一種中藥發(fā)酵生產(chǎn)靈芝的新方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用中藥發(fā)酵生產(chǎn)靈芝的新方法，其特征包括以下幾個(gè)方面：靈芝菌種的篩選、靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基的制備、靈芝發(fā)酵條件的優(yōu)化、靈芝中活性成分的分析研究。本發(fā)明以深層發(fā)酵為基礎(chǔ)，優(yōu)化出一種使靈芝生長周期短、活性成分高的新方法，突破了現(xiàn)有常規(guī)發(fā)酵的途徑，豐富了藥用靈芝的活性成分及來源。本發(fā)明充分利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，得到的靈芝既保留了原來的特性，又提高了靈芝的療效。
【專利說明】一種中藥發(fā)酵生產(chǎn)靈芝的新方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥生物轉(zhuǎn)化的應(yīng)用研究領(lǐng)域。具體為一種利用中藥發(fā)酵生產(chǎn)靈芝的新方法。

【背景技術(shù)】
[0002]靈芝是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，是一種藥用價(jià)值極高的真菌類中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其分為赤芝、黑芝、青芝、白芝、黃芝和紫芝。明代著名醫(yī)學(xué)家李時(shí)珍在《本草剛目》中對靈芝有比較詳盡的闡述，但由于科學(xué)條件和靈芝數(shù)量的限制，只能通過臨床實(shí)踐對其藥用價(jià)值做個(gè)大致了解，但其中的活性成分、作用機(jī)理、藥理作用并不清楚。最近幾十年，由于人工栽培技術(shù)的廣泛應(yīng)用和科學(xué)醫(yī)療水平的提高，人們對靈芝的成分及作用機(jī)理做了大量研究。研究表明，靈芝中主要的活性成分是靈芝多糖，它具有提高人體免疫力、抑制腫瘤、抗血栓、降血糖和抗衰老作用；另外靈芝中還含有甘露醇、麥角固醇、腺嘌呤、尿嘧啶等多種藥用有效成分，這些物質(zhì)對治療和預(yù)防人類的常見疾病有著重大意義。
[0003]靈芝是中藥中的瑰寶，在實(shí)現(xiàn)人工栽培之前，人們對于靈芝的利用受地域的限制，并且產(chǎn)量很低，無法滿足人們?nèi)粘５男枰ｋS著社會(huì)的不斷發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們發(fā)明了段木栽培生產(chǎn)靈芝，但此方法需要大量的木材，經(jīng)濟(jì)上考慮，成本太高；同時(shí)也不利于生態(tài)環(huán)境的保護(hù)，故此法很快被淘汰。之后人們又發(fā)明了代料栽培，其取材于農(nóng)林副產(chǎn)品的下腳料，經(jīng)濟(jì)成本和環(huán)境成本都得到明顯降低，但是生產(chǎn)周期比較長，也不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004]與以上栽培技術(shù)不同，利用發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝菌絲可利用調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件等在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出大量的靈芝菌絲，所得菌絲與天然靈芝菌絲和人工栽培靈芝菌絲成分相差無幾，這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是易于連續(xù)生產(chǎn)、周期短、產(chǎn)量高，切十分易于工業(yè)化。但常規(guī)的發(fā)酵方法所得靈芝菌絲活性成分與天然菌絲相差不大，且菌絲產(chǎn)量不高，本發(fā)明篩選出生長周期較短的菌種，之后優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基及條件，并在發(fā)酵過程中添加一種或者集中中藥的混合成分，明顯提高的菌絲產(chǎn)量和菌絲中活性成分的含量，除此之外，還使靈芝中含有了所添加中藥中的活性成分，進(jìn)一步提高了靈芝的藥用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開了一種利用中藥發(fā)酵生產(chǎn)靈芝的新方法，其特征包括以下幾個(gè)方面:靈芝菌種的篩選、靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基的制備、靈芝發(fā)酵條件的優(yōu)化、靈芝中活性成分的分析研究。本發(fā)明以深層發(fā)酵為基礎(chǔ)，優(yōu)化出一種使靈芝生長周期短、活性成分高的新方法，突破了現(xiàn)有常規(guī)發(fā)酵的途徑，豐富了藥用靈芝的活性成分及來源。本發(fā)明充分利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，得到的靈芝既保留了原來的特性，又提高了靈芝的療效。發(fā)明以傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝為基礎(chǔ)，利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)優(yōu)化名貴中藥才，提高并增加其藥效成分，促進(jìn)名貴中藥的合理使用和開發(fā)。
[0006]實(shí)施方式通過以下實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述實(shí)施例1
利用8%麥麩粉，5%的黃豆餅粉，0.20%的磷酸二氫鉀和0.15 %的硫酸鎂做培養(yǎng)基，將菌株的斜面菌種接到液體菌種培養(yǎng)基中，10mL三角瓶裝液量30mL，滅菌前調(diào)至pH為5.5，于28°C 200rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5d得液體菌種。按12%接種量接到深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，于相同條件下培養(yǎng)6d。發(fā)酵液經(jīng)兩層紗布過濾，菌絲體經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個(gè)菌株設(shè)三次重復(fù)，測定結(jié)果3次重復(fù)的平均值。
[0007]供試菌株包括:靈芝G9、靈芝G8、赤芝、黑芝、紫芝、甜芝；
實(shí)施例2
利用I中篩選出的菌株對發(fā)酵培養(yǎng)基各成分的濃度進(jìn)行優(yōu)化麥麩粉做4%、6%、8%、10%、12%五個(gè)濃度；在做麥麩濃度的過程中，其余濃度均按I中培養(yǎng)基濃度。
[0008]黃豆餅粉做1%、3%、5%、7%、9%五個(gè)濃度；在做黃豆餅粉濃度時(shí)，將確定的8%的麥麩加入到培養(yǎng)基中，其余同I中培養(yǎng)基；
磷酸二氫鉀做0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%五個(gè)濃度，在做磷酸二氫鉀濃度時(shí)，將確定的8%的麥麩和5%的黃豆餅粉加入到培養(yǎng)基中，其余同I中培養(yǎng)基；
硫酸鎂0.05%,0.10%,0.15%、0.20%,0.25%五個(gè)濃度，在做硫酸鎂濃度時(shí)，將確定的8%的麥麩、5%的黃豆餅粉和0.2%的磷酸二氫鉀加入到培養(yǎng)基中。
[0009]在以上液體培養(yǎng)基中加入1%、2%、3%、4%、5%人參粉，看菌絲生長情況及菌絲中活性成分的含量。
[0010]將菌株的斜面菌種接到以上配好的液體菌種培養(yǎng)基中，10mL三角瓶裝液量30mL,滅菌前調(diào)至pH為5.5，于28V 200rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5d得液體菌種。按12%接種量接到深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，于相同條件下培養(yǎng)6d。發(fā)酵液經(jīng)兩層紗布過濾，菌絲體經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個(gè)菌株設(shè)三次重復(fù)，測定結(jié)果3次重復(fù)的平均值。
[0011]實(shí)施例3
利用I中菌種和2中培養(yǎng)基對對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化
培養(yǎng)時(shí)間:將菌株的斜面菌種接到以上配好的液體菌種培養(yǎng)基中，10mL三角瓶裝液量30mL，滅菌前調(diào)至pH為5.5，于28°C 200rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5d得液體菌種。按12%接種量接到深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，于相同條件下分別培養(yǎng)5d、5.5d、6d、6.5d、7d。發(fā)酵液經(jīng)兩層紗布過濾，菌絲體經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個(gè)菌株設(shè)三次重復(fù)，測定結(jié)果3次重復(fù)的平均值。
[0012]培養(yǎng)溫度:將菌株的斜面菌種接到以上配好的液體菌種培養(yǎng)基中，10mL三角瓶裝液量30mL，滅菌前調(diào)至pH為5.5，分別于26 °C、27 V、28 °C、29 V、30 V 200rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5d得液體菌種。按12%接種量接到深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，于相同條件下培養(yǎng)6d。發(fā)酵液經(jīng)兩層紗布過濾，菌絲體經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個(gè)菌株設(shè)三次重復(fù)，測定結(jié)果3次重復(fù)的平均值。
[0013]初始pH:將菌株的斜面菌種接到以上配好的液體菌種培養(yǎng)基中，10mL三角瓶裝液量30mL,滅菌前調(diào)至pH為4.5,5.0,5.5,6.0,6.5，于28°C 200rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5d得液體菌種。按12%接種量接到深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，于相同條件下培養(yǎng)6d。發(fā)酵液經(jīng)兩層紗布過濾，菌絲體經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個(gè)菌株設(shè)三次重復(fù)，測定結(jié)果3次重復(fù)的平均值。
[0014]攪拌轉(zhuǎn)速:將菌株的斜面菌種接到以上配好的液體菌種培養(yǎng)基中，10mL三角瓶裝液量 30mL,滅菌前調(diào)至 pH 為 5.5,于 28°C lOOrpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5d得液體菌種。按12%接種量接到深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，于相同條件下培養(yǎng)6d。發(fā)酵液經(jīng)兩層紗布過濾，菌絲體經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個(gè)菌株設(shè)三次重復(fù)，測定結(jié)果3次重復(fù)的平均值。
[0015]接種量:將菌株的斜面菌種接到以上配好的液體菌種培養(yǎng)基中，10mL三角瓶裝液量30mL，滅菌前調(diào)至pH為5.5，于28°C 200rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5d得液體菌種。按8%、10%、12%、14%、16%接種量接到深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，于相同條件下培養(yǎng)6d。發(fā)酵液經(jīng)兩層紗布過濾，菌絲體經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個(gè)菌株設(shè)三次重復(fù)，測定結(jié)果3次重復(fù)的平均值。
[0016]實(shí)施例4
使用均質(zhì)機(jī)勻漿后，用苯酚硫酸法測定靈芝多糖的含量；用考馬斯亮藍(lán)法測定菌絲中總蛋白含量；通過顯微鑒別對靈芝菌質(zhì)檢測；薄層色譜法檢測靈芝中的人參皂苷Rg3和Rh2 ;用高效液相色譜測定人參皂苷Rg3和Rh的含量。
【權(quán)利要求】
1.一種利用中藥發(fā)酵生產(chǎn)靈芝的新方法，其特征包括以下幾個(gè)方面: (I)靈芝菌種的篩選:配制液體篩選培養(yǎng)基，將不同供試靈芝菌株斜面接種到篩選液體培養(yǎng)基中，反復(fù)篩選3-5次，選出子實(shí)體生長最濃密的菌株；所述的液體培養(yǎng)基主要成分為:麥麩粉、豆餅粉、鉀鹽和鎂鹽；供試菌株包括:靈芝G9、靈芝G8、赤芝、黑芝、紫芝、甜芝；(2)按照步驟I中所述的培養(yǎng)基配方，對各成分濃度進(jìn)行優(yōu)化，之后在發(fā)酵液中加入一種或幾種中藥，并對其濃度優(yōu)化，按照最優(yōu)方案配制培養(yǎng)基，滅菌、冷卻備用；(3)將步驟I篩選出的菌株接種到步驟2中配好的培養(yǎng)基中，之后對發(fā)酵的條件進(jìn)行優(yōu)化；優(yōu)化的發(fā)酵條件包括:培養(yǎng)時(shí)間、初始pH、培養(yǎng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、接種量；(4)按照步驟2中配置的培養(yǎng)基及3中優(yōu)化的培養(yǎng)條件對活性成分進(jìn)行分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用中藥發(fā)酵生產(chǎn)靈芝的新方法，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一種或幾種中藥，進(jìn)而促進(jìn)靈芝活性成分的合成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用中藥發(fā)酵生產(chǎn)靈芝的新方法，其特征在于，靈芝的發(fā)酵周期相對較短，其周期為6d。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用中藥發(fā)酵生產(chǎn)靈芝的新方法，其特征在于，靈芝中活性成分含量較野生靈芝中的含量提高50%。
【文檔編號(hào)】A01G1/04GK104335817SQ201310341006
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月7日
【發(fā)明者】張海軍, 郭海宏, 趙彥偉 申請人:山東百多安醫(yī)療器械有限公司