一種抗菌肽及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開的一種抗菌肽，其基因序列為抗菌肽Snakin中無信號肽的基因編碼序列。還公開了制備抗菌肽的方法，包括如下步驟，(1)提取辣椒葉片組織的總RNA，并采用反轉錄酶獲得第一鏈cDNA備用；(2)經過PCR技術克隆得到抗菌肽Snakin中無信號肽的基因編碼序列，記為Sn基因序列；(3)形成重組質粒；(4)篩選出重組成功的質粒，記為pET-Sn；(5)將上步重組成功的質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，并采用IPTG進行誘導表達，同時分泌出蛋白質；(6)對(5)步分泌出蛋白的感受態(tài)細胞進行超聲波破碎，離心后收集上清液中的抗菌肽。本發(fā)明的優(yōu)點為，得到了不含信號肽的抗菌肽，該抗菌肽對南方根結線蟲有滅殺作用。
【專利說明】一種抗菌肽及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體是一種抗線蟲肽及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]植物寄生線蟲是農業(yè)生產中的一項重要病害，是世界性的病害，破壞性強、寄主種類多，分布范圍廣泛，防治難度極大，嚴重阻礙農業(yè)的持續(xù)發(fā)展，每年給全球農業(yè)造成1，570億美元的經濟損失。
[0003]目前，植物寄生線蟲的防治通?；瘜W殺線蟲劑、栽培技術和培育抗性品種等措施。但由于化學殺線蟲藥劑的食品安全及環(huán)境問題，其使用受到嚴格的控制。根結線蟲寄主范圍可以達到3000多種，主要危害植物的根部，因此通過輪作方法防治根結線蟲是非常有限的。生物防治具有廣闊的生物資源潛力，且對環(huán)境及人具有一定的安全性，但是生物防治效果不穩(wěn)定且，易受環(huán)境影響，不易商品化，目前只有極少數的菌種用于生防。采用抗線蟲基因是防治植物寄生性線蟲的高效措施，但是現在發(fā)現的抗線蟲基因數量很少，資源有限，且面臨著線蟲毒性種群分化導致抗性極易喪失等問題。Snakin為新型的植物抗菌肽，并已經發(fā)現其對植物寄生性線蟲具有高效的防治作用，且具有生物安全、分子量小、易于遺傳改造等特點，在防治植物寄生性線蟲方面顯示出獨特的優(yōu)勢。因此，發(fā)掘和克隆植物中的Snakin家族基因為新型轉基因抗線蟲新品種培育提供重要的基因來源和技術支撐，對保障我國農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要戰(zhàn)略意義。
[0004]植物抗菌肽(Antimicrobial protein AMP)是一類分子量小、呈堿性、富含半胱氨酸的短肽，為重要的蛋白酶抑制劑，通常在很低的濃度下(<106m)就能表現出廣譜抗菌活性，在植物的防御反應中起著重要的作用，現在已經有超過500抗菌肽被報導。Snakin是一種新型的植物抗菌肽，通常富含半胱氨酸，分量小于llKDa，具有二硫鍵維持的穩(wěn)定球形分子結構，具有與赤霉素誘 導蛋白及某些蛇毒素具有相似結構。Snakin蛋白屬于GASA超家族，具有赤霉素誘導蛋白 的Pfam，他們在茄科植物中具有較高表達量。遺傳分析證實Snakin家族包含三個亞家族，現在已經報道的相關基因有多個基因，分別來自不同的植物如馬鈴薯(Solanum tuberosum)、擬南芥(Arabidopsis)、辣椒(Capsicum annuum),以及番爺(Solanum Iycopersicum)。
[0005]Snakin蛋白為既可以是植物本身組成型表達的一個防御蛋白，也可以被生物及非生物因素誘導表達的蛋白。無論是離體還是活體條件下Snakin蛋白都具有抗菌活性，例如抗細菌(Clavibacter michiganensis)及真菌作用。同時，Snakin蛋白處理根結線蟲及秀麗桿線蟲，發(fā)現證實該蛋白可以是秀麗桿線蟲活性降低，生長停止直至死亡。通過基因組掃描可以發(fā)現在植物中Snakin家族基因是廣泛存在的，且受生物及非生物誘導表達的第二亞家族基因數量要遠遠高于第1、3亞家族。說明在植物中少數Snakin基因是組成型表達，二大多數為誘導表達，也說明Snakin家族基因在抗線蟲作用中具有重要的挖掘潛力。同時，Snakin基因與其他抗病基因具有很好的融合性，Snakin與植物防御素、Bt蛋白及多基因融合提供了支持，為提高寄主的抗植物寄生性線蟲效果及其持久利用奠定了基礎。
【發(fā)明內容】

[0006]基于上述原因，本發(fā)明提供了一種抗菌肽及其制備方法與應用，在不改變已知的辣椒抗菌肽Snakin氨基酸序列的前提下，克隆得到無信號肽的基因序列，這樣得到的抗菌肽只含有成熟的抗菌肽，分子量更小，經過驗證該抗菌肽可以用于防治南方根結線蟲。
[0007]為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為，本發(fā)明得到的一種新的抗菌肽，其基因序列為抗菌肽Snakin中無信號肽的基因編碼序列,該基因序列為:a1:tcaaactg atcatgttgc cagcaatgct atttctgaag ctgcttattc ctacaagaaa atcgattgtg ggggaaagtgttcagcgagg tgccgattat cgtcaaggcc aagattgtgt aagagggcat gtggaacttgctgtgctaga tgcaactgtg ttcctcctgg cacttctggc aacactcaga cttgcccttgctatgccaat atgactactc acggcaacag acgcaaatgc cct taa。該基因含有 246 個核昔酸，編碼多肽含有81個氨基酸，分子量為8.7KDa,無辣椒抗菌肽Snakin信號肽序列，為成熟的抗菌肽基因序列，經過試驗驗證，可以對南方根結線蟲起到滅殺``的作用。
[0008]本發(fā)明還公開了一種制備所述抗菌肽的方法，包括如下步驟，(I)采用trizol方法提取辣椒葉片組織的總RNA，并采用反轉錄酶獲得第一鏈cDNA備用；
[0009](2)根據已知抗菌肽Snakin基因的序列，設計上游引物、下游引物，以第一鏈cDNA為模板，經過PCR技術克隆得到抗菌肽Snakin中無信號肽的基因編碼序列，并進行測序得到全長的基因序列，記為Sn基因序列；所述上游引物序列為5' ATT CAA ACT GAT CAT GTTGC3/，下游引物序列為
【權利要求】
1.一種抗菌肽，其特征在于，該抗菌肽的基因序列為抗菌肽Snakin中無信號肽的基因編石馬序列，該基因序列為:
2.一種制備權利要求1所述抗菌肽的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟，⑴采用trizol方法提取辣椒葉片組織的總RNA，并采用反轉錄酶獲得第一鏈cDNA備用； (2)根據已知抗菌肽Snakin基因的序列，設計上游引物、下游引物，以第一鏈cDNA為模板，經過PCR技術克隆得到抗菌肽Snakin中無信號肽的基因編碼序列，并進行測序得到全長的基因序列，記為Sn基因序列；所述上游引物序列為Y ATT CAA ACT GAT CAT GTTGC3/，下游引物序列為 5' TTA AGG GCA TTT GCG TCT3/ ； (3)將(2)步得到的Sn基因序列克隆到原核表達載體pET28a(+)形成重組質粒； (4)再將(3)步得到的全部重組質粒轉化到DH5ci細菌感受態(tài)細胞中，從中篩選出重組成功的質粒，記為pET-Sn ； (5)將上步重組成功的質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，并采用IPTG進行誘導表達，使感受態(tài)細胞表達出抗菌肽，記為抗菌肽Sn，同時分泌出蛋白質； (6)對(5)步分泌出蛋白的感受態(tài)細胞進行超聲波破碎，離心后收集上清液中的抗菌肽。
3.根據權利要求2所述 制備抗菌肽的方法，其特征在于，所述步驟(2)的具體操作方法為:①根據已經發(fā)表的馬鈴薯及擬南芥中的snakin家族基因序列，經過生物信息學軟件分析出共同的保守區(qū)域，設計出上游引物序列為Y ATT CAA ACT GAT CAT GTT GC31、下游引物序列為 5' TTA AGG GCA TTT GCG TCT3/ ； ②以第一鏈cDNA為模板，經過PCR技術克隆得到抗菌肽Snakin中無信號肽的基因編碼序列，PCR技術所使用的試劑盒，其成份包括:
4.根據權利要求2所述制備抗菌肽的方法，其特征在于，所述步驟(3)得到重組質粒的具體操作方法為，①提取原核表達載體pET-28a(+)的質粒，并采用Eag I和BamHI對質粒進行雙酶切處理，同時將抗菌肽Snakin中的Sn基因序列采用相同的酶酶切下來，在37°C酶切4小時，然后通過瓊脂糖凝膠電泳將切下的質粒與Sn基因序列條帶切膠回收，酶切質粒的試劑包括:
5.根據權利要求2所述制備抗菌肽的方法，其特征在于，所述步驟(4)篩選出重組成功質粒pET-Sn的具體操作方法為，①將重組質粒10 μ I加入到IOOul的DH5 α細菌感受態(tài)細胞中，放入42°C水浴中熱激90s，快速放入冰水中2min，加入不含卡納的LB培養(yǎng)基中復蘇370C 2小時，再將DH5 α細菌感受態(tài)細胞涂于卡納抗性平板上，37°C過夜培養(yǎng)； ②在過夜培養(yǎng)的平板上挑取菌落，進行搖菌擴繁，提取細菌細胞中的質粒，如果質粒重組成功，即質粒中含有Sn基因，則采用如下PCR擴增體系能夠將質粒中的Sn基因擴增出來，并且采用Eag I和BamHI能夠酶切質粒pET_Sn ;PCR擴增體系中的上游引物和下游引物是所述步驟⑵中的上游引物和下游引物，PCR擴增體系包括如下成份:質粒I μ?IOxPCR Buffer2 μ?IOmM 的 dNTPs0.5 μ?IOmM的上游引物0.8 μ? IOmM的下游引物0.8 μ? .5 U/μΙ 的 Taq polymerase0.4 μ? 超純水14.5 μ I
PCR擴增反應程序為，94°C預變性5min ;94°C變形40sec ;63°C退火30sec ;72°C延伸Imin ；35 次循環(huán)，72°C延伸 IOmin ； 酶切pET-Sn質粒的試劑包括:pBT-Sn 質粒IO -2 OugIOx Buffer 10 μ?BamHI 4 μ?Eag I 4 μ?超純水填至ΙΟΟμΙ
6.根據權利要求2所述制備抗菌肽的方法，其特征在于，所述步驟(5)的具體操作方法為，①將重組成功的質粒Pet-Sn、空載體pET-28a(+)轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，涂于含有50ug/ml卡納的卡納抗性平板上； ②上步平板經37°C培養(yǎng)過夜后，將單菌落接種到5ml、含有50ug/ml卡納的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜； ③再將②步的菌液按質量配比1: 100接種到新鮮的含有50ug/ml卡納的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600為0.6-0.8時，加入IPTG至培養(yǎng)基的終濃度為0.8mmol/L，此時加入的IPTG開始對Sn基因序列進行誘導表達，誘導6h時后，大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞表達出抗菌肽，記為抗菌肽Sn，分泌出蛋白。
7.根據權利要求2所述抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述步驟(6)中超聲波破碎和離心的方法為；①超聲破碎:在300W條件下，超聲破碎3s間歇3s，共超聲破碎30min ;②離心:離心速度為1500rpm,離心的時間為20min。
8.權利要求1所述的抗菌肽的應用，其特征在于，該抗菌肽作為滅殺南方根結線蟲的殺蟲液。
【文檔編號】A01P5/00GK103436538SQ201310386556
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月30日 優(yōu)先權日:2013年8月30日
【發(fā)明者】茆振川, 張文玥, 凌鍵, 陳國華, 楊宇紅, 謝丙炎 申請人:中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所