煙草中一個(gè)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及煙草中一個(gè)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。該轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的堿基序列如序列表SEQ ID NO:1所示，該轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。該轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白在鉀營(yíng)養(yǎng)缺陷酵母R5421中表達(dá)后，能夠恢復(fù)該酵母在低鉀培養(yǎng)基上生長(zhǎng)功能，說(shuō)明該鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體具有高效轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子的功能。
【專(zhuān)利說(shuō)明】煙草中一個(gè)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因及其編碼蛋白與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及煙草中一個(gè)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，以及該基因在培育鉀高效植物新品種中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]在植物所需的三大營(yíng)養(yǎng)元素中，鉀直接參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，能量代謝和各種生理功能。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，耕地中土壤缺鉀是一個(gè)非常嚴(yán)重問(wèn)題，因此克隆耐低鉀和鉀營(yíng)養(yǎng)高效的基因，并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育鉀高效的植物新品種是解決這一問(wèn)題的重要途徑之一。
[0003]煙草是典型喜鉀作物，鉀能促進(jìn)煙草光合作用和呼吸效率，還能提高煙草的根系活力與養(yǎng)分吸收、運(yùn)輸效率和抗逆性等。國(guó)外優(yōu)質(zhì)煙葉的鉀含量一般都高于2.5%，而我國(guó)煙葉鉀含量一般低于2%，因此，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)煙葉必須大量補(bǔ)充鉀肥。
[0004]到目前為止，已克隆的植物K+轉(zhuǎn)運(yùn)體基因有兩大類(lèi)，一類(lèi)是K+離子通道基因，另一類(lèi)是高親和K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體基因。高親和K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體基因也可分為兩個(gè)家族，其一是KUP/HAK/KT家族，另一個(gè)是HKT家族。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的AKTl (Sentenac H，et al, 1992)和KATl (Anderson JA, et al, 1992)是植物中最先發(fā)現(xiàn)的K+轉(zhuǎn)運(yùn)體，這兩個(gè)基因都是利用酵母鉀營(yíng)養(yǎng)缺陷體的功能互補(bǔ)法而克隆得到的。
[0005]


【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明提供一個(gè)煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因序列，以及該基因編碼的蛋白能夠互補(bǔ)酵母鉀營(yíng)養(yǎng)缺陷的功能。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體的堿基序列，它的堿基序列為序列表SEQ ID NO:1。
[0007]本發(fā)明第二方面提供了該基因編碼蛋白序列，它的氨基酸序列為序列表SEQ IDN0:2。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了包含上述多核苷酸序列的表達(dá)載體，其中優(yōu)選的表達(dá)載體是P416GPD。
[0009]本發(fā)明通過(guò)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白在鉀營(yíng)養(yǎng)缺陷酵母R5421中表達(dá)后，能夠恢復(fù)該酵母在低鉀培養(yǎng)基上生長(zhǎng)功能。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體克隆的PCR電泳結(jié)果。
[0011]圖2煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體功能鑒定
左圖顯示陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和含有鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體酵母在正常培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況，右圖顯示陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和含有鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體酵母在低鉀培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況。

【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0013]煙草葉片RNA提取和RT-PCR
先用試劑盒(購(gòu)置Takara公司，日本)提取煙草品種K326葉片總RNA，具體過(guò)程參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自Τ0Υ0Β0公司，日本)將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體過(guò)程參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。
[0014]本發(fā)明基因的克隆與序列分析:本發(fā)明基因是根據(jù)電子克隆的方法，利用PrimerPremier 5.0設(shè)計(jì)引物，從煙草品種K326中克隆該基因。通過(guò)PCR方法獲得該基因的編碼序列，所使用的正向引物序列為(5 ' ATGGGAATAGATGAAGGA3 )，反向引物序列為(5' TTATACATAGAAAATTTGTCC3' )。PCR 反應(yīng)體系包括 10XPCR buffer 2.5 μ?，兩個(gè)引物(10 禮)各0.5 μ?, dNTPMixture (2.5 mM each) 2.0 μ?, cDNA 1.Ομ?, TaKaRa Ex Taq0.5 μ1，(ΜΗ20 16 μ? ACR反應(yīng)程序?yàn)?94°C變性 5 min，94°C30 s,58°C 30 s，72°C 3 min,共計(jì)30 cycles, 72°C延伸10 min, 4°C保溫,然后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)該基因的長(zhǎng)度。
[0015]鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體克隆載體構(gòu)建:PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為單一條帶后，用凝膠回收試劑盒(天根公司，中國(guó))回收目標(biāo)條帶，具體過(guò)程參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。然后克隆至PMD19-T載體(購(gòu)置Takara公司，日本)，取5 μ L連接產(chǎn)物采用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，采用PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性克隆，然后選取3個(gè)陽(yáng)性克隆送到華大基因技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，克隆基因的全長(zhǎng)為2367bp，編碼789氨基酸。
[0016]鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞:在擴(kuò)增目的基因的引物兩側(cè)分別加上BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)，隨后用BamH I和Xho I雙酶切把目的基因從pMD19_T載體切割下來(lái)，凝膠電泳后利用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，同時(shí)對(duì)P416GH)載體進(jìn)行BamH I和Xho I雙酶切和回收，然后將目的基因片段與P416GPD載體大片段以3:1的比例混合，加入T4連接酶(購(gòu)自Takara公司，日本)1U，1X反應(yīng)緩沖液，無(wú)菌水補(bǔ)充至1(^1^體系，16°〇連接16小時(shí)，然后把全部連接產(chǎn)物進(jìn)行熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，采用PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性克隆，然后選取5個(gè)陽(yáng)性克隆搖菌提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。對(duì)獲得的重組質(zhì)粒利用PEG方法轉(zhuǎn)化酵母R5421，用營(yíng)養(yǎng)缺陷型固體平板篩選轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌落，采用PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性克隆。
[0017]鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體功能鑒定
對(duì)于獲得含有重組質(zhì)粒的酵母R5421進(jìn)行低鉀培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng)，同時(shí)用擬南芥中的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體AKTl作為陽(yáng)性對(duì)照，用未轉(zhuǎn)化外源質(zhì)粒的酵母R5421作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明陽(yáng)性對(duì)照、含有重組質(zhì)粒的酵母R5421和陰性對(duì)照能夠在正常培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基的配方是在 100 mL 培養(yǎng)基中加入 W/0 0.67 g, -Trp-Leu-His-Ura 0.064 g, KCl
0.74 g，瓊脂1.5 g，葡萄糖2 g，混勻后調(diào)pH值至5.8，117°C高壓滅菌17 min。待冷卻到40-50°C加入已滅菌的50 XLeu 2 mL，50 X His 2 mL，50 XTrp 2 mL。同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)化有鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體的酵母R5421能夠在低鉀培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)化外源質(zhì)粒的酵母R5421不能生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基的配方是上述培養(yǎng)基的配方中去掉KC1。說(shuō)明本發(fā)明克隆的煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體具有高效轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子的功能。
【權(quán)利要求】
1.煙草一個(gè)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體，其堿基序列如SEQID NO:1。
2.權(quán)利要求1所述的煙草一個(gè)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQIDN0:2。
3.權(quán)利要求1所述的煙草一個(gè)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因在鉀高效轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104419709SQ201310396633
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】魯黎明, 李立芹, 魯琳, 王西瑤, 劉雷, 曾淑華, 葉科媛 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)