)行: (1)種子處理 a將柳枝稷種子在6% v/v NaClO中浸泡2 h，按每鮮重為0.225 g柳枝稷種子放入5-10 ml 6% v/v NaClO中，期間不停攬拌； b用蒸餾水清洗3遍后，于暗處靜置過夜； c按每鮮重為0.225 g柳枝稷種子用5-10 ml 6% v/v NaClO浸泡20 min ； d將種子清洗后，在無菌條件下，將其接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng); (2)愈傷組織及芽的誘導(dǎo) 將接種的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱，每天光照14 h，光照強(qiáng)度1400-1500 lux，溫度23 V±1 V，無菌條件下培養(yǎng)3-5 d后，種子開始萌動(dòng)，I周后開始有愈傷形成，并伴隨有新芽或者新葉的形成，誘導(dǎo)愈傷選用培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補(bǔ)充2，4-D 5 mg/L,6-BA 1.2mg/L, NAA 1.0 mg/L，pH 為 5.8 ; (3)生根培養(yǎng) 4周后，在無菌條件下將新長成的愈傷組織轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，溫度23 °C±1 V,光照14 h，光強(qiáng)150(T2000 lux, 7-10 d后開始生根，且速度較快，2周后，可將生根的柳枝稷苗進(jìn)行過渡栽培。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗方法，其特征在于步驟(l)d中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加2，4-D 5-6 mg/L,6-BA 1.2-1.5 mg/L，NAA1.(Tl.2 mg/L, pH 為 5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗方法，其特征在于步驟(3)中所述生根培養(yǎng)基選用MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補(bǔ)充2，4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L, NAA 1.5 mg/L，pH為 5.8。
4.一種用于權(quán)利要求1所述的柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其成分為 MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加 2，4-D 5-6 mg/L，6-BA 1.2-1.5 mg/L, NAA 1.0-1.2 mg/L，pH 為5.8ο
5.一種用于權(quán)利 要求1所述的柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗的生根培養(yǎng)基，其成分為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充 2，4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L, NAA 1.5 mg/L，pH 為 5.8。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗方法，特別是涉及生物能源植物柳枝稷的組織培養(yǎng)技術(shù)。本發(fā)明按以下工藝步驟進(jìn)行種子處理、愈傷組織及芽的誘導(dǎo)、生根培養(yǎng)。本發(fā)明采用柳枝稷種子組織培育方法，既可繁殖優(yōu)良品種，又可從種子實(shí)生苗中選取優(yōu)異的株苗用作遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，避免花費(fèi)大量金錢和精力。本發(fā)明方法可行，操作簡單，可以為人們進(jìn)行雜交育種及遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，提供了一種有效的途徑。
文檔編號A01C1/00GK103238519SQ20131017800
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月14日
發(fā)明者楊冉, 黃萍, 杜道林, 楊淞惠, 祁珊珊 申請人:江蘇大學(xué)